一种毛簇木霉、菌剂及其应用的制作方法

1.本发明涉及农田栽参技术领域，具体而言，涉及一种毛簇木霉、菌剂及其应用。


背景技术：

2.目前，农田栽参存在土壤理化性状劣变、重金属及农药残留增加、化感物质累积、根际微生态系统失调、养分缺失、土传病害等问题。虽然通过施用芽孢杆菌、多元维生素、米曲霉、微量元素等多种物质组合而成的土壤改良剂可以在一定程度上改良人参生长的土壤环境，通过将易消耗营养元素磷、钾、铁、硼、锰等与植物生长调节剂配合施用，在人参生长各个阶段喷施，可以促进其生长发育增加产量。然而仍然存在施用成本高、磷肥钾肥等施用过量等问题，实际栽参过程中配合比例复杂不利于农用推广等问题。
3.鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种毛簇木霉、菌剂及其应用以解决上述技术问题。
5.本发明是这样实现的：
6.本发明提供了一种毛簇木霉，保藏于微生物菌种保藏中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期为：2021年8月19日，保藏编号为：cgmcc no.23211，菌株分类学名称为毛簇木霉trichoderma velutinum。
7.在本发明应用较佳的实施方式中，上述毛簇木霉以分生孢子、菌丝体、含有分生孢子和菌丝体三种形式之一存在。
8.在本发明应用较佳的实施方式中，上述毛簇木霉的菌落培养特征为：在pda平板上培养7天，菌落直径为80-90mm，白色的气生菌丝稀薄，菌落有1～2个环纹出现，环纹初为白色，后逐渐变成黄色，菌落边缘呈绿色；产生的分生孢子簇，外观绒毛状；分生孢子多为簇生，椭圆形，黄色，直径大小(3～4.2)μm
×
(1.5～2.6)μm；分生孢子梗多为对生，顶端分支呈锐角或直角，在顶端直接产生尖锐状瓶梗。
9.本发明提供了一种菌剂，其包括毛簇木霉和/或毛簇木霉发酵后产生的孢子。
10.在本发明应用较佳的实施方式中，上述菌剂的形态选自如下任意一种：
11.重悬孢子悬浮液、粉剂、颗粒剂和水分散粒剂。
12.本发明还提供了一种毛簇木霉或菌剂在抑制人参致病菌中的应用。
13.在本发明应用较佳的实施方式中，上述人参致病菌选自如下至少一种：人参黑斑病菌(alternaria panax)、人参菌核病菌(sclerotinia schinseng)、人参炭疽病菌(colletotrichum panacicola)、人参锈腐病菌(ilyonectria robusta)和人参根腐病菌(fusarium oxysporum)。
14.在本发明应用较佳的实施方式中，将毛簇木霉制成液剂、乳剂或悬浮剂使用；
15.在一种可选的实施方式中，液剂、乳剂或悬浮剂的用量为3
×
108cfu/株-9
×
108cfu/株。
16.在本发明应用较佳的实施方式中，将毛簇木霉制成粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂、水分散粒剂或种子包衣剂使用。
17.在一种可选的实施方式中，粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂、水分散粒剂或种子包衣剂使用的用量为3
×
108cfu/株-9
×
108cfu/株。
18.本发明还提供了一种人参土壤改良剂，其包括上述的毛簇木霉或菌剂。
19.在一种可选的实施方式中，人参土壤改良剂是以毛簇木霉为主要有效成分。
20.在一种可选的实施方式中，人参土壤改良剂中含毛簇木霉的量为1
×
108cfu
·
ml-1
～3
×
108cfu
·
ml-1
。
21.本发明具有以下有益效果：
22.本发明分离筛选出一种毛簇木霉，该毛簇木霉可以用于制备微生物菌剂，也可以采用该毛簇木霉对人参种植农田土进行改良，提升土壤的生物丰度，毛簇木霉既可以调整根际微生态系统，还可以保护土壤微生物种群结构。施用毛簇木霉后，可以增加农田土的养分，进而有助于极大程度上改善现有人参的栽培环境，有利于提升人参的产量和质量。此外，发明人研究发现，本发明提供的毛簇木霉可以防治人参主要病害，对人参有一定促生作用。本发明筛分出的毛簇木霉为人参产业的可持续性发展奠定了良好的基础。
附图说明
23.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
24.图1为tri401与人参致病菌对峙培养图；
25.图2为tri401系统发育树；
26.图3为tri401处理土壤细菌在门水平上系统分类图；
27.图4为tri401处理土壤真菌在门水平上系统分类图；
28.图5为对照土壤和tri401处理土壤人参生长情况；
29.图6为对照土壤和tri401处理土壤西洋参生长情况。
具体实施方式
30.现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。
31.本发明分离筛选出一种毛簇木霉，该毛簇木霉可以制备微生物菌剂，也可以采用该毛簇木霉对人参种植农田土进行改良，提升土壤的生物丰度，调整根际微生态系统，增加农田土的养分，进而有助于极大程度上改善现有人参的栽培环境，有利于提升人参的产量和质量。此外，发明人研究发现，本发明提供的毛簇木霉可以防治人参主要病害，对人参有一定促生作用。本发明筛分出的毛簇木霉为人参产业的可持续性发展奠定了良好的基础。
32.该毛簇木霉，保藏于微生物菌种保藏中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号
院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期：2021年8月19日，保藏编号为：cgmcc no.23211，菌株分类学名称为毛簇木霉trichoderma velutinum。生物材料名称为tri401。
33.上述毛簇木霉以分生孢子、菌丝体、含有分生孢子和菌丝体三种形式之一存在。
34.在本发明应用较佳的实施方式中，上述毛簇木霉的菌落培养特征为：在pda平板上培养7天，菌落直径为80-90mm，白色的气生菌丝稀薄，菌落有1～2个环纹出现，环纹初为白色，后逐渐变成黄色，菌落边缘呈绿色；产生稀薄的分生孢子簇，外观绒毛状；分生孢子多为簇生，椭圆形，黄色，直径大小(3～4.2)μm
×
(1.5～2.6)μm；分生孢子梗多为对生，顶端分支呈锐角或直角，在顶端直接产生尖锐状瓶梗。
35.发明人设计引物对分离出的菌株的rdna-its序列进行了测序分析。经测序可知，该菌株的rdna-its序列长度为589bp，序列如下seq id no.1所示。
36.cggagggatcattaccgagtttacaactcccaaacccaatgtgaacgttaccaaactgttgcctcggcgggatcttctgccccgggtgcgtcgcagccccggaccaaggcgcccgccggaggaatcaaccaaaactcttattgtataccccctcgcgggtttttttataatctgagccttctcggcgcctctcgtaggcgtttcgaaaatgaatcaaaactttcaacaacggatctcttggttctggcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataagtaatgtgaattgcagaattcagtgaatcatcgaatctttgaacgcacattgcgcccgccagtattctggcgggcatgcctgtccgagcgtcatttcaaccctcgaacccctccggggggtcggcgttggggatcggccctcctcttgcgggggccgtctccgaaatacagtggcggtctcgccgcagcctctcctgcgcagtagtttgcacactcgcatcgggagcgcggcgcgtccacagccgttaaacacccaacttctgaaatgttgacctcggatcaggtaggaatacccgctgaacttaagcata。
37.发明人进一步应用blast和dnaman等软件进行序列分析，将分离出的菌株的its序列通过blast比对，能在genbank中找到同源性非常高的相近菌株序列。与tri401菌株相似性最高的是t.velutinum，同源性达到100％。根据mega6.06软件以upgma法构建系统发育树发现，tri401与t.velutinum同属一个遗传分枝，亲缘关系十分接近。结合形态学分类和分子生物学鉴定结果，可以确认本发明分离出的菌株tri401为毛簇木霉。
38.基于此，发明人提供了一种菌剂，其包括毛簇木霉和/或毛簇木霉发酵后产生的孢子。
39.该菌剂的形态包括不限于如下的类型：重悬孢子悬浮液、粉剂、颗粒剂和水分散粒剂。例如乳化剂、混悬液等。
40.发明人通过病原菌抑菌实验证实，上述的毛簇木霉或菌剂可以抑制多种人参致病菌，对于人参的病害防治具有良好的应用前景。特别地，本发明提供的毛簇木霉可以应用于老参地土壤病原菌的防治，尤其是病原真菌的防治。
41.需要说明的是，上述防治是指，施用毛簇木霉或菌剂后，人参的病原菌表现出如下至少一种的现象均在本发明的保护范围之内：病原菌的数量减少、病原菌的种类变少、或者病原菌的生长受阻或不再生长等。
42.上述毛簇木霉或菌剂在抑制人参致病菌中的应用包括不限于如下的人参致病菌：
43.人参黑斑病菌(alternaria panax)、人参菌核病菌(sclerotinia schinseng)、人参炭疽病菌(colletotrichum panacicola)、人参锈腐病菌(ilyonectria robusta)和人参根腐病菌(fusarium oxysporum)。
44.在其他实施方式中，上述病原菌还可以是人参立枯丝核菌、人参疫病菌或人参灰霉病。
45.在本发明应用较佳的实施方式中，将毛簇木霉制成液剂、乳剂或悬浮剂使用；
46.在一种可选的实施方式中，液剂、乳剂或悬浮剂的用量为3
×
108cfu/株-9
×
108cfu/株。
47.在一种可选的实施方式中，将毛簇木霉菌丝体或者其分生孢子分散于溶剂、乳化剂或其他分散介质中，用于灌根、浸根、浸种或喷施。乳化剂可以是阳离子型乳化剂、阴离子型乳化剂或非离子型乳化剂。
48.在本发明应用较佳的实施方式中，将毛簇木霉制成粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂、水分散粒剂或种子包衣剂使用。上述粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂、水分散粒剂可以是通过真空冷冻干燥制备的菌粉或者喷雾干燥制备的菌粉、菌颗粒。在使用时，将菌粉进行溶解。
49.在一种可选的实施方式中，粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂、水分散粒剂或种子包衣剂使用的用量为3
×
108cfu/株-9
×
108cfu/株。使用前可以根据需要进行稀释处理。
50.本发明还提供了一种人参土壤改良剂，其包括上述的毛簇木霉或菌剂。
51.在一种可选的实施方式中，人参土壤改良剂是以毛簇木霉为主要有效成分。
52.在一种可选的实施方式中，人参土壤改良剂中含毛簇木霉的量为1
×
108cfu
·
ml-1
～3
×
108cfu
·
ml-1
。
53.上述施用本发明提供的人参土壤改良剂后土壤呈现如下至少一种的情形均在本发明所述的改良范围内：土壤水分情况得到改善(例如板结情况改善)、土壤有机质增加使得土壤肥力提高、土壤有益微生物丰度提高、人参产量和/或质量提高。
54.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
55.以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
56.马铃薯葡萄糖琼脂培养基(pda)购自青岛海博生物技术有限公司，产品编号：hb0233。
57.发酵的培养液为马铃薯葡萄糖液体培养基(pdb)。pdb培养基中包括：马铃薯200g/l，葡萄糖10g/l，蒸馏水1000ml。
58.培养的温度为25℃，时间为96h，条件为180r/min。
59.发酵后经过滤获得孢子。
60.实施例1
61.本实施例提供了毛簇木霉(trichoderma velutinum)tri401菌株的筛选、分离和鉴定方法。
62.本发明提供的毛簇木霉自吉林省吉林市左家镇人参种植基地的人参根际土壤中分离得到。
63.人参根际土从吉林省吉林市左家镇人参种植基地的人参根际土壤采集获得，根际土采用稀释涂布平板法，取10g人参根际土加入盛有90ml无菌水的锥形瓶中于150r/min摇床上振荡30min，从锥形瓶中吸取1ml混合均匀的土壤悬浊液，用无菌水进行梯度稀释，分别从10-3
、10-4
、10-5
三个梯度中吸取200μl加到pda培养基平板上涂布均匀，将平板放于25℃培养3d，挑取平板上的木霉单菌落菌丝转接到pda培养基上进行纯化。纯化菌株于4℃保存。
64.在pda平板培养7天，菌落直径约为90mm，白色的气生菌丝稀薄，菌落有1～2个环纹出现，初为白色，后逐渐变成黄色，菌落边缘呈绿色。产生稀薄的分生孢子簇，外观绒毛状。分生孢子多为簇生，椭圆形，黄色，直径大小(3～4.2)μm
×
(1.5～2.6)μm；分生孢子梗多为对生，顶端分支呈锐角或直角，在顶端直接产生尖锐状瓶梗。根据菌株tri401的培养特性和形态特征，初步判断筛选出的菌株为毛簇木霉trichoderma velutinum。
65.发明人通过通用引物its4/its5对分离出的菌株的rdna-its序列进行了测序分析。经测序可知，该菌株的rdna-its序列长度为589bp，序列如下seq id no.1所示：
66.cggagggatcattaccgagtttacaactcccaaacccaatgtgaacgttaccaaactgttgcctcggcgggatcttctgccccgggtgcgtcgcagccccggaccaaggcgcccgccggaggaatcaaccaaaactcttattgtataccccctcgcgggtttttttataatctgagccttctcggcgcctctcgtaggcgtttcgaaaatgaatcaaaactttcaacaacggatctcttggttctggcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataagtaatgtgaattgcagaattcagtgaatcatcgaatctttgaacgcacattgcgcccgccagtattctggcgggcatgcctgtccgagcgtcatttcaaccctcgaacccctccggggggtcggcgttggggatcggccctcctcttgcgggggccgtctccgaaatacagtggcggtctcgccgcagcctctcctgcgcagtagtttgcacactcgcatcgggagcgcggcgcgtccacagccgttaaacacccaacttctgaaatgttgacctcggatcaggtaggaatacccgctgaacttaagcata。
67.发明人进一步应用blast和dnaman等软件进行序列分析，将分离出的菌株的its序列通过blast比对，能在genbank中找到同源性非常高的相近菌株序列。与tri401菌株相似性最高的是t.velutinum，同源性达到100％。根据mega6.06软件以upgma法构建系统发育树(参照图2所示)发现，tri401与t.velutinum同属一个遗传分枝，亲缘关系十分接近。结合形态学分类和分子生物学鉴定结果，可以确认本发明的菌株tri401为毛簇木霉。
68.实施例2
69.本实施例进行毛簇木霉对人参致病菌的拮抗作用实验。
70.选择5种人参主要病害的致病菌：人参黑斑病菌(alternaria panax)、人参菌核病菌(sclerotinia schinseng)、人参炭疽病菌(colletotrichum panacicola)、人参锈腐病菌(ilyonectria robusta)、人参根腐病菌(fusarium oxysporum)，以上五种菌株均由中国农业科学院特产研究所药用植物栽培团队提供。将保存的木霉菌tri401和病原菌菌株分别转接到pda平板上，于25℃黑暗条件下恒温培养7d后，用5mm打孔器在菌落边缘打取菌饼。采用两点对峙平板培养法，分别放置于pda平板的对称两边，菌饼间距3cm，只接种病原菌为对照(ck)，每处理重复3次，接种后置于25℃恒温培养箱培养7d，观察测量菌落的直径。
71.抑制率计算公式如下：抑菌率(％)＝(对照菌落半径－处理菌落半径)/对照菌落半径
×
100％。
72.参照图1所示，对照组和对峙组均为培养7天的试验图片，对照的病原菌生长较快，而对峙培养中的木霉菌丝迅速占领生长空间，对峙培养3d即可观察到对病原菌的拮抗作用，病原菌的生长明显受限；7d后木霉菌将病原菌包围，占据整个培养皿，使病原菌几乎不再生长。在平板对峙培养过程中，菌株tri401对人参菌核病菌(s.schinseng)、人参锈腐病菌(i.robusta)、人参根腐病菌(f.oxysporum)、人参炭疽病菌(c.panacicola)、人参黑斑病菌(a.panax)的抑菌率分别为87.89％、89.73％、87.80％、90.35％、84.91％。
73.实施例3
74.本实施例进行毛簇木霉对农田土栽培人参的促生长作用实验。
75.本实施例采用盆栽试验法测定毛簇木霉tri401菌株对人参的促生作用。
76.菌株培养液的制备方法如下：
77.将毛簇木霉tri401试管斜面种活化，取2个5mm菌饼接种于用250ml三角瓶装的100ml马铃薯葡萄糖液体培养基(pdb)中，在170r/min，25℃下培养48h，获得种子液；将毛簇木霉tri401种子液以10％(体积比)接种于发酵培养液中培养，在170r/min，25℃下培养96h，获得培养液；将毛簇木霉tri401培养液经2层无菌纱布过滤，滤液经血球计数板计数，将孢子悬浮液分散至6g
·
l-1
羧甲基纤维素钠(cmc)溶液中，获得孢子悬浮液，孢子含量为1～3
×
108个/ml-1
。
78.马铃薯葡萄糖液体培养基(pdb)的制备方法：土豆200g/l，葡萄糖10g/l，蒸馏水1000ml，ph为6.8～7.2。1000ml三角瓶中装量为300ml培养液，用双层封口膜封好三角瓶口，121℃湿热灭菌30min，冷却后备用。
79.将农田土(未栽参的普通玉米田土壤，使用前用20目网筛筛除秸秆石头等杂质)装入直径为20cm花盆，每盆装土2kg。选择大小一致且生长良好的一年生人参幼苗进行移栽，每盆6株，每处理4盆。将制备好的毛簇木霉tri401孢子悬浮液(含菌量约为1～3
×
108cfu
·
ml-1
)，用无菌水稀释10倍液，人参幼苗先用tri401孢子悬浮液蘸根处理，培土栽好后取30ml tri401孢子悬浮液灌根。对照组给予新鲜的pdb液体培养基。
80.待人参苗长到90d后，分别将处理组和对照组的完整人参苗挖出，取各处理人参根系土壤，提取土壤样品总基因组，检测土壤微生物群落结构变化。观察并测量人参的各项生长指标。
81.tri401处理组和对照组的土壤基因组经16s测序分别得到1806、1683个otus。其中处理组细菌涵盖了32门、85纲、180目、289科、467属，对照组细菌涵盖了29门、81纲、172目、278科、440属；经its1测序处理组真菌涵盖了11门、26纲、61目、110科、183属，对照组真菌涵盖了9门、22纲、54目、108科、190属。在门的水平上，处理组和对照组的人参土壤细菌优势菌群前三位相同(图3)，依次为proteobacteria(32.068％—34.196％)、acidobacteria(25.051％—26.409％)、chloroflexi(7.098％—8.704％)。但是细菌actinobacteria、verrucomicrobia、bacteroidetes、firmicutes、patescibacteria在添加tri401生物菌剂处理土壤中地位不同(图3)。细菌proteobacteria是tri401处理后的关键微生物，添加tri401生物菌剂后其丰度显著高于对照(p＜0.05)。
82.在门的水平上，处理组和对照组人参土壤真菌优势菌群均为ascomycota，其中chytridiomycota在两者中地位不同；添加tri401生物菌剂土壤中真菌mortierellomycota丰度为第二位，而对照土壤中真菌basidiomycota为第二位(图4)。
83.从微生物多样性分析结果可知：细菌变形菌门(proteobacteria)和真菌被孢霉菌门mortierellomycota是tri401改良农田栽参的关键微生物。
84.将整株人参洗去根部泥土，测量其整株鲜重和根鲜重指标。然后105℃烘干至恒温，测整株干重和根干重，统计结果如下表所示。
85.处理地上鲜重(g)根鲜重(g)地上干重(g)根干重(g)存苗率tri4010.85
±
0.09a1.92
±
0.20a0.19
±
0.02a0.55
±
0.06a83.3％ck0.9
±
0.05a1.56
±
0.12b0.15
±
0.02b0.36
±
0.05b50％
86.由上表可知，人参一个生育周期结束后，从人参的整体长势来看，须根发达，存苗
率为83.3％，对照组为50％。经过毛簇木霉灌根处理可以有效保证存苗率。tri401处理的人参鲜质量比ck增加了12.60％，干质量比ck增加了45.10％。说明施用毛簇木霉tri401有利于人参干物质积累，对人参有明显的促生作用。
87.本发明筛选分离出一株生防菌毛簇木霉，在农田土栽参的过程中施用该菌剂，种植人参种苗，可以有效保证存苗率，对人参根、茎、叶生长具有显著的促生作用。本发明提供的毛簇木霉可以防治人参主要病害，对人参有一定促生作用。本发明筛分出的毛簇木霉为人参产业的可持续性发展奠定了良好的基础。
88.实施例4
89.本实施例进行毛簇木霉对人参枯叶病的防治作用实验。
90.人参枯叶病主要是人参种植在农田土中，生长期展叶开花后，叶片出现从叶尖或边缘干枯、卷曲，逐渐向主叶脉和叶柄处蔓延，发生趋势从老叶向新叶扩展，最后整株地上部分枯死。严重影响植物光合作用，导致人参产量和品质急剧下降。
91.实验方法同实施例3。
92.结果表明(图5)：对照组出现叶尖及边缘干枯——人参枯叶病，添加tri401的处理组人参枯叶病的症状几乎未出现或有所缓解，说明tri401能有效缓解农田土栽参枯叶病的发生。
93.实施例5
94.本实施例进行毛簇木霉对西洋参枯叶病的防治作用实验。
95.西洋参枯叶病同人参枯叶病发生情况相似，由于种植在农田土中，生长期展叶开花后，叶片出现从叶尖或边缘干枯、卷曲，逐渐向主叶脉和叶柄处蔓延，发生趋势从老叶向新叶扩展，最后整株地上部分枯死。严重影响植物光合作用，导致西洋参产量下降。
96.选择农田土栽培西洋参的地块作为试验基地，处理小区面积设为1.5m
×
1.5m，每个处理3次重复；在5月下旬施用毛簇木霉tri401孢子悬浮液灌根处理，孢子悬浮液(含菌量约为1～3
×
108cfu
·
ml-1
)稀释10倍后，间隔10～15d施用一次，共施3次。观察西洋参生长情况。
97.调查结果显示(图6)：未做任何处理的对照组出现叶尖及边缘干枯——西洋参枯叶病，tri401处理组枯叶病发病程度明显低于对照组。说明tri401可以有效缓解西洋参枯叶病的发生。
98.以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。