降低抗人白介素-33单克隆抗体生产中宿主细胞蛋白含量的亲和纯化方法与流程

1.本技术涉及生物技术领域。具体地，本技术涉及一种降低抗人白介素-33(il-33)单克隆抗体生产中宿主细胞蛋白含量的亲和纯化方法。


背景技术：

2.抗体药物生产过程中亲和纯化是非常关键的一个工艺步骤，该过程对发酵液中的抗体进行捕获浓缩，实现抗体粗纯化的第一步。在中国仓鼠卵巢细胞(cho)等基因工程细胞株大批量发酵过程中，细胞在不同的生理周期会有凋亡裂解，释放宿主细胞蛋白(host cell protein，hcp)。hcp是指来源于宿主细胞的蛋白成分，包括宿主细胞结构蛋白和转化蛋白(细胞分泌的促生长蛋白)。hcp不仅有可能诱导机体产生抗hcp抗体，引起过敏反应，还有可能有“佐剂效应”引起机体对蛋白质药物产生抗体，影响药物治疗效果，定量测定基因工程药物中残留的hcp是质量控制的一种重要手段，有助于保持纯化工艺的有效性和一致性。在抗体亲和纯化中，保证高效率的抗体回收率的同时，要对发酵过程中工程细胞所产生的hcp进行有效去除。因此，研究出一种能广泛应用于抗体大规模发酵后较为经济可行的抗体亲和纯化工艺，对于抗体药物的进一步产业化推广是极其有意义的，本发明涉及即是此方面内容。
3.目前能够进行hcp残留去除的方法较多，各有特点：1)层析方式：包括protein a亲和层析，阴、阳离子层析，三种层析工艺中对hcp的去除能力，protein a亲和层析为基础，去除能力较强，是hcp去除的主要步骤，阴、阳离子层析则主要作为后续hcp的进一步再去除工艺。层析方式去除hcp的工艺在不断完善过程中，各种层析工艺在不断的提出应用实际生产，是hcp去除的主要手段；2)切向流超滤方式：对于hcp的去除能力有限，且不易控制残留量，工艺控制系数不高，只能作为去除hcp的辅助工艺；3)聚合物沉淀方式：peg、聚丙烯酸等高聚合物在较广的ph范围内带正电荷，通过电荷作用同抗体结合形成沉淀，而hcp由于等电点较低，不易发生沉淀。沉淀抗体样品的hcp含量明显降低，但该工艺不适于工艺放大，且沉淀对抗体的活性可能有一定影响。因此，去除hcp的工艺方法众多，由于各项目的抗体的样品发酵工艺及抗体性质的不同，需进行综合考虑选择工艺。


技术实现要素：

4.为了解决抗体生产中宿主细胞蛋白(hcp)残留的问题，本技术公开了一种抗体纯化生产中有效降低cho宿主细胞蛋白的新方法，可以广泛适用于抗体亲和纯化工艺中，且所使用的材料成本价格较低，易于工艺放大。在本技术中，主要利用在亲和层析的预洗脱中降低hcp同抗体及填料基质间的作用，即通过活性试剂能够不同程度地减弱hcp同抗体蛋白及填料介质间的作用力，而起到去除hcp的作用，满足抗体药物的大规模高质量纯化制备要求，保证抗体药物的临床使用的安全。
5.本技术的具体技术方案如下：
6.本技术提供一种降低抗人白介素-33单克隆抗体生产中宿主细胞蛋白含量的亲和纯化方法，其包括下述步骤：
7.上样前平衡：使用缓冲液一平衡亲和层析介质，从而得到平衡好的亲和层析介质；
8.上样：将抗人白介素-33单克隆抗体发酵液与所述平衡好的亲和层析介质结合，进行上样；
9.洗脱：随后，先后进行预洗脱和终洗脱，从而去除宿主细胞蛋白，得到纯化的抗人白介素-33单克隆抗体；
10.所述抗人白介素-33单克隆抗体包含三个重链互补决定区和三个轻链互补决定区，所述三个重链互补决定区为cdr-h1、cdr-h2和cdr-h3，所述三个轻链互补决定区为cdr-l1、cdr-l2和cdr-l3，其中：
11.cdr-h1的氨基酸序列如seq id no：1所示；
12.cdr-h2的氨基酸序列如seq id no：2所示；
13.cdr-h3的氨基酸序列如seq id no：3所示；
14.cdr-l1的氨基酸序列如seq id no：4所示；
15.cdr-l2的氨基酸序列如seq id no：5所示；
16.cdr-l3的氨基酸序列如seq id no：6所示。
17.优选地，所述抗人白介素-33单克隆抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中，
18.所述重链可变区的氨基酸序列如seq id no：7所示；
19.所述轻链可变区的氨基酸序列如seq id no：8所示。
20.优选地，所述亲和层析介质选自配基交联到琼脂糖、聚乙烯醚、羟基化聚醚树脂、聚丙烯酸树脂、聚苯乙烯二乙烯苯基树脂、聚甲基丙烯酸树脂、聚苯乙烯树脂、羟基磷灰石、玻璃基质上的层析介质中的一种，优选为配基交联到聚乙烯醚的层析介质；
21.优选地，所述配基为protein a、protein g或protein l，进一步优选为protein a。
22.优选地，所述缓冲液一选自磷酸盐缓冲液、tris-hcl缓冲液和硼酸-硼砂缓冲液中的一种；所述缓冲液一中，盐浓度为5mm～0.25m，ph为5.5～8.0。
23.优选地，采用预洗脱缓冲液进行预洗脱，所述预洗脱缓冲液为中性缓冲液和/或酸性缓冲液；
24.优选地，所述中性缓冲液选自磷酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液和甘氨酸缓冲液中的一种；
25.优选地，所述酸性缓冲液选自柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液、醋酸-醋酸钠缓冲液和柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液中的一种；
26.优选地，所述预洗脱缓冲液的ph为5.0～7.5，进一步优选为5.5～6.5。
27.优选地，采用预洗脱缓冲液进行预洗脱时，还向所述预洗脱缓冲液中加入预洗脱活性剂；
28.优选地，所述预洗脱活性剂选自盐酸胍、聚山梨酯80和氯化钠中的一种或两种以上；
29.优选地，所述预洗脱活性剂为盐酸胍；
30.进一步优选地，所述盐酸胍的浓度为0.01～1m。
31.优选地，采用终洗脱缓冲液进行终洗脱；
32.所述终洗脱缓冲液选自柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液、醋酸缓冲液、甘氨酸-hcl缓冲液和柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中的一种或两种或三种以上，优选为柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液；
33.优选地，所述柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液的ph为2.9～3.8。
34.优选地，在抗人白介素-33单克隆抗体发酵液与所述平衡好的亲和层析介质结合时，使用缓冲液一进行平衡。
35.优选地，洗脱步骤中，在预洗脱后，在终洗脱前，还包括使用缓冲液二平衡预洗脱后的溶液。
36.优选地，所述缓冲液二选自磷酸盐缓冲液、tris-hcl缓冲液和硼酸-硼砂缓冲液中的一种；
37.优选地，所述缓冲液二为磷酸盐缓冲液或tris-hcl缓冲液；
38.优选地，所述缓冲液二的ph为5.5～8.0。
39.发明的效果
40.本技术的亲和纯化工艺简单易行，能够进行放大纯化生产，细胞发酵上清液无需进行前预处理，洗脱样品得率较高，同时hcp残留量也保持在较低水平(残留控制量不高于0.1％)，从而减轻之后纯化步骤中去除hcp的压力，从而保证人白介素-33(il-33)单克隆抗体最终样品的hcp残留量处于极低水平。同时，在本技术中，经过对不同批次发酵上清液进行亲和纯化工艺验证，证明本技术中的亲和纯化工艺具有良好的稳定性。
41.本技术的抗人白介素-33(il-33)单克隆抗体，其与现有的抗人白介素-33(il-33)单克隆抗体(etokimab/anb020)相比，结合人白介素-33的亲和力相当，在细胞水平的中和活性与etokimab/anb020相当。
42.赛诺菲公司研发的靶向白介素-33的单克隆抗体药物(itepekimab/regn3500)拟用于慢性阻塞性肺病(临床iii期)、哮喘(临床ii期)等炎性疾病的治疗，anaptysbio公司研发的etokimab/anb020用于慢性鼻窦炎(临床ii期)。
43.本技术的单克隆抗体在细胞水平显示出与etokimab/anb020(根据专利公开序列表达制备)相当的中和活性，其有望在预防和治疗相关疾病方面展现出良好的临床效果。
附图说明
44.图1是显示构建qx007n(hzd78-70)瞬转表达质粒的核酸电泳结果的图。
45.其中，m：marker；条带1：pcr产物78vh-hu25；条带2：pqx2.1，hindiii/nhei；条带3：pcr产物78vk-hu3-ck；条带4：pqx1，hindiii/bamhi。
46.图2是瞬转表达流程图。
47.图3是qx007n(hzd78-70)的电泳检测图。
48.图4是显示qx007n(hzd78-70)和etokimab/anb020中和重组人白介素-33诱导hek blue
tm il-33细胞中nf-κb/ap-1信号转导的活性图。
49.图5是显示qx007n(hzd78-70)和etokimab/anb020中和天然人白介素-33诱导hek blue
tm il-33细胞中nf-κb/ap-1信号转导的活性图。
50.图6是显示qx007n(hzd78-70)和etokimab/anb020中和重组人白介素-33诱导
ku812细胞释放il-5的活性图。
51.图7是显示qx007n(hzd78-70)和etokimab/anb020中和重组人白介素-33诱导人全血释放ifn-γ的活性图。
具体实施方式
52.以下对本技术的示范性实施例做出说明，其中包括本技术实施例的各种细节以助于理解，应当将它们认为仅仅是示范性的。因此，本领域普通技术人员应当认识到，可以对这里描述的实施例做出各种改变和修改，而不会背离本技术的范围和精神。同样，为了清楚和简明，以下的描述中省略了对公知功能和结构的描述。
53.本技术提供一种降低抗人白介素-33单克隆抗体生产中宿主细胞蛋白含量的亲和纯化方法，其包括下述步骤：
54.上样前平衡：使用缓冲液一平衡亲和层析介质，从而得到平衡好的亲和层析介质；
55.上样：将抗人白介素-33单克隆抗体发酵液与所述平衡好的亲和层析介质结合，进行上样；
56.洗脱：随后，先后进行预洗脱和终洗脱，从而去除宿主细胞蛋白，得到纯化的抗人白介素-33单克隆抗体；
57.所述抗人白介素-33单克隆抗体包含三个重链互补决定区和三个轻链互补决定区，所述三个重链互补决定区为cdr-h1、cdr-h2和cdr-h3，所述三个轻链互补决定区为cdr-l1、cdr-l2和cdr-l3，其中：
58.cdr-h1具有如seq id no：1(syhmi)所示的氨基酸序列；
59.cdr-h2具有如seq id no：2(viypnsniyyatwakg)所示的氨基酸序列；
60.cdr-h3具有如seq id no：3(tiyvhvysalsi)所示的氨基酸序列；
61.cdr-l1具有如seq id no：4(qasesvlnevs)所示的氨基酸序列；
62.cdr-l2具有如seq id no：5(fasklas)所示的氨基酸序列；
63.cdr-l3具有如seq id no：6(qqdwsmdnidna)所示的氨基酸序列。
64.在本技术中，cdr-h1、cdr-h2、cdr-h3、cdr-l1、cdr-l2、cdr-l3分别表示重链cdr1、重链cdr2、重链cdr3、轻链cdr1、轻链cdr2、轻链cdr3。
65.在本技术中，“单克隆抗体”表示得自基本上同源的抗体的群体的抗体，即，构成所述群体的各个抗体是相同的和/或结合相同表位，除了可能的变体抗体(例如，含有天然存在的突变或在单克隆抗体制品的生产过程中产生)以外，这样的变体通常以微量存在。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制品不同，单克隆抗体制品的每种单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。因而，修饰语“单克隆”指示所述抗体得自基本上同源的抗体群体的特征，并且不应解释为需要通过任何特定方法生产所述抗体。例如，要根据本发明使用的单克隆抗体可以通过多种技术来制备，所述技术包括、但不限于杂交瘤方法、重组dna方法、噬菌体展示方法、和使用包含人免疫球蛋白基因座的全部或部分的转基因动物的方法，本文描述了这样的方法和其它示例性的制备单克隆抗体的方法。
66.在本技术中，“单克隆抗体”一般为人抗体，其可以使用本领域技术人员公知的技术来制备，例如，人抗体一般描述于van dijk,m.a.and van de winkel,j.g.,curr.opin.pharmacol.5:368-374(2001)及lonberg,n.,curr.opin.immunol.20:450-459
(2008)。
67.可以通过向已经经过修饰而对抗原攻击刺激生产完整人抗体或具有人类可变区的完整抗体的转基因动物施用免疫原来制备抗体，这些动物通常含有一部分或全部的人类免疫球蛋白基因座，其替换了内源免疫球蛋白基因座，或者存在于染色体外或随机整合于动物体内。在此类转基因小鼠中，内源免疫球蛋白基因座一般已经失活，关于自转基因动物获得人抗体的方法的综述，参见lonberg,n.,nat.biotech.(自然生物技术)23:1117-1125(2005)。还可参见例如美国专利no.6,075,181和no.6,150,584描述的xenomouse
tm
技术；美国专利no.5,770,429描述的技术；美国专利no.7,041,870描述的技术，和美国专利申请公开文本no.us 2007/0061900描述的技术。可以例如通过与不同人恒定区组合进一步修饰来自由此类动物生成的完整抗体的人可变区。
68.还可以通过基于杂交瘤的方法来制备人抗体。已描述了用于生产人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人杂交骨髓瘤细胞(参见例如kozbor,d.,j.immunol.133:3001-3005(1984)；brodeur,b.r.et al.,monoclonal antibody production techniques and applications,marcel dekker,inc.,new york(1987),pp.51-63；及boerner,p.et al.,j.immunol.147:86-95(1991))。经由人b细胞杂交瘤技术生产的人抗体也记载于li,j.etal.,proc.natl.acad.sci.usa103:3557-3562(2006)。其他方法包括那些记载于例如美国专利no.7,189,826(其描述了自杂交瘤细胞系生成单克隆人igm抗体)以及ni,xiandai mianyixue,26(4)；265-268(其描述了人-人杂交瘤)的。人杂交瘤技术(trioma技术)也记载于vollmers,h.p.and brandlein,s.,histology and histopathology 20:927-937(2005)及vollmers,h.p.and brandlein,s.,methods and findings in experimentaland clinical pharmacology 27:185-191(2005)。
69.还可通过分离选自来源于人的噬菌体展示文库的fv克隆可变结构域序列来生成人抗体，然后，可以将此类可变域序列与期望的人恒定域组合。
70.还可以基于自抗体文库选择人抗体，即可以通过对组合文库筛选具有期望的一种或多种活性的抗体来分离人抗体。例如，用于生产噬菌体展示文库及对此类文库筛选拥有期望结合特征的抗体的多种方法是本领域已知的。这种方法综述于例如hoogenboom,h.r.et al.,methods in molecular biology 178:1-37(2001)，并且进一步记载于例如mccafferty,j.et al.,nature 348:552-554(1990)；clackson,t.et al.,nature 352:624-628(1991)；marks,j.d.et al.,j.mol.biol.222:581-597(1992)；marks,j.d.and bradbury,a.,methods in molecular biology 248:161-175(2003)；sidhu,s.s.et al.,j.mol.biol.338:299-310(2004)；lee,c.v.et al.,j.mol.biol.340:1073-1093(2004)；fellouse,f.a.,proc.natl.acad.sci.usa 101:12467-12472(2004)；及lee,c.v.et al.,j.immunol.methods 284:119-132(2004)。
71.在某些噬菌体展示方法中，通过聚合酶链反应(pcr)分别克隆vh和vl基因的全集，并在噬菌体文库中随机重组，然后在所述噬菌体文库中筛选抗原结合性噬菌体，如记载于winter,g.et al.,ann.rev.immunol.12:433-455(1994)。噬菌体通常以单链fv(scfv)片段或以fab片段展示抗体片段。来自经免疫来源的文库提供针对免疫原的高亲和力抗体，而不
需要构建杂交瘤。或者，可以(例如自人)克隆未免疫全集以在没有任何免疫的情况中提供针对一大批非自身和还有自身抗原的抗体的单一来源，如由griffiths,a.d.et al.,embo j,12:725-734(1993)描述的。最后，也可以通过从干细胞克隆未重排的v基因区段，并使用含有随机序列的pcr引物编码高度可变的cdr3区并在体外实现重排来合成生成未免疫文库，如由hoogenboom,h.r.and winter,g.,j.mol.biol.227:381-388(1992)所描述的。描述人抗体噬菌体文库的专利公开文本包括例如：美国专利no.5,750,373及美国专利公开文本no.2005/0079574、2005/0119455、2005/0266000、2007/0117126、2007/0160598、2007/0237764、2007/0292936和2009/0002360。
72.所述抗体也可以是多特异性抗体，例如双特异性抗体。双特异性抗体是对至少两种不同位点具有结合特异性的单克隆抗体。用于生成多特异性抗体的技术包括但不限于具有不同特异性的两对免疫球蛋白重链-轻链的重组共表达(参见milstein,c.and cuello,a.c.,nature305:537-540(1983)；wo 93/08829；及traunecker,a.et al.,embo j.10:3655-3659(1991))、和“节-入-穴”工程化(参见例如美国专利no.5,731,168)。也可以通过用于生成抗体fc-异二聚体分子的工程化静电操纵效应(wo 2009/089004)；交联两种或更多种抗体或片段(参见例如美国专利no.4,676,980及brennan,m.et al.,science 229:81-83(1985))；使用亮氨酸拉链来生成双特异性抗体(参见例如kostelny,s.a.et al.,j.immunol.148:1547-1553(1992))；使用用于生成双特异性抗体片段的“双抗体”技术(参见例如holliger,p.et al.,proc.natl.acad.sci.usa90:6444-6448(1993))；及使用单链fv(scfv)二聚体(参见例如gruber,m.et al.,j.immunol.152:5368-5374(1994))；及制备三特异性抗体(如例如tutt,a.et al.,j.immunol.147:60-69(1991)中所描述的)来生成多特异性抗体。
73.本文中所述的单克隆抗体还包括具有三个或更多个功能性抗原结合位点的工程化改造抗体，包括“章鱼抗体”(参见例如us 2006/0025576)。
74.本文中的抗体还包括wo 2009/080251、wo 2009/080252、wo2009/080253、wo 2009/080254、wo 2010/112193、wo 2010/115589、wo2010/136172、wo 2010/145792、及wo 2010/145793、wo 2011/117330、wo 2012/025525、wo 2012/025530、wo 2013/026835、wo2013/026831、wo 2013/164325、或wo 2013/174873中记载的多特异性抗体。
75.本文中所述的单克隆抗体也可以是抗体变体，例如，可能期望改善抗体的结合亲和力和/或其它生物学特性。可以通过将适宜的修饰引入编码抗体的核苷酸序列中，或者通过肽合成来制备抗体的氨基酸序列变体。此类修饰包括例如对抗体的氨基酸序列内的残基的删除、和/或插入和/或替代。可以进行删除、插入、和替代的任何组合以得到最终的构建体，只要最终的构建体拥有期望的特征，例如抗原结合。因此，在某些实施方案中，提供了具有一个或多个氨基酸置换的抗体变体，用于置换突变的感兴趣的位点包括hvr和fr，例如，可将氨基酸置换引入感兴趣的抗体中并筛选具有所需活性的产物，例如，保留/改善的抗原结合性，降低的免疫原性，或改善的adcc或cdc。
76.本技术中，所述单克隆抗体体外发酵生产使用的哺乳动物细胞包括但不限于目前通用的各种杂交瘤细胞、中国仓鼠卵巢细胞(cho)，优选的是cho细胞。
77.在本技术中，“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养”可互换使用，且表示其中已经引入外源核酸的细胞，包括这种细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化的细
胞”，其包括原代转化的细胞和由其来源的后代(不考虑传代数)。后代在核酸内容物方面可以与亲本细胞不完全相同，但是可以含有突变。针对最初转化的细胞筛选或选择的具有相同功能或生物活性的突变体后代被包括在本说明书中。
78.本技术中，“亲和力”表示分子(例如，抗体)的单个结合位点和它的结合配偶体(例如，抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另外指出，否则本说明书中使用的“结合亲和力”表示反映结合对(例如，抗体和抗原)的成员之间的1∶1相互作用的固有结合亲和力。分子x对它的配偶体y的亲和力通常可以由平衡解离常数(kd)表示。通过本领域已知的常见方法，可以测量亲和力。
79.本技术中，“超滤”是指切相流超滤(tangential flow filtration，tff)是指液体流动方向切向(平行)于滤膜表面的过滤形式，相比流动方向与滤膜垂直方向的传统过滤方式(nff)，切向流滤膜表面的颗粒堆积较少，过滤速度稳定，适用于大体积样品的分离。其中，大于膜孔径的分子被截留并逐步浓缩，小于膜孔径的物质透过膜，从大分子溶液中分离出来，实现大分子和小分子的分离。因而切向流超滤常用于生物制品的浓缩、透析、置换缓冲溶液、不同尺寸分子的分离等。
80.本技术中，人白介素-33表示位于细胞核内的人白介素-33经蛋白酶水解形成成熟的人白介素-33，分泌至细胞外，发挥人白介素-33的生物活性，其具有如seq id no：9所示的氨基酸序列。
81.seq id no：9：
82.sitgispiteylaslstyndqsitfaledesyeiyvedlkkdekkdkvllsyyesqhpsnesgdgvdgkmlmvtlsptkdfwlhannkehsvelhkcekplpdqaffvlhnmhsncvsfecktdpgvfigvkdnhlalikvdssenlctenilfklset
83.本技术中，“抗人白介素-33单克隆抗体”表示这样的单克隆抗体：其能够以足够的亲和力结合人白介素-33，使得所述单克隆抗体可用作靶向人白介素-33的诊断剂和/或治疗剂。
84.本技术中，抗人白介素-33单克隆抗体与靶标无关的蛋白不结合。这里，“无关的蛋白”是指除作为靶标的人白介素-33以外的其它蛋白；这里，“不结合”是指：在将本技术的抗人il-33单克隆抗体与作为其靶标的人白介素-33的结合能力作为100％的情况下，本技术的抗人il-33单克隆抗体与所述无关蛋白的结合能力小于10％，例如9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或者0。
85.本技术的抗人il-33单克隆抗体与人、食蟹猴的白介素-33可以结合，与其他动物种属的白介素-33可以不结合。这里，“其它动物种属”是指除人、食蟹猴以外的动物种属，例如猪、犬、兔、大鼠、小鼠、豚鼠等；这里，在判定本技术的抗人il-33单克隆抗体的种属特异性时，“不结合”是指：在将本技术的抗人il-33与作为其靶标的人白介素-33的结合能力作为100％的情况下，本技术的抗人il-33单克隆抗体与其它动物种属的白介素-33的结合能力小于5％，例如4％、3％、2％、1％或者0。
86.本技术的抗人il-33单克隆抗体具有≤1μm、≤100nm、≤50nm、≤40nm的平衡解离常数(kd)。
87.实验结果显示，本技术的抗人il-33单克隆抗体可以特异性结合人白介素-33。
88.本技术的抗人il-33单克隆抗体在诸多生物活性方面与上市同类单抗产品相当、
或优于上市同类单抗产品。所述生物活性例如中和重组/天然人白介素-33诱导细胞中nf-κb/ap-1信号转导的活性、中和白介素-33诱导ku812细胞释放il-5的活性、中和白介素-33诱导人全血释放ifn-γ等。
89.在一个具体实施方式中，本技术的抗人il-33单克隆抗体的重链的氨基酸序列如seq id no：10所示；轻链的氨基酸序列如seq id no：11所示。
90.seq id no：10：
91.evqlvesggglvqpggslrlscaasgfslssyhmiwvrqapgkglewvgviypnsniyyatwakgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycartiyvhvysalsiwgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk
92.seq id no：11：
93.afqmtqspssvsasvgdrvtitcqasesvlnevswyqqkpgkapklliyfasklasgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqqdwsmdnidnafgggtkveikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec
94.其中，seq id no：10和11均为经人源化的序列。
95.在一个具体实施方式中，所述抗人白介素-33单克隆抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中，
96.所述重链可变区具有如seq id no：7(evqlvesggglvqpggslrlscaasgfslssyhmiwvrqapgkglew vgviypnsniyyatwakgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyyca rtiyvhvysalsiwgqgtlvtvss)所示的氨基酸序列；
97.所述轻链可变区具有如seq id no：8(afqmtqspssvsasvgdrvtitcqasesvlnevswyqqkpgkapklli yfasklasgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqqdwsmdnid nafgggtkveik)所示的氨基酸序列。
98.在一个具体实施方式中，所述亲和层析介质选自配基交联到琼脂糖、聚乙烯醚、羟基化聚醚树脂、聚丙烯酸树脂、聚苯乙烯二乙烯苯基树脂、聚甲基丙烯酸树脂、聚苯乙烯树脂、羟基磷灰石、玻璃基质上的层析介质中的一种，优选为配基交联到聚乙烯醚的层析介质；
99.优选地，所述配基为protein a、protein g或protein l，进一步优选为protein a。
100.本技术的所述配基可与单克隆抗体特异性地结合。
101.在本技术中，对亲和填料没有限制，其可以根据本领域技术人员的需要进行确认，例如，亲和填料可以为ge healthcare的mabselect、mabselect sure，博格隆生物技术有限公司的protein a diamond、merck的a。
102.在一个具体实施方式中，缓冲液一包括但不限于磷酸盐缓冲液、tris-hcl缓冲液和硼酸-硼砂缓冲液中的一种。对于缓冲液一中的盐浓度，本技术不作任何限制，本领域技术人员可以根据需要进行选择，例如，在一个具体实施方式中，所述缓冲液一中的盐浓度为5mm～0.25m，例如可为5mm、10mm、20mm、50mm、0.1m、0.15m、0.2m、0.25m等；缓冲液一ph为5.5
～8.0，例如可为5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0等。
103.在一个具体实施方式中，所述缓冲液一为磷酸盐缓冲液或tris-盐酸缓冲液。
104.在一个优选的实施方式中，在所述缓冲液一中加入nacl或na2so4来降低非抗体蛋白同填料间的非特异性吸附。
105.在一个具体实施方式中，所述缓冲液一为磷酸盐缓冲液，在所述缓冲液一中加入nacl或na2so4来降低非抗体蛋白同填料间的非特异性吸附，所述磷酸盐缓冲液的盐浓度为5mm～0.15m之间，优选为10～50mm之间，更优选的是20mm。
106.对于所述缓冲液一的ph值，本技术不作任何限制，本领域技术人员可以根据需要进行选择，例如，在一个具体实施方式中，所述缓冲液一的ph为6.5～7.5，优选为6.9。
107.对于nacl或na2so4的加入量，其可以根据本领域技术人员的需要进行确定，对于nacl或na2so4的浓度，本领域技术人员可以根据需要进行选择，在一个具体实施方式中，nacl或na2so4的浓度可以为0～250mm，优选为150mm。
108.在一个具体实施方式中，所述磷酸盐缓冲液可以为磷酸氢二钠缓冲液和磷酸二氢钠缓冲液中的一种或两种。
109.在一个具体实施方式中，在抗人白介素-33单克隆抗体发酵液与所述平衡好的亲和层析介质结合时，使用缓冲液一进行平衡。
110.在一个具体实施方式中，采用预洗脱缓冲液进行预洗脱，所述预洗脱缓冲液为中性缓冲液和/或酸性缓冲液。
111.在一个具体实施方式中，所述中性缓冲液选自磷酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液和甘氨酸缓冲液中的一种，所述酸性缓冲液选自柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液、醋酸-醋酸钠缓冲液和柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液中的一种。
112.对于所述预洗脱缓冲液的ph值，本技术不作任何限制，本领域技术人员可以根据需要进行选择，例如，在一个具体实施方式中，所述预洗脱缓冲液的ph为5.0～7.5，例如可为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5等，进一步优选为5.5～6.5。
113.在一个具体实施方式中，采用预洗脱缓冲液进行预洗脱时，还向所述预洗脱缓冲液中加入预洗脱活性剂；所述预洗脱活性剂包括但不限于盐酸胍、聚山梨酯80和氯化钠中的一种或两种以上，优选地，所述预洗脱活性剂为盐酸胍。
114.对于盐酸胍的浓度，本技术不作任何限制，本领域技术人员可以根据需要进行选择，例如，在一个具体实施方式中，所述盐酸胍的浓度为0.01～1m，例如可为0.01m、0.05m、0.1m、0.15m、0.2m、0.3m、0.4m、0.5m、0.6m、0.7m、0.8m、0.9m、1m等，优选为0.05～0.15m，进一步优选为0.1m。
115.对于预洗脱缓冲液中的盐浓度，本技术不作任何限制，本领域技术人员可以根据需要进行选择，例如，在一个具体实施方式中，所述预洗脱缓冲液中的盐浓度为0～0.5m，优选为0.1m。
116.在一个具体实施方式中，采用终洗脱缓冲液进行终洗脱；所述终洗脱缓冲液包括但不限于柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液、醋酸缓冲液、甘氨酸-hcl缓冲液和柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中的一种或两种或三种以上，优选为柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液。
117.对于终洗脱缓冲液的ph，本技术不作任何限制，本领域技术人员可以根据需要进行选择，例如，在一个具体实施方式中，所述终洗脱缓冲液的ph为2.9～3.8，例如可为2.9、
33结合的克隆；再用hek blue
tm il-33报告基因细胞法进行检测，挑选出具有人白介素-33抑制活性的克隆。以上免疫和筛选过程委托给商业化公司完成。
133.先后挑选出12个克隆进行重组表达，并测序。经测定，78#的细胞中和活性最优，对78#进行人源化改造。利用ncbi igblast进行人igg胚系序列(germline)同源性比对，选择ighv3-66*01作为重链cdr移植模板，将78#克隆重链的cdr区(即cdr-h1(seq id no:1)、cdr-h2(seq id no:2)和cdr-h3(seq id no:3))移植入ighv3-66*01的骨架区；选择igkv1-12*01作为轻链cdr移植模板，将78#克隆轻链的cdr区(即cdr-l1(seq id no:4)、cdr-l2(seq id no:5)和cdr-l3(seq id no:6))移植入igkv1-12*01的骨架区；对骨架区特定位点进行回复突变，获得本技术的单克隆抗体qx007n可变区。最终，人源化后的重链可变区的氨基酸序列如seq id no：7所示；人源化后的轻链可变区的氨基酸序列如seq id no：8所示。
134.上述重链可变区(seq id no：7)的基因和轻链全长(seq id no：11)的基因，利用pcr扩增获得。用hindiii和nhei双酶切重链表达质粒pqx2.1；用hindiii和bamhi双酶切瞬转表达质粒pqx1；用infusion重组酶将pcr扩增基因分别插入对应的表达质粒中，构建重链表达质粒pqx2.1-78vh-hu25和轻链表达质粒pqx2.2-78vk-hu3。其中，pqx2.2是指表达轻链的pqx1质粒。
135.通过核酸电泳检测质粒的双酶切结果如图1所示。根据图1的结果可以看出，抗体重链可变区和轻链全长pcr扩增结果以及双酶切重链和轻链表达质粒的结果，其中，重链和轻链的质粒大小约5000bp，重链可变区约480bp，轻链全长约781bp。
136.将序列正确的重链表达质粒pqx2.1-78vh-hu25(其表达的重链全长的氨基酸序列如seq id no：10)和轻链表达质粒pqx2.2-78vk-hu3(其表达的轻链全长的氨基酸序列如seq id no：11)共转染expicho-s细胞。转染前一天，将expicho-s细胞稀释成3
×
106个细胞/ml进行转染前传代。转染当天，将细胞密度稀释成6
×
106个细胞/ml，125ml摇瓶装25ml细胞，等待转染。转染和表达过程如图2所示。
137.转染后第5天，收获培养上清，用protein a进行一步纯化。用sds-page电泳检测纯化的抗体，将其命名为qx007n(hzd78-70)，利用蛋白电泳检测该抗体的结果如图3所示。蛋白电泳用变性还原胶检测，图3的结果显示出有两条带，两个条带的大小分别约50kda和25kda，与重链(49.3kda)和轻链(23.4kda)理论分子量一致。
138.实施例2平衡解离常数(kd)的测定
139.用biacore t200检测qx007n(hzd78-70)与人白介素-33的亲和力，所有过程都在25℃进行。采用商品化protein a芯片，通过捕获法固定适量的抗体，使得rmax在50ru左右，捕获流速是10μl/min。将抗原进行梯度稀释，仪器流速切换成30μl/min，按照浓度从低到高的顺序依次流过参比通道和固定抗体的通道，流过缓冲液作为阴性对照。每一个结合、解离完成后用ph1.5甘氨酸再生芯片。用仪器自带分析软件选择kinetics选项中1:1结合模型进行拟合，计算抗体的结合速率常数ka，解离速率常数kd以及平衡解离常数kd值。
140.除此之外，将qx007n(hzd78-70)与anaptysbio公司研发的人白介素-33的单克隆抗体etokimab/anb020的亲和力进行比较，针对已知抗体的检测方法与对qx007n进行检测的方法相同，结果如表1所示。其中etokimab/anb020根据专利wo2015106080a2提供的ape4909序列，构建表达质粒，瞬转expicho-s细胞自制获得。
141.表1抗人白介素-33抗体结合人白介素-33的亲和力
142.样品名称ka(105m-1
s-1
)kd(10-4
s-1
)kd(10-10
m)qx007n3.924.8112.28anb 0204.243.698.69
143.此外，基于与前述相同的检测方法，我们还发现etokimab/anb020可结合食蟹猴、恒河猴的白介素-33，而qx007n(hzd78-70)可结合食蟹猴的白介素-33，但不结合恒河猴的白介素-33。
144.实施例3中和人白介素-33诱导的hek blue
tm il-33细胞nf-κb/ap-1信号转导的活性检测
145.hek blue
tm il-33细胞是通过用人il1rl1基因稳定转染人胚胎肾细胞hek 293而产生的，且tnf-α和il-1β的应答被阻断，因此hek-blue
tm il-33细胞对il-33有特异性反应。白介素-33与细胞表面il-1rl1/il-1racp结合触发信号级联反应，导致nf-κb/ap-1信号转导并产生分泌型碱性磷酸酶(secreted alkaline phosphatase，seap)，由此检测白介素-33的生物活性或进行抗体筛选。
146.利用hek blue
tm il-33细胞测定qx007n(hzd78-70)对人白细胞介素-33的中和活性。将hek blue
tm il-33细胞以每孔4
×
104个细胞铺种到96孔内，在37℃和5％co2条件下培养过夜。将抗体稀释至浓度范围为0到500ng/ml，稀释液与2ng/ml的重组人白介素-33混匀孵育1h，孵育完成后加入细胞中在37℃和5％co2条件下培养24小时，收集细胞培养上清，以1:10比例加入quanti-blue
tm
检测试剂(invivogen，rep-qbs2)中，并在37℃条件下反应1小时，使用varioskan lux多功能酶标仪检测od
630nm
值，采用softmaxpro软件使用四参数曲线拟合分析数据(图4)，进而分析抗体的拮抗活性。
147.图4的结果显示：qx007n(hzd78-70)能够抑制重组人白介素-33诱导hek blue
tm il-33细胞中nf-κb/ap-1信号转导，其ic
50
为6.67ng/ml；与此相对，对于etokimab/anb020，采用相同方法测得ic
50
为6.05ng/ml。
148.实施例4中和天然人白介素-33诱导的hek blue
tm il-33细胞nf-κb/ap-1信号转导的活性检测
149.制备天然人白介素-33，并验证qx007n(hzd78-70)对天然人白介素-33的中和活性。培养hfl-1细胞，并用200ng/ml tnf-α诱导培养24小时，收集细胞并利用反复冻融法裂解细胞，收集细胞裂解液上清，上清中含有人白介素-33，通过hek blue
tm il-33细胞验证活性。
150.将hek blue
tm il-33细胞以每孔4
×
104个细胞铺种到96孔内，在37℃和5％co2条件下培养过夜，抗体稀释至浓度范围为0到1000ng/ml后，添加稀释液与天然人白介素-33，混匀后加入细胞中在37℃和5％co2条件下培养24小时，收集细胞培养上清，以1:10比例加入quanti-blue
tm
检测试剂中，并在37℃条件下反应1小时，使用varioskan lux多功能酶标仪检测od
630nm
值，采用softmax pro软件使用4参数曲线拟合分析数据(图5)，进而分析抗体的中和活性。
151.图5的结果显示：qx007n(hzd78-70)能够抑制天然人白介素-33诱导hek blue
tm il-33细胞中nf-κb/ap-1信号转导，其ic
50
为3.91ng/ml；与此相对，对于etokimab/anb020，采用相同方法测得ic
50
为2.5ng/ml。
152.实施例5中和人白介素-33诱导的ku812(人外周血嗜碱性白血病细胞)释放il-5的
活性检测
153.以人白介素-33诱导ku812(人外周血嗜碱性白血病细胞)释放il-5作为指标，评价qx007n(hzd78-70)中和人白介素-33的活性。于96孔板中接种ku812细胞(2
×
105个细胞/孔)，继而添加抗体和重组人白介素-33(终浓度4ng/ml)在37℃和5％co2条件下培养24小时，收集细胞培养上清采用human il-5duoset elisa(r&d，dy205)检测上清中il-5的表达量，使用varioskan lux多功能酶标仪检测od
450nm
值，采用softmax pro软件使用4参数曲线拟合分析数据(图6)，进而分析抗体的中和活性。
154.图6的结果显示：qx007n(hzd78-70)能够中和人白介素-33诱导的ku812(人外周血嗜碱性白血病细胞)释放il-5的活性，其ic
50
为5.87ng/ml；与此相对，对于etokimab/anb020，采用相同方法测得ic
50
为44ng/ml。
155.实施例6中和人白介素-33诱导人全血释放ifn-γ的活性检测
156.以人全血中的单核细胞作为测定基础，ifn-γ作为测定指标，进一步表征qx007n(hzd78-70)的中和活性。使用来自健康志愿者的全血铺板(100μl/孔)，继而添加抗体和重组人白介素-33(终浓度4ng/ml)在37℃和5％co2条件下培养24小时，使用varioskan lux多功能酶标仪检测od
450nm
值，采用softmax pro软件使用4参数曲线拟合分析数据(图7)，进而分析抗体的中和活性。
157.图7的结果显示：qx007n(hzd78-70)能够中和人白介素-33诱导人全血释放ifn-γ的活性，其ic50为16ng/ml；与此相对，对于etokimab/anb020，采用相同方法测得ic
50
为31.9ng/ml。
158.实施例7不同缓冲液一对于重组人源化抗人白介素-33单克隆抗体(qx007n)发酵液的hcp的清除效果比较
159.制备抗人白介素-33单克隆抗体的发酵液：
160.使用cho细胞作为宿主细胞，eden-b600作为发酵基础培养基，生产实施例1所得到的抗体qx007n。使用常规的细胞培养工艺进行细胞培养，当细胞活率低于80％或培养至18天时开始收获，采用初级滤器md0hc10fs1和次级滤器mx0hc10fs1对收获液进行深层过滤，收集澄清的细胞培养上清，从而获得抗人白介素-33单克隆抗体的发酵液(简称发酵液中间体)。
161.使用缓冲液一平衡亲和层析介质，从而得到平衡好的亲和层析介质；然后将抗人白介素-33单克隆抗体发酵液与所述平衡好的亲和层析介质结合，具体如下：
162.采用缓冲液一(12mmol/l na2hpo4，8mmol/l nah2po4，0.15mol/l nacl)平衡protein a层析柱(at protein a diamond plus，0.15l)，并将qx007n发酵液中间体上样于平衡后的protein a层析柱，以与其结合，上样载量设定55mg/ml，然后再使用缓冲液一进行平衡，至发酵液完全流过层析柱；
163.然后进行预洗脱，所述预洗脱采用的预洗脱缓冲液的组成如表2所示，随后使用缓冲液二(6mmol/l na2hpo4、4mmol/l nah2po4，ph 7.2)进行平衡；
164.接着进行终洗脱来收集样品，并对收集的样品进行抗体浓度和宿主蛋白(hcp)残留含量进行测定，其中，所述终洗脱采用的终洗脱缓冲液为7mmol/l na2hpo4，15mmol/l枸橼酸，ph为3.1。并采用再生缓冲液(100mmol/l naoh，1mol/l nacl)对层析柱进行再生。收集洗脱样品进行抗体浓度及hcp残留含量测定。
165.表2预洗脱缓冲液组成
[0166][0167]
抗体浓度的测定方法如下：
[0168]
1.分光光度计波长调至280nm，用终洗脱缓冲液作为对照，进行校零。
[0169]
2.用终洗脱缓冲液对待测样品进行稀释，测定样品在280nm的吸光值(吸光值保证在0.5～1.5之间)，并按照之下公式计算样品浓度(qx007n消光系数为1.513)。
[0170][0171]
所得到的结果如表3所示。
[0172]
hcp含量的测定方法：
[0173]
1.样品稀释：一般根据样品中hcp的估计值来进行稀释倍数选择，使最终hcp的浓度落在标准曲线范围内即可(一般10ng/ml～80ng/ml)。样品一步稀释倍数不超过10倍，最小取样量不低于5μl。
[0174]
2.向取出板条每孔加入anti-cho hrp 100μl。
[0175]
3.上样：按一定排列分别加入标准品、样品、加标样品(各两复孔，标准品不需复孔)，50μl/孔，封板。室温置于水平摇床，180rpm，2小时，避光。
[0176]
4.洗板：弃去孔内液体，用多通道移液器加洗液300μl/孔，静置30秒后甩尽液体，在吸水纸上拍干，洗板4次。最后一次洗板完成后，需尽量拍干孔内残留洗液。
[0177]
5.显色及终止读数：按100μl/孔加tmb试剂(tmb substrate)，静置显色30分钟，避光。30分钟后加终止液(stop solution)100μl/孔，酶标仪450nm读数，以650nm作为参考。
[0178]
6.选择分析软件进行数据分析，以标准品od值为纵坐标，浓度为横坐标，作四参数标准曲线。将样品测得的od值代入标准品曲线，求得所加样品hcp的实测值。
[0179]
7.cho细胞蛋白残留量(％)＝样品平均实测值(ng/ml)
×
稀释倍数/未稀释样品蛋白含量(mg/ml)量求得-4
(％)，其结果如表3所示。
[0180]
表3qx007n亲和纯化收率及hcp残留量结果
[0181][0182]
由表3结果可知，发酵液中间体中hcp残留量大于25％，经过亲和纯化工艺的处理，收率均大于95％；对于hcp的去除，采用含盐酸胍实验组，亲和层析后样品hcp残留低于0.1％，后续纯化工艺步骤去除hcp负荷明显降低，且样品经ph调节，进行后续层析工艺步骤(阴离子交换层析)上样时，样品保持较为澄清，无需其他处理即可直接进样，增强了工艺的简便性，节省了工艺时间；而采用聚山梨酯80或nacl实验组，亲和层析后样品hcp残留仍大于0.1％，hcp残留去除效果差于盐酸胍。
[0183]
实施例8不同批次重组人源化抗il-33单克隆抗体(qx007n)发酵液的hcp的清除效
果比较
[0184]
发酵液中间体的制备及亲和层析方法同实施例7，共制备三个批次的发酵液中间体，预洗脱均采用含盐酸胍的预洗脱缓冲液：0.1mol/l枸橼酸钠，0.1mol/l盐酸胍，11mmol/l枸橼酸，ph5.8淋洗。亲和工艺收率及hcp残留含量测试方法如实施例7所述，其结果如表4所示。
[0185]
表4不同批次qx007n亲和纯化收率及hcp残留量结果
[0186][0187]
由表4结果所示，不同批次的qx007n发酵液中间体hcp残留均处于20％以上，细胞培养工艺稳定；三批样品的亲和工艺收率均大于95％，收率符合工艺要求；亲和层析后样品hcp残留均低于0.1％，采用盐酸胍进行与洗脱淋洗对于hcp的去除保持稳定。
[0188]
综上所述，本技术采用上述所述的亲和纯化方法，所得到的单克隆抗体中hcp的残留量保持在较低的水平，残留控制量不高于0.1％，从而减轻了之后纯化步骤中去除hcp的压力，并且本技术所述的亲和纯化工艺具有良好的稳定性。
[0189]
以上所述，仅是本技术的较佳实施例而已，并非是对本技术作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本技术技术方案内容，依据本技术的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本技术技术方案的保护范围。