多菌灵残留检测用荧光探针、方法、组合物及检测产品与流程

1.本发明是关于农药残留检测技术领域，特别是关于一种多菌灵残留检测用荧光探针、方法、组合物及检测产品。


背景技术：

2.多菌灵是一种常见的广谱内吸性杀菌剂，它可以保护蔬菜和水果免受各种真菌和害虫的侵害，经常被用于叶面喷洒、拌种和土壤处理。但是，多菌灵的广泛使用会带来一些弊端。由于多菌灵中苯并咪唑环的高稳定性，其残留物会长期存在于土壤和水体中，可以通过植物的种子、根和叶的吸收进入食物链。食物中残留的多菌灵会导致男性不育，影响脱氢酶和磷酸酶的活性，改变激素浓度，破坏内分泌系统，已被归类为潜在的人类致癌物。因此，灵敏、准确地检测各种食品中的多菌灵对于保护公众健康变得越来越重要。
3.公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种多菌灵残留检测用荧光探针、方法、组合物及检测产品，通过荧光强度与发射峰的变化定量检测多菌灵，具有快速简便，选择性高，抗干扰能力强，灵敏度高的优点，有着巨大的市场应用前景和良好的经济社会效益。
5.为实现上述目的，本发明的实施例提供了多菌灵残留检测用荧光探针，具有如下结构式：其中，c^n为二齿配体，solv为溶剂配体，l-为负一价阴离子；c^n配体为以下化学结构式中的一种：
6.这里的化学结构式是展示了c^n配体主体结构形态，而在实际方案中可以为展示的自身，也可以为离子形态，具体视化合物组成啮合确定，本领域技术人员是很容易依据事实判定的。
7.在本发明的一个或多个实施方式中，溶剂配体为水、乙腈、二甲基亚砜中的一种。
8.在本发明的一个或多个实施方式中，负一价阴离子为四氟硼酸离子、三氟甲烷磺酸离子、六氟磷酸离子中的一种。
9.在本发明的一个或多个实施方式中，荧光探针为如下任一：
[0010][0011]
在本发明的一个或多个实施方式中，多菌灵残留检测用荧光探针的制备方法，包括如下步骤：
[0012]
(1)将适量的三氯化铱和c^n二齿配体加入到溶剂中加热回流反应18-48h，放置降到室温，过滤并收集滤渣，得到二氯桥铱二聚体；
[0013]
(2)将步骤(1)所得的二氯桥铱二聚体在溶剂中加热回流反应6-24h后干燥干得到粗产品；
[0014]
(3)将(2)得到的粗产品经过纯化后得到荧光探针。
[0015]
在本发明的一个或多个实施方式中，多菌灵残留检测用荧光探针的制备方法，包括如下步骤：
[0016]
(1)将摩尔比1:2的三氯化铱和c^n二齿配体加入到乙二醇乙醚/水(体积比3:1)的混合溶剂中加热回流反应18-48h，放置降到室温，过滤并收集滤渣，得到二氯桥铱二聚体；
[0017]
(2)将步骤(1)所得的二氯桥铱二聚体在溶剂中加热回流反应6-24h后干燥干得到粗产品；
[0018]
(3)将(2)得到的粗产品经过纯化后得到荧光探针。
[0019]
在本发明的一个或多个实施方式中，多菌灵残留检测用荧光探针的制备方法，包括如下步骤：
[0020]
(1)将三氯化铱和c^n二齿配体加入到乙二醇乙醚/水(3:1)的混合溶剂中加热回流反应24h，反应结束后放置降到室温，反应液过滤并收集滤渣，得到二氯桥铱二聚体；
[0021]
(2)将步骤(1)所得的二氯桥铱二聚体在溶剂(dmso、mecn或h20/meoh)中加热回流反应12h后利用旋转蒸发仪旋干得到粗产品，
[0022]
(3)将(2)得到的粗产品经过柱层析纯化后得到荧光探针。
[0023]
在本发明的一个或多个实施方式中，含有如前述的多菌灵残留检测用荧光探针的
检测组合物，荧光探针组合物为荧光探针与水性溶剂配制形成的。优选的水性溶剂可以为以水为溶剂的缓冲液，包括而不限于pbs缓冲溶液包等，其可以含10mm na2hpo4、2mm nah2po4、135mm nacl、4.7mm kcl。
[0024]
在本发明的一个或多个实施方式中，荧光探针组合物中荧光探针的浓度为0.1μmol/l～1mmol/l。
[0025]
在本发明的一个或多个实施方式中，荧光探针组合物的ph值为5～12。
[0026]
在本发明的一个或多个实施方式中，多菌灵残留检测用的检测产品，包括如前述的检测组合物或如前述的多菌灵残留检测用荧光探针。
[0027]
在本发明的一个或多个实施方式中，检测产品为试剂盒或试纸。
[0028]
本发明通过配制金属铱溶剂配合物荧光探针和不同已知浓度样品的混合溶液，等待一段时间，根据混合溶液荧光强度变化绘制工作曲线拟合得到线性方程，最后采用针对待测混合溶液的线性方程对样品中多菌灵浓度定量检测。
[0029]
在本发明的一个或多个实施方式中，样品预处理过程可以选择如下若干过程进行处理，选择范围可以包括研磨、有机溶剂提取、超声、离心、过滤，这可以视样品类型而定，如固体样品像瓜果蔬菜、土壤等。优选的样品取样量为5g。优选的有机提取溶剂为甲醇。优选的超声提取时间为10min。优选的离心转速为4000rpm时间为5min。优选的过滤设备为0.22μm孔径的针式过滤器。
[0030]
在本发明的一个或多个实施方式中，金属铱溶剂配合物具体浓度为0.1μmol/l～1mmol/l。优选的金属铱溶剂配合物浓度为10μmol/l。
[0031]
在本发明的一个或多个实施方式中，混合溶液的具体ph值为5～12。优选的ph值为8.4。
[0032]
在本发明的一个或多个实施方式中，检测时样品与荧光探针反应等待时间具体为5～60min。优选的，等待时间为20min。
[0033]
与现有技术相比，根据本发明实施方式的多菌灵残留检测用荧光探针、方法、组合物及检测产品，通过配体取代反应与多菌灵特异性结合，根据荧光强度及发射峰的变化对多菌灵定量检测。该方法具有高的灵敏度和选择性，检出限可达0.054776μmol/l。
附图说明
[0034]
图1是根据本发明一实施方式的荧光探针与不同浓度多菌灵荧光光普图；
[0035]
图2是根据本发明一实施方式的反应时间优化图；
[0036]
图3是根据本发明一实施方式的ph条件优化图；
[0037]
图4是根据本发明一实施方式的选择性测试图；
[0038]
图5是根据本发明一实施方式的用于检测的线性曲线。
具体实施方式
[0039]
下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
[0040]
除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元
件或其它组成部分。
[0041]
金属铱溶剂配合物由金属核铱包括而不限于三氯化铱等铱盐、c^n二齿配体、溶剂配体组成，其弱结合溶剂配体，可通过配体取代反应与多菌灵共价结合。金属铱溶剂配合物自身荧光微弱或没有，但与多菌灵特异性结合后能发出强的荧光并产生发射峰的位移。与多菌灵结合后生成的金属铱配合物具有优异的光物理性质例如：稳定性高，大斯托克斯位移，荧光寿命长，强的抗光漂白性等。除此之外金属铱溶剂配合物还具有易于合成，能溶于水等特点，因此十分适合作为荧光探针用于多菌灵的定量检测。
[0042]
包括而不限于下述的荧光探针在制备过程中，制备过程参照实施例一所示，对c^n二齿配体进行适应性替换即可，都至少满足金属核铱中铱原子与c^n二齿配体的摩尔比为1:2。溶剂采用体积比1:1、2:1、3:1、4:1、5:1以及(1-5):1范围内的其它任意比的乙二醇乙醚和水混合溶剂。当然制备过程中，溶剂的组成是可以进行合理调整的。
[0043]
需要说明的是，包括而不限于如下所示化合物的合成路线都可以与实施例一所展示的化合物的合成部分接近或者相同，故而在所有本发明限定范围内的化合物的合成中，均可以实施例一相关内容为参照，而不一一详述。当然实施例一的展示也仅仅展示了一种路线和可能，而非限定。
[0044]
实施例一
[0045]
本实施例的荧光探针结构如下所示：
[0046][0047]
荧光探针的合成：
[0048]
首先在茄形烧瓶中依次加入体积比3:1乙二醇乙醚与水，再加入三氯化铱与2-苯基吡啶，在氩气保护下搅拌回流24h。反应结束后待冷却至室温用布氏漏斗抽滤反应液收集滤渣得到土黄色二氯桥金属铱中间体，该中间体无需进一步提纯。
[0049]
将得到的二氯桥金属铱中间体放入茄形烧瓶中加入一定量的乙腈，再加入适量四氟硼酸银，在氩气保护下避光加热搅拌回流12h。反应结束后滤液用中性氧化铝过滤并收集滤液。用旋蒸蒸发仪将滤液旋干得到粗产品，粗产品通过柱层析技术提纯展开剂为一定比例的乙腈与二氯甲烷，最终得到浅黄色产品。
[0050]
金属铱溶剂配合物核磁共振谱(1h nmr)数据如下：1h nmr(cd3cn,400mhz),δppm:9.08(m,1h),8.09-8.02(m,2h),7.67-7.65(dd,j＝8,1.2hz,1h),7.47-7.43(m,1h),6.91-6.87(td,j＝7.6,1.2hz,1h),6.76-6.72(td,j＝7.6,1.2hz,1h),6.04(dd,j＝7.6,0.8hz,1h),1.96(s,3h)。碳谱信息为：
13
c nmr(cd3cn,101hz),δppm:167.98,151.91,145.54,144.69,139.94,132.10,130.56,125.20,124.50,123.61,120.69,118.34,1.35.
[0051]
如图1和图5所示，在含有10μmol/l金属铱溶剂配合物的pbs缓冲溶液中分别加入不同浓度的多菌灵(0、1、3、5、10、20、30、40、50μmol/l)配制成混合溶液，等待反应20min后取3ml加入标准石英比色皿中，用荧光光谱仪采集混合溶液的荧光，设置激发波长为365nm
狭缝为20nm，检出荧光发射峰为526nm。然后根据其在526nm处荧光强度绘制工作曲线拟合得到线性方程为：y＝(0.09147
±
0.01901)x (0.07819
±
0.0024)。
[0052]
以含有10μmol/l金属铱溶剂配合物的pbs缓冲溶液为空白样本，测量其在526nm出荧光强度11次计算得空白标准偏差。利用公式(式中c
l
为检出限，m为线性方程斜率，sb为空白标准偏差，k为置信因子取3)计算得检出限为0.054776μm/l。
[0053]
实施例二
[0054]
本实施例的荧光探针结构如下所示：
[0055][0056]
在含有10μmol/l金属铱溶剂配合物的pbs缓冲溶液中加入50μmol/l多菌灵配制成混合溶液，混合后立马取3ml加入标准石英比色皿中，利用荧光光谱仪设置激发波长为365nm狭缝为20nm，在经过一段时间(0、2、5、8、10、15、20、25、30、35min)后采集荧光光谱，监测荧光光强变化。发现其荧光发射峰在463nm处，如图2所示，当反应经过20min后荧光光强基本达到最大，为最优等待时间。
[0057]
实施例三
[0058]
本实施例的荧光探针结构如下所示：
[0059][0060]
利用盐酸和氢氧化钠溶液分别调节pbs缓冲溶液的ph值(ph＝1.14、2.21、3.3、4.25、5.35、6.19、7.46、8.44、9.24、10.53、11.21、12.22、13.02)并加入10μmol/l金属铱溶剂配合物和50μmol/l多菌灵配制成混合溶液，等待20min后利用荧光光谱仪设置激发波长为365nm狭缝为20nm采集荧光光谱，发现其荧光发射峰在503nm处，当ph＝8.4的时候荧光强度达到最大，如图3所示，为最优ph值。
[0061]
实施例四
[0062]
本实施例的荧光探针结构如下所示：
[0063][0064]
在含有10μmol/l金属铱溶剂配合物的pbs缓冲溶液中分别加入50μmol/l多菌灵与其他常见的杀菌剂农药(百菌清、甲基托布津、福美双、代森锰锌)配制成混合溶液。等待20min后利用荧光光谱仪设置激发波长为365nm狭缝为20nm采集荧光光谱，实验发现金属铱溶剂配合物荧光探针只能与多菌灵特异性结合发出强的荧光，其他农药荧光强度变化不大，如图4所示，证明了这种荧光探针对多菌灵拥有高的选择性。
[0065]
实施例五
[0066]
本实施例的荧光探针结构如下所示：
[0067][0068]
称取5g苹果作为样品切碎并研磨，加入20ml甲醇超声10min提取，超声结束后将混合液以4000rpm转速离心5min，上清液用0.22μm孔径的针式过滤器过滤，取1ml滤液用pbs缓冲溶液稀释至10ml，再加入10μmol/l金属铱溶剂配合物和不同浓度的多菌灵(0、1、3、5、15、20、30、35μmol/l)。等待20min后利用荧光光谱仪设置激发波长为365nm狭缝为20nm采集荧光光谱，发现其荧光发射峰在581nm处，利用581nm处荧光光强绘制工作曲线拟合得线性方程y＝(0.05554
±
0.00162)x (0.53605
±
0.04088)，调整后r平方0.99408。
[0069]
再次称取5g苹果作为样品切碎并研磨，加入20ml甲醇超声10min提取，超声结束后将混合液以4000rpm转速离心5min，上清液用0.22μm孔径的针式过滤器过滤，取1ml滤液用pbs缓冲溶液稀释至10ml，再加入10μmol/l金属铱溶剂配合物和不同浓度的多菌灵(10、25、40μmol/l)。等待20min后利用荧光光谱仪设置激发波长为365nm狭缝为20nm采集荧光光谱，将581nm处荧光强度带入所得线性公式计算多菌灵浓度为8.97、25.82、39.83μmol/l，回收率为89.68％、103.29％、99.58％，较高回收率在一定程度上反应了本发明具有较高的检测精度。
[0070]
实施例六
[0071]
本实施例的荧光探针结构如下所示：
[0072][0073]
称取5g梨作为样品切碎并研磨，加入20ml甲醇超声10min提取，超声结束后将混合液以4000rpm转速离心5min，上清液用0.22μm孔径的针式过滤器过滤，取0.5ml滤液用pbs缓冲溶液稀释至10ml，再加入15μmol/l金属铱溶剂配合物和不同浓度的多菌灵(0、2.5、10、20、25、35μmol/l)。等待20min后利用荧光光谱仪设置激发波长为365nm狭缝为20nm采集荧光光谱，发现其荧光发射峰在537nm处，利用537nm处荧光光强绘制工作曲线拟合得线性方程y＝(0.164
±
0.00505)x (0.19936
±
0.09116)，调整后r平方为0.99434。
[0074]
再次称取5g梨作为样品切碎并研磨，加入20ml甲醇超声10min提取，超声结束后将混合液以4000rpm转速离心5min，上清液用0.22μm孔径的针式过滤器过滤，取0.5ml滤液用pbs缓冲溶液稀释至10ml，再加入15μmol/l金属铱溶剂配合物和不同浓度的多菌灵(5、15、30μmol/l)。等待20min后利用荧光光谱仪设置激发波长为365nm狭缝为20nm采集荧光光谱，将537nm处荧光强度带入所得线性公式计算多菌灵浓度为5.46、14.37、30.18μmol/l，回收率为109.36％、95.83％、100.63％，较高回收率在一定程度上反应了本发明具有较高的检测精度。
[0075]
实施例七
[0076]
本实施例的荧光探针结构如下所示：
[0077][0078]
称取5g橙子作为样品切碎并研磨，加入20ml甲醇超声10min提取，超声结束后将混合液以4000rpm转速离心5min，上清液用0.22μm孔径的针式过滤器过滤，取0.5ml滤液用pbs缓冲溶液稀释至10ml，再加入15μmol/l金属铱溶剂配合物和不同浓度的多菌灵(0、2.5、10、15、25、30、40μmol/l)。等待20min后利用荧光光谱仪设置激发波长为365nm狭缝为20nm采集荧光光谱，发现其荧光发射峰在546nm处，利用546nm处荧光光强绘制工作曲线拟合得线性方程y＝(0.14132
±
7.10615e-4)x (0.83067
±
0.01488)，调整后r平方0.99982。
[0079]
再次称取5g橙子作为样品切碎并研磨，加入20ml甲醇超声10min提取，超声结束后将混合液以4000rpm转速离心5min，上清液用0.22μm孔径的针式过滤器过滤，取0.5ml滤液用pbs缓冲溶液稀释至10ml，再加入15μmol/l金属铱溶剂配合物和不同浓度的多菌灵(5、20、35μmol/l)。等待20min后利用荧光光谱仪设置激发波长为365nm狭缝为20nm采集荧光光
谱，将546nm处荧光强度带入所得线性公式计算多菌灵浓度为4.82、20.09、34.90μmol/l，回收率为96.58％、100.47％、99.72％，较高回收率在一定程度上反应了本发明具有较高的检测精度。
[0080]
包括而不限于上述实施例中所采用的荧光探针，还可以同等地替换为如实施例八-十六所展示的荧光探针，以供参考，而具体的方案这里就不一一赘述。
[0081]
实施例八
[0082]
本实施例的荧光探针结构如下所示：
[0083][0084]
实施例九
[0085]
本实施例的荧光探针结构如下所示：
[0086][0087]
实施例十
[0088]
本实施例的荧光探针结构如下所示：
[0089][0090]
实施例十一
[0091]
本实施例的荧光探针结构如下所示：
[0092][0093]
实施例十二
[0094]
本实施例的荧光探针结构如下所示：
[0095][0096]
实施例十三
[0097]
本实施例的荧光探针结构如下所示：
[0098][0099]
实施例十四
[0100]
本实施例的荧光探针结构如下所示：
[0101]
[0102]
实施例十五
[0103]
本实施例的荧光探针结构如下所示：
[0104][0105]
实施例十六
[0106]
本实施例的荧光探针结构如下所示：
[0107][0108]
实施例八-十六的荧光探针，在同等替换实施例一的荧光探针时，其同样具有较好的检出性能，检出限范围为0.050000-0.055000μm/l，检测精度满足限定要求。
[0109]
实施例八-十六的荧光探针，在同等替换实施例二的荧光探针时，其同样具有较好的等待时间，在18-22min后荧光光强基本达到最大，为最优等待时间。荧光发射峰在580-650nm之间。
[0110]
实施例八-十六的荧光探针，在同等替换实施例三的荧光探针时，其同样具有较温和的检测条件，其ph范围约7.5-9的时候荧光强度达到最大，为最优ph值。
[0111]
实施例八-十六的荧光探针，在同等替换实施例四的荧光探针时，其同样具有较好的选择性，只能与多菌灵特异性结合发出强的荧光，其他农药荧光强度变化不大，证明了这种荧光探针对多菌灵拥有高的选择性。
[0112]
实施例八-十六的荧光探针，在同等替换实施例五-七的荧光探针时，都同样反应了本发明方案具有较高的检测精度。
[0113]
在包括而不限于上述实施例一至十六所列举的荧光探针，可以被广泛应用与农产品试样，如水果、蔬菜、土壤等的多菌灵农残检测，也可以被应用于如江河湖海等水体以及雨水雪水等降水的多菌灵污染检测，相关检测过程可以参照前述实施例示例部分或者采用其它可行的合理方案进行，同样在本发明所限定的范围内。比如可以采集10ml河水，以4000rpm转速离心5min，上清液用0.22μm孔径的针式过滤器过滤，使用包括而不限于上述实施例中类似过程对多菌灵进行定量检测。
[0114]
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应
用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。