人工重组的H5N6流感病毒及其制备方法和应用与流程

人工重组的h5n6流感病毒及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明涉及反向遗传学技术和动物传染病技术领域，具体涉及一种人工重组并致弱的 h5n6亚型重组流感病毒及其制备方法和应用。


背景技术：

2.高致病性禽流感(avian influenza，ai)是由a型流感病毒引起的烈性呼吸道疾病，被世界动物卫生组织(oie)定为a类传染病，ai不仅给世界养禽业造成了巨大的经济损失，而且严重威胁着人类生命安全，ai防控成了目前人兽共患传染病研究的焦点。禽流感病毒(avianinfluenza virus，aiv)为分节段的负链rna病毒，含有8个基因片段，容易发生基因突变和重组，产生新型病毒。根据病毒的表面蛋白，aiv被分为16个血凝素(ha)和9个神经氨酸酶(na)亚型。我国家禽中已监测到多种 h5nx亚型禽流感病毒，如h5n1、h5n2、h5n6、h5n8、h5n9等。
3.自2014年以来，高致病性h5n6亚型病毒逐渐取代我国早期的h5n1亚型病毒，成为我国家禽中传播和流行的优势毒株。我国采用疫苗免疫和扑杀相结合的综合措施应用于h5 亚型高致病性ai的防控，家禽中未出现大规模的疫情。近期病原学监测发现，家禽中分离到的h5n6病毒发生抗原性变异，导致现有h5亚型禽流感疫苗无法提供完全有效保护，给家禽养殖业带来严重威胁；同时2021年上半年我国南方多个省份发生人感染h5n6病毒的病例，引起人们对其导致更大公共卫生危害的担忧。为有效控制我国家禽h5n6亚型禽流感病毒，避免其可能产生更大范围的公共卫生危害，本发明进行了人工重组的h5n6禽流感疫苗株的研制。
4.理想的流感病毒疫苗株应具备与流行株良好的抗原匹配性，对鸡胚无致病力及鸡胚高滴度生长性等条件。然而，很难从自然界分离具备上述条件的病毒作为疫苗株。


技术实现要素：

5.本发明所要解决的技术问题为：提供一种人工重组的h5n6流感病毒及其制备方法和应用。
6.本发明的技术方案为：重组的h5n6禽流感病毒，以高致病性h5n6亚型禽流感病毒 a/duck/fujian/s1424/2020(h5n6)为表面抗原血凝素(ha)和神经氨酸酶(na)基因供体，但ha裂解位点具有典型低致病性禽流感病毒分子特征(-retr-)；以流感病毒鸡胚高滴度适应株a/pr/8/34(h1n1)为pb2，pb1，pa，np，m和ns共6个内部基因的供体，通过反向遗传操作方法，人工重组得到了1株重组的h5n6禽流感病毒，命名为a型流感病毒 a/harbin/h5-re13/2021(h5n6)(简称为h5-re13株)，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址在中国武汉的武汉大学，其保藏号为cctcc no：v202159，保藏时间为2021年8月3 日。
7.本发明选用流感病毒的可在鸡胚内生长至很高滴度的实验室鸡胚适应株a/pr/8/34 (h1n1)的6个内部基因作为骨架基因，并选用2020年分离得到的高致病性禽流感病毒株 a/duck/fujian/s1424/2020(h5n6)的ha和na基因作为表面基因，利用反向遗传学人工构建
方法，制备了致弱的重组病毒h5-re13株，该重组毒株将可作为h5n6流感的疫苗株。
8.实验证实，h5-re13株病毒与我国h5n6禽流感病毒流行株a/duck/fujian/s1424/2020 (h5n6)抗原性一致，制备疫苗免疫鸡后将对h5n6流感病毒流行株 a/duck/fujian/s1424/2020(h5n6)的攻击产生良好的特异保护效果。该病毒含有流感病毒鸡胚高滴度适应株a/pr/8/34(h1n1)的6个内部基因，因此具有良好的鸡胚适应性，病毒生长滴度与野毒相比，可提高10倍以上；以此为疫苗株生产疫苗，可大大降低疫苗生产成本，提高疫苗质量。
9.进一步地，本发明还提出了所述的重组的h5n6禽流感病毒(h5-re13株)在制备预防 h5n6流感病毒所导致疾病的药物中的应用。
10.进一步地，所述h5n6流感病毒为a/duck/fujian/s1424/2020(h5n6)毒株。
11.更进一步地，本发明还提出了一种构建所述的重组h5n6禽流感病毒的方法，该方法包括：
12.(1)使用ha基因特异性扩增和突变引物，利用rt-pcr方法，扩增出高致病性h5n6 亚型禽流感病毒a/duck/fujian/s1424/2020(h5n6)的ha1和ha2基因片段，在扩增ha1片段的同时将ha基因裂解位点氨基酸由-rerrrkr-突变为-retr-，使其由高致病性禽流感病毒分子特征突变为典型低致病性禽流感病毒分子特征；再利用重叠延伸反应，扩增出裂解位点为典型低致病性流感病毒分子特征的ha片段，插入pbd质粒，构建重组ha基因双向转录载体；
13.(2)利用rt-pcr方法，扩增出h5n6亚型禽流感病毒a/duck/fujian/s1424/2020(h5n6) 的na基因全基因片段，插入pbd质粒，构建重组na基因双向转录载体；
14.(3)将(1)、(2)所述构建的ha、na基因2个重组pbd双向转录载体质粒和含有流感病毒鸡胚高滴度适应株a/pr/8/34(h1n1)的pb2、pb1、pa、np、m、ns基因的6个pbd 双向转录载体质粒混合，并与转染试剂一起接种293t细胞，将培养后收获的细胞及上清接种鸡胚，获得具有ha活性的h5n6禽流感rh5n6-2/6重组病毒株。得到的重组病毒ha和 na来自于高致病性h5n6流感病毒国内分离株a/duck/fujian/s1424/2020(h5n6)，但ha裂解位点呈典型低致病性禽流感病毒分子特征(-retr-)，6个内部基因pb2、pb1、pa、 np、m及ns来自流感病毒鸡胚高滴度适应株a/pr/8/34(h1n1)。
15.进一步地，扩增ha1基因的引物对如seq id no.9和seq id no.10所示，其中seqid no.10为ha裂解位点的突变引物；扩增ha2基因的引物对如seq id no.11和seq idno.12所示。
16.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
17.1、h5-re13与我国h5n6禽流感病毒流行株a/duck/fujian/s1424/2020(h5n6)抗原性一致，制备疫苗免疫鸡后将对h5n6流感病毒流行株a/duck/fujian/s1424/2020(h5n6)的攻击产生良好的特异保护效果。该病毒含有流感病毒鸡胚高滴度适应株a/pr/8/34(h1n1)的6个内部基因，因此具有良好的鸡胚适应性，病毒生长滴度与野毒相比，可提高10倍以上；以此为疫苗株生产疫苗，可大大降低疫苗生产成本，提高疫苗质量。
18.2、通过对ha基因裂解位点人工修饰，h5-re13株病毒具有典型低致病性流感病毒的分子特征，h5-re13株重组病毒对鸡胚和鸡均无致病性，生物安全性高。
ace rtkit)购自日本toyobo公司；ex-taq酶购自takara公司；pcr产物纯化试剂盒(cycle
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pure-kit)购自omega公司；胶回收试剂盒(wizard sv gel and pcr clean-up system)购自 promega公司；测序试剂盒(abi bigdye terminator v3.1)购自美国thermo fisher公司；质粒提取试剂盒(qiagen plasmid midi kit)购自qiagen公司。
32.5.引物
33.分析比较，设计合成h5n6流感分离株dk/fj/s1424/20(h5n6)ha1、ha2和na基因的特异性引物，合成引物序列见表1。
34.表1 h5n6禽流感病毒dk/fj/s1424/20(h5n6)的ha和na基因特异性引物序列
[0035][0036]
分析比较，设计合成a/pr/8/34(h1n1)的pb2、pb1、pa、np、m、ns基因的特异性引物，合成引物序列见表2。
[0037]
表2 流感病毒a/pr/8/34(h1n1)的6个内部基因片段的特异性引物序列
[0038][0039]
实施例1：重组h5n6流感病毒h5-re13的制备与鉴定
[0040]
1.重组病毒2个表面基因(ha和na)的构建和鉴定：
[0041]
提取h5n6亚型高致病性禽流感分离株dk/fj/s1424/20(h5n6)的rna，并将其反转录为cdna，使用ha基因的ha1片段特异性引物(ha1-u：atg gag aaa ata gta ctt ctt ctt t； ha1-l：gct cca aac agt cct cta gtt tcc ctt aga gga cta ttt ctg agc，其中ha1-l为突变ha裂解位点为低致病性病毒分子特征的引物)和ha2片段特异性引物(ha2-u：act aga gga ctg ttt ggagct ata gca gga t；ha2-l：tta aat gca aat tct gca ttg taa c)，利用rt-pcr方法，分别扩增出ha 基因的ha1和ha2片段(图1中a)，并在扩增ha1基因片段的同时对ha裂解位点进行致弱突变修饰；然后以ha1、ha2为模板，ha1-u/ha2-l为引物，用phusion高保真聚合酶进行重叠延伸反应(soe-pcr)，扩增出裂解位点呈典型低致病性禽流感病毒分子特征(
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retr-)的ha片段(图1中a)。并将其克隆于pbd载体中，构建成pbd-ha重组质粒。
[0042]
ha基因裂解位点的突变引物(ha1-l)根据ha基因多个连续碱性氨基酸位点的特异性序列设计，扩增后的ha基因裂解位点由-rerrrkr-突变为-retr-，使其由高致病性禽流感病毒分子特征突变为典型低致病性禽流感病毒分子特征(图2)。
[0043]
再利用rt-pcr方法，扩增上述高致病性h5n6毒株的na基因全长(图1中a)，按上述
方法插入pbd载体中，构建成pbd-na重组质粒。
[0044]
2.重组病毒的拯救：
[0045]
利用脂质体转染法，将上述ha、na基因2个重组质粒和含有a/pr/8/34(h1n1)病毒内部基因的pbd-pb2、pbd-pb1、pbd-pa、pbd-np、pbd-m、pbd-ns等6个重组质粒同时导入单层的293t细胞，48小时后收获细胞及上清，接种9～11日龄鸡胚尿囊腔，48小时后收获尿囊液并检测血凝(ha)活性。ha阳性样品即为救获的h5n6亚型低致病性重组病毒，将获得的重组病毒命名为a/harbin/h5-re13/2021(h5n6)，株号为h5-re13，保藏于位于中国武汉的武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏号为cctcc no：v202159。
[0046]
3.重组病毒的序列鉴定
[0047]
提取重组病毒h5-re13的rna，利用rt-pcr方法，分别扩增出重组病毒h5-re13全基因组的8个片段，对pcr产物进行核酸凝胶电泳(图1中b)，胶回收后测定每一片段的特定序列。
[0048]
h5-re13株ha基因序列如seq id no.1所示，h5-re13株na基因序列如seq idno.2所示，h5-re13株pb2基因序列如seq id no.3所示，h5-re13株pb1基因序列如 seq id no.4所示，h5-re13株pa基因序列如seq id no.5所示，h5-re13株np基因序列如seq id no.6所示，h5-re13株m基因序列如seq id no.7所示，h5-re13株ns基因序列如seq id no.8所示。
[0049]
利用dnastar软件(dnastar lasergene v7.1)，对测定的序列与野生毒株h5n6流感病毒国内分离株dk/fj/s1424/20(h5n6)和流感病毒a/pr/8/34(h1n1)的序列进行序列比较，发现重组病毒h5-re13的ha和na来自于高致病性h5n6流感病毒国内分离株 dk/fj/s1424/20(h5n6)，但ha裂解位点呈典型低致病性流感病毒分子特征(-retr-)；6 个内部基因pb2、pb1、pa、np、m及ns来自于鸡胚高度适应性的流感病毒 a/pr/8/34(h1n1)。
[0050]
4.重组病毒h5-re13生长曲线的测定
[0051]
禽流感疫苗常用鸡胚生产，要求疫苗株在接种的鸡胚中具有良好的生长特性。本研究进行h5-re13株病毒在鸡胚中的生长特性研究。将亲本病毒h5n6流感病毒流行株 dk/fj/s1424/20(h5n6)和重组病毒h5-re13接种2组spf鸡胚各20枚，在最适36℃条件下分别培养24、48、72和96小时，分别取上述培养不同时间的各5枚鸡胚进行血凝测定，检测亲本毒株dk/fj/s1424/20(h5n6)和重组病毒h5-re13的生长曲线。
[0052]
从试验结果可以看出重组病毒在36℃培养条件下，重组病毒的血凝效价远高于野生毒株h5n6流感病毒国内分离株a/duck/fujian/s1424/2020(h5n6)，72h时平均血凝效价最高 (9log2，即1:512)，较野生病毒的平均最高血凝价(5.6log2，即1:48.5)高出10.6倍(图 3)。这说明本发明制备出了一株高生长滴度的重组病毒，将为以后的疫苗批量生产带来巨大的经济利益。
[0053]
5.重组病毒h5-re13的抗原性分析
[0054]
抗原性是病毒是否可以作为疫苗株的关键指标。本研究将亲本h5n6流感病毒国内分离株dk/fj/s1424/20(h5n6)与人工重组的h5n6流感病毒灭活后制备油乳剂灭活疫苗，免疫 spf鸡制备抗血清，使用hi试验进行抗原性分析，hi试验方法参考高致病性禽流感诊断技术国家标准(gb)(gb/t118936-2020))。hi试验结果显示，亲本h5n6流感病毒国内分离株 dk/fj/s1424/20(h5n6)与人工重组的h5n6流感病毒与对应血清之间的交叉hi滴度无差异，表明h5n6病毒重组为鸡胚适应性的h5-re13株后，病毒依然保持着亲本毒株的抗原性 (见
表3)。
[0055]
表3：亲本毒株dk/fj/s1424/20(h5n6)与重组病毒h5-re13株的抗原性分析
[0056][0057]
6.重组病毒h5-re13株对鸡胚和鸡的致病力试验
[0058]
疫苗毒株的低致病性是具有生物安全性的前提条件。9～11日龄spf鸡胚和4～8周龄 sfp鸡经常作为禽流感病毒致病性评估模型。
[0059]
为了解重组毒株的致病性，本发明首先使用spf鸡胚进行病毒致病性的评估。9日龄的 spf鸡胚(购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所/国家禽类实验动物资源库)20枚，随机分为 2组，每组10枚，第一组通过尿囊腔接种10-4
倍稀释的重组h5-re13株病毒液，第二组通过尿囊腔接种10-4
倍稀释的亲本毒株dk/fj/s1424/20(h5n6)的病毒液。接种后72小时内观察和记录鸡胚死亡情况。
[0060]
本发明同时使用spf鸡进行病毒致病性和感染能力的评估。6周龄的spf鸡20只，随机分为2组，每组10只，将重组毒株h5-re13和亲本毒株dk/fj/s1424/20(h5n6)尿囊液分别稀释10倍后，静脉途径接种6周龄spf鸡，接种后每日观察发病死亡情况，连续观察10 日，计算鸡静脉内接种致病指数(ivpi)。若ivpi大于1.2，则表明该毒株为高致病性毒株；若ivpi小于1.2，ha裂解位点为高致病性禽流感病毒分子特征，则为高致病性禽流感毒株；若ivpi小于1.2，ha裂解位点为低致病性流感病毒分子特征，则为低致病性禽流感毒株。
[0061]
6周龄的spf鸡20只，随机分为2组，每组10只，将重组毒株h5-re13和亲本毒株 dk/fj/s1424/20(h5n6)尿囊液分别稀释至106eid
50
/ml后，分别鼻腔途径接种6周龄spf鸡各10只，0.1ml/只。接种后每日观察发病死亡情况，连续观察14日，同时采集喉头和泄殖腔拭子进行病毒滴定，评估病毒对鸡的感染能力。
[0062]
所有的试验鸡均在拥有独立通风系统的负压隔离器里饲养，所有涉及h5n6高致病性病毒的试验均在生物安全三级实验室内进行。
[0063]
spf鸡胚致病试验结果显示，接种亲本毒株dk/fj/s1424/20(h5n6)病毒液的鸡胚在接种后26～30小时内全部发病死亡，接种重组毒株h5-re13株病毒液的所有鸡胚在接种后72 小时内均全部存活，表明h5-re13株重组病毒对鸡胚无致病性。
[0064]
spf鸡静脉内接种致病指数(ivpi)测定试验结果显示，接种亲本毒株 dk/fj/s1424/20(h5n6)病毒液的鸡在接种后1日内全部发病死亡，其ivpi为3.0；接种重组毒株h5-re13株病毒液的所有鸡10日内均无任何不良反应发生，构建的h5-re13株重组病毒ivpi为0(见表4)。表明h5-re13株重组病毒为低致病性毒株，对鸡无致病性。
[0065]
spf鸡鼻腔感染试验结果显示，鼻腔接种亲本毒株dk/fj/s1424/20(h5n6)病毒液的所有鸡在接种后2～3日内全部发病死亡；而鼻腔接种重组毒株h5-re13株病毒液的所有鸡在14 日观察期内均无任何不良反应发生；感染dk/fj/s1424/20(h5n6)病毒死亡的所有鸡喉头和泄殖腔拭子病毒检测均呈阳性，而感染h5-re13株重组病毒的鸡在3日和5日拭子样品病毒检测均为阴性，表明h5-re13株重组病毒为对鸡无感染和致病能力(见表4)。
[0066]
以上结果表明，h5-re13株重组病毒对鸡胚和鸡均无致病性，生物安全性高。
[0067]
表4 h5-re13株重组病毒的致病性和感染能力测定
[0068][0069]
*该组鸡在攻毒后2～3日内全部发病死亡，所有死亡鸡均排毒均计入攻毒后3日排毒结果；/该组鸡在攻毒后5日无存活。
[0070]
7.重组病毒h5-re13株的免疫原性评估
[0071]
将ha价为8log2的重组病毒h5-re13株以0.2％甲醛灭活后，以美国sornneborn品牌
‑ꢀ
40(lytol)白油为佐剂制备油乳剂灭活疫苗，以10只3周龄的spf鸡为模型动物，0.3ml/只肌肉注射免疫，同时设10只不免疫对照鸡。免疫后21日检测所有鸡血清中hi抗体滴度，同时以100cld
50
(cld50为鸡半数致死量)的剂量攻击dk/fj/s1424/20(h5n6)强毒，攻毒后观察14日，观察存活情况，并在攻毒后3日和5日采集喉头和泄殖腔拭子，接种鸡胚检测排毒情况。死亡鸡拭子样品随时采集。
[0072]
结果显示，免疫21日时免疫鸡血清中针对重组病毒h5-re13株的hi抗体滴度在 7.0log2～10.0log2之间，平均滴度为8.1log2，而对照鸡血清针对重组病毒h5-re13株的hi 抗体滴度均＜2.0log2(hi＜2log2判定为hi抗体阴性)；免疫后21日以鼻腔感染途径攻击 dk/fj/s1424/20(h5n6)强毒后14日内，所有免疫鸡健活，攻毒后3日和5日拭子样品病毒检测均为阴性；而对照鸡在攻毒后2～4日全部发病死亡，而且死亡鸡喉头和泄殖腔拭子样品病毒分离结果均为阳性(见表5)。
[0073]
表5 h5-re13株重组病毒制备疫苗免疫鸡后hi抗体和攻毒后存活及排毒情况
[0074][0075]
*该组鸡在攻毒后2～4日全部发病死亡，所有死亡鸡均检测排毒，排毒结果计入攻毒后3日排毒结果；/该组鸡在攻毒后5日无存活鸡。
[0076]
以上结果表明，人工重组h5n6流感病毒h5-re13株具有良好的免疫原性，能够预防 h5n6亚型禽流感。