一种3-甲基-4-硝基苯甲酸的工程菌及其制备方法与流程

1.本发明涉及一种利用微生物制备3-甲基-4-硝基苯甲酸的方法，属于生物化工技术领域。


背景技术：

2.3-甲基-4-硝基苯甲酸是一种用途广泛的化工产品，许多重要的有机产品均是以它为原料获得的，如4-氯喹唑啉-6-甲酸乙酯、2-正丙基-4-甲基-6-羧基苯并咪唑、4-甲基-2-乙基-1h-苯并咪唑-6-甲酸甲酯、3,4-二氢-4-喹唑啉酮-6-甲酸、4-氨基苯基-1,3-二甲酸、4-氨基-3-甲基苯甲酸甲酯、4-硝基苯基-1,3-二甲酸等；另外3-甲基-4-硝基苯甲酸还用于医药，是合成抗高血压药物替米沙坦、艾滋病药物的重要中间体。
3.合成3-甲基-4-硝基苯甲酸的方法主要有空气氧化法、醋酸钴催化氧化法、重铬酸钾氧化法、硝酸氧化法等，收率约30％-86％。《应用化学》2005年第12期岳彩波、魏运洋等在《催化分子氧氧化合成3-甲基-4-硝基苯甲酸》一文中以分子氧作为氧化剂，在醋酸钴催化剂体系(醋酸钴/丁酮/乙酸)中加入助催化剂溴化钠，3-甲基-4-硝基苯甲酸的收率为51%；中国专利 cn200610107316.6《一种催化剂及其在合成4-硝基-3-甲基苯甲酸反应中的应用中》一文中以过渡金属氧化物和一种n上有溴或者羟基取代的含n有机化合物组成的催化剂，在溶剂条件下催化氧化2,4-二甲基硝基苯合成3-甲基-4-硝基苯甲酸，收率为51%。中国专利cn103319347a《阶梯式加热法与间接电合成3-甲基-4-硝基苯甲酸的方法》首先将硫酸铬电解氧化为三氧化铬，在用三氧化铬将2,4-二甲基硝基苯氧化成3-甲基-4-硝基苯甲酸；通过采用阶梯式加热法，转化率达到了65%-86%，但其催化剂、氧化剂价格昂贵，催化剂回收等后处理难度大，生产费用及环保处理费用较高；硝酸氧化法氧化性较强，容易氧化产生双硝基的产物，但硝化过程存在较高的安全隐患，并且硝酸对环境污染严重。
4.目前报道的3-甲基-4-硝基苯甲酸的生产方法均为化学法进行合成，未见微生物催化工艺的报道。


技术实现要素：

5.发明目的：提供一种适合工业化生产的微生物法制备3-甲基-4-硝基苯甲酸工艺。
6.实验中发现，用于生产5-甲基吡嗪-2-羧酸的重组大肠杆菌菌株（该菌株重组了来源于恶臭假单胞菌(pseudomonas putida)atcc 33015的二甲苯单加氧酶xmo编码基因xylma、苯甲醇脱氢酶badh编码基因xylb和苯甲醛脱氢酶bzdhh编码基因xylc）能够以2,4-二甲基硝基苯为底物（式1化合物），以氧气为氧化剂，在一定的条件下催化得到3-甲基-4-硝基苯甲酸（式4化合物），产品质量收率最高在12%。具体实验过程如下：取表达了二甲苯单加氧酶、苯甲醇脱氢酶、苯甲醛脱氢酶的基础重组大肠杆菌工程菌（菌种保藏编号为：cgmcc no.14930），在lb 液体培养基中，37℃振荡培养20h后，取出菌液，10000 r/m离心15 min收集菌体，用1/50-1/10原始发酵液体积的ph为8的磷酸盐缓冲液将菌体进行重悬，得到全细胞酶液。该全细胞酶液以2,4-二甲基硝基苯为底物在一定的条件下进行催化反应，经hplc
检测，有3-甲基-4-硝基苯甲酸产物生成。催化反应液经硅藻土过滤后、清液加浓盐酸酸沉、过滤得到粗品，用乙酸乙酯萃取，旋蒸得产物3-甲基-4-硝基苯甲酸，底物转化率12%，产品含量98.5%，纯度99.8%。其催化过程如下所示：。
7.鉴于以上实验转化率低，申请人尝试对上述重组大肠杆菌工程菌进行了改进，获得了本发明技术方案，具体如下。
8.利用一种基于易错pcr技术的酶体外进化技术，以含有苯甲醇脱氢酶badh编码基因xylb的重组质粒prsfduet-1-xylb为模板，使用易错pcr技术进行定向进化，经过大量筛选获得酶活单位明显提高的突变株。经检测突变菌株为苯甲醇脱氢酶发生突变，突变的重组菌株能够将底物转化率由12%提高至80%以上。
9.本发明技术方案为：一种重组大肠杆菌菌株，为 e.coli bl21-prsfduet-1-l163w，其核苷酸序列如seq id no: 3所示，其对应的氨基酸序列如seq id no: 4所示。
10.本发明所述重组大肠杆菌菌株的制备方法，包括以下步骤：第一步 含改进的苯甲醇脱氢酶编码基因的重组大肠杆菌制备：以含有苯甲醇脱氢酶badh编码基因xylb的重组质粒prsfduet-1-xylb为模板，使用易错pcr技术进行定向进化。根据《分子克隆实验指南》，具体地为经过pcr反应后，获得含有线性基因片段的pcr产物，将这些pcr产物和prsfduet-1表达质粒分别进行双酶切（ecori、not i）、纯化、连接和转化已含有二甲苯单加氧酶xmo编码基因xylma和苯甲醛脱氢酶bzdhh编码基因xylc的基础大肠杆菌感受态细胞，涂布于含有50 mg/l 硫酸卡那霉素的lb琼脂平皿中，37℃培养过夜。
11.第二步 挑取上述培养皿上长出的单菌落接种于含有硫酸卡那霉素的lb 液体培养基中，37℃振荡培养15 h，离心收集菌体进行质粒提取、pcr 鉴定和双酶切鉴定，并将含有正确的重组质粒的大肠杆菌进行诱导表达，具体操作为：将上述菌液转接于100 ml含50 μg/ml 硫酸卡那霉素的lb 液体培养基中，37℃振荡培养20h后，取出菌液，10000 r/m离心15 min收集菌体，用1/50-1/10原始发酵液体积的ph为8的磷酸盐缓冲液将菌体进行重悬，得到全细胞酶液。该全细胞酶液用于催化验证试验，得到一株酶活力有明显提高的重组大肠杆菌菌株，命名为e.coli bl21-prsfduet-1-l163w，其核苷酸序列如seq id no: 3所示，其对应的氨基酸序列如seq id no: 4所示。
12.本发明的另一个发现是，所述重组大肠杆菌菌株在制备3-甲基-4-硝基苯甲酸方面的应用，具体包括如下步骤步骤1.将上述第二步所得重组大肠杆菌在发酵培养基中进行扩增培养，离心得静息细胞；本步骤中，所述发酵培养基配方：一水合葡萄糖1.0-3.2g/l，酵母浸粉2.0-4.6 g/l，一水合柠檬酸1 g/l，硫酸铵2.5 g/l，十二水合磷酸氢二钠14.4 g/l。发酵过程中补加灭菌的葡萄糖溶液。
13.步骤2.收集步骤1所得静息细胞，按一定比例将其悬浮在缓冲液中，并加入底物2,4-二甲基硝基苯，得到催化反应液，在温度10～55℃、ph为6.5～9.5的缓冲溶液中，用碱性溶液维持ph稳定，压缩空气通气量0.4-8 l/min，反应生成3-甲基-4-硝基苯甲酸，所述底物、静息细胞的投料质量比为1：0.5-5。利用hplc检测反应进程，反应结束后过滤、酸沉，萃取，旋蒸得到产物3-甲基-4-硝基苯甲酸。
14.本步骤中，反应液底物浓度为8-20 g/l；底物与静息细胞的质量比为1:0.5-5，优选0.8-2；本步骤中，缓冲液为磷酸盐缓冲溶液、硼酸盐缓冲溶液或者生理盐水或者纯化水；本步骤中，催化反应温度可以为15～50℃，优选为20-30℃；本步骤中，催化反应ph可以为6.5
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9.5，优选为8.0
‐
8.5；本步骤中，催化反应维持ph稳定的碱性溶液为氨水溶液、氢氧化钠溶液中的一种；本步骤中，催化反应，以4l催化体系的压缩空气通入量为0.4-5 l/min。
15.有益效果：本发明提供了一种微生物法制备生产3-甲基-4-硝基苯甲酸的工艺，克服了现有技术中催化剂、氧化剂价格昂贵或者污染严重或者生产工艺存在安全隐患的问题。具体的，本发明解决了化学法中催化剂、价格昂贵，对环境不友好的问题；解决了化学法中硝酸氧化法污染严重与工艺过程中存在安全隐患的问题；通过易错pcr技术的酶体外进化技术，获得含有苯甲醇脱氢酶badh新突变的菌株，能够显著提高催化反应的转化率；本发明首次实现了利用微生物制备3-甲基-4-硝基苯甲酸的工艺方法，并且工艺步骤简单、反应条件温和、对环境友好。
附图说明
16.图1.实施例8重组大肠杆菌发酵生长曲线图2. 实施例8酶催化反应曲线图3. 实施例8产物液相图谱
具体实施方式
17.下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明并不限于以下实施例。实施例中采用的实施条件可以根据具体使用的不同要求做进一步调整，未注明的实施条件为常规实验中的条件。
18.实施例1. 应用基础重组大肠杆菌制备3-甲基-4-硝基苯甲酸(1)取出在
‐
80℃下保藏的含有二甲苯单加氧酶、苯甲醇脱氢酶、苯甲醛脱氢酶重组大肠杆菌工程菌（菌种保藏编号为：cgmcc no.14930，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2017年11月20日。本发明生物材料的分类命名的拉丁文名称为：escherichie coli。），在luria-bertani（lb）琼脂培养基上进行接种，之后于37℃培养过夜；(2)挑取lb琼脂平板上的单克隆菌落，并将其接种于lb液体培养基中，之后于37℃培养过夜；(3)从过夜培养后的lb液体培养基中取适量菌液，接种于改进的m9液体培养基中，
于37℃培养8h，之后接种于发酵培养基中，于37℃培养至od 600 为90左右，离心收集菌体，用生理盐水洗涤两次，得到静息细胞；在37℃培养的过程中可以视情况添加灭菌的葡萄糖溶液。
19.表1 发酵培养基配方。
20.表2 补料培养基配方。
21.(4)在发酵罐中加入4l ph为8的磷酸盐缓冲液，向其中加入36.0g 2,4-二甲基硝基苯，100.8g静息细胞得到催化反应液，催化条件设定搅拌300rpm，温度20℃，通气量2l/min，并用氨水溶液控制催化反应液ph稳定在8.0左右。每隔3h取样进行hplc检测原料转化情况，原料不再进行转化停止催化。
22.(5)催化反应液经硅藻土过滤后、清液加浓盐酸酸沉、过滤得到粗品，用乙酸乙酯萃取，旋蒸得产物3-甲基-4-硝基苯甲酸。
23.底物2,4-二甲基硝基苯转化率12%，所得产物经hplc检测：含量98.5%，纯度99.8%。
24.实施例2. 含改进的苯甲醇脱氢酶编码基因的重组大肠杆菌的构建与筛选以含苯甲醇脱氢酶基因的重组质粒为模板，并用primer 5.0设计并合成两端引物（表3），使用易错pcr技术（物料及浓度见表4，反应条件见表5），根据《分子克隆实验指南》，经过pcr反应后，获得含有线性基因片段的pcr产物，将这些pcr产物和pet28a( )表达质粒分别进行双酶切（ecori、not i）、纯化、连接和转化已含有二甲苯单加氧酶xmo编码基因xylma和苯甲醛脱氢酶bzdhh编码基因xylc的基础大肠杆菌感受态细胞，涂布于含有50 mg/l 硫酸卡那霉素的lb琼脂平皿中，37℃培养过夜。
25.表3随机突变引物序列。
26.表450 μl易错pcr物料体系
。
27.表5易错pcr反应条件。
28.挑取上述培养皿上长出的单菌落接种于含有50 μg/ml硫酸卡那霉素的lb 液体培养基中，37℃振荡培养15 h，离心收集菌体进行质粒提取、pcr 鉴定和双酶切鉴定（使用琼脂糖凝胶电泳进行检测），将正确的重组质粒命名为prsfduet-1-a-w，并将含有正确的重组质粒的大肠杆菌进行诱导表达，具体操作为：将上述菌液转接于100 ml含50 μg/ml 硫酸卡那霉素的lb 液体培养基中，37℃振荡培养20h后，取出菌液，10000 r/m离心15 min收集菌体，用1/50-1/10原始发酵液体积的ph为8的磷酸盐缓冲液将菌体进行重悬，得到全细胞酶液。该全细胞酶液用于催化验证试验，得到一株酶活力有明显提高的突变型菌株，命名为e.coli bl21
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prsfduet-1-l163w，突变前其对应的核苷酸序列如seq id no:1所示，其对应的氨基酸序列如seq id no:2所示，突变后其对应的核苷酸序列如seq id no:3所示，其对应的氨基酸序列如seq id no:4所示。
29.实施例3. 应用改进的重组大肠杆菌（含苯甲醇脱氢酶l163w突变体）制备3-甲基-4-硝基苯甲酸采用含有苯甲醇脱氢酶的突变体l163w的重组大肠杆菌工程菌进行高密度发酵培养，培养方式同实施例1，按照如下步骤进行催化、提取：（1）在发酵罐中加入4l，ph为9.5的生理盐水，向其中加入48.0g 2,4-二甲基硝基苯，96.0 g静息细胞得到催化反应液，催化条件设定搅拌300rpm，温度45℃，通气量0.5l/min，并用氨水溶液控制催化反应液ph稳定在9.5左右。每隔3h取样进行hplc检测原料转化情况，原料不再进行转化停止催化。
30.（2）催化反应液经硅藻土后过滤、清液加浓盐酸酸沉、过滤得到粗品，用乙酸乙酯萃取、合并有机相，旋蒸得产物3-甲基-4-硝基苯甲酸。
31.底物2,4-二甲基硝基苯转化率80.2%，所得产物经hplc检测：含量94.8%，纯度97.3%。
32.实施例4. 应用改进的重组大肠杆菌（含苯甲醇脱氢酶l163w突变体）制备3-甲基-4-硝基苯甲酸采用含有苯甲醇脱氢酶的突变体l163w的重组大肠杆菌工程菌进行高密度发酵培养，培养方式同实施例1，按照如下步骤进行催化、提取：（1）在发酵罐中加入4l，ph为6.5的生理盐水，向其中加入32.0g 2,4-二甲基硝基苯，160.0 g静息细胞得到催化反应液，催化条件设定搅拌300rpm，温度15℃，通气量4 l/min，并用氨水溶液控制催化反应液ph稳定在6.5左右。每隔3h取样进行hplc检测原料转化情况，原料不再进行转化停止催化。
33.（2）催化反应液经硅藻土后过滤、清液加浓盐酸酸沉、过滤得到粗品，用乙酸乙酯萃取、合并有机相，旋蒸得产物3-甲基-4-硝基苯甲酸。
34.底物2,4-二甲基硝基苯转化率81.26%，所得产物经hplc检测：含量97.8%，纯度98.4%。
35.实施例5. 应用改进的重组大肠杆菌（含苯甲醇脱氢酶l163w突变体）制备3-甲基-4-硝基苯甲酸采用含有苯甲醇脱氢酶的突变体l163w的重组大肠杆菌工程菌进行高密度发酵培养，培养方式同实施例1，按照如下步骤进行催化、提取：（1）在发酵罐中加入4l，ph为8.0的生理盐水，向其中加入60.0g 2,4-二甲基硝基苯，120.0g静息细胞得到催化反应液，催化条件设定搅拌300rpm，温度30℃，通气量2.5 l/min，并用氨水溶液控制催化反应液ph稳定在8.0左右。每隔3h取样进行hplc检测原料转化情况，原料不再进行转化停止催化。
36.（2）催化反应液经硅藻土后过滤、清液加浓盐酸酸沉、过滤得到粗品，用乙酸乙酯萃取、合并有机相，旋蒸得产物3-甲基-4-硝基苯甲酸。
37.底物2,4-二甲基硝基苯转化率83.8%，所得产物经hplc检测：含量97.8%，纯度99.0%。
38.实施例6. 应用改进的重组大肠杆菌（含苯甲醇脱氢酶l163w突变体）制备3-甲基-4-硝基苯甲酸采用含有苯甲醇脱氢酶的突变体l163w的重组大肠杆菌工程菌进行高密度发酵培养，培养方式同实施例1，按照如下步骤进行催化、提取：（1）在发酵罐中加入4l，ph为8.5的生理盐水，向其中加入80.0g 2,4-二甲基硝基苯，40.0 g静息细胞得到催化反应液，催化条件设定搅拌300rpm，温度20℃，通气量3 l/min，并用氨水溶液控制催化反应液ph稳定在8.2左右。每隔3h取样进行hplc检测原料转化情况，原料不再进行转化停止催化。
39.（2）催化反应液经硅藻土后过滤、清液加浓盐酸酸沉、过滤得到粗品，用乙酸乙酯萃取、合并有机相，旋蒸得产物3-甲基-4-硝基苯甲酸。
40.底物2,4-二甲基硝基苯转化率81.6%，所得产物经hplc检测：含量95.8%，纯度99.1%。
41.实施例7. 应用改进的重组大肠杆菌（含苯甲醇脱氢酶l163w突变体）制备3-甲基-4-硝基苯甲酸采用含有苯甲醇脱氢酶的突变体l163w的重组大肠杆菌工程菌进行高密度发酵培
养，培养方式同实施例1，按照如下步骤进行催化、提取：（（1）在发酵罐中加入4l，ph为8.5的磷酸盐缓冲液，向其中加入65.6 g 2,4-二甲基硝基苯，100.0 g静息细胞得到催化反应液，催化条件设定搅拌300rpm，温度25℃，通气量3 l/min，并用氢氧化钠溶液控制催化反应液ph稳定在8.5左右。每隔3h取样进行hplc检测原料转化情况，原料不再进行转化停止催化。
42.（2）催化反应液经硅藻土后过滤、清液加浓盐酸酸沉、过滤得到粗品，用乙酸乙酯萃取、合并有机相，旋蒸得产物3-甲基-4-硝基苯甲酸。
43.底物2,4-二甲基硝基苯转化率86%，所得产物经hplc检测：含量98.0%，纯度99.3%。
44.实施例8. 应用改进的重组大肠杆菌（含苯甲醇脱氢酶l163w突变体）制备3-甲基-4-硝基苯甲酸采用含有苯甲醇脱氢酶的突变体l163w的重组大肠杆菌工程菌进行高密度发酵培养，培养方式同实施例1，按照如下步骤进行催化、提取：（1）在发酵罐中加入4l，ph为8.5的磷酸盐缓冲液，向其中加入65.6 g 2,4-二甲基硝基苯，65.6 g静息细胞得到催化反应液，催化条件设定搅拌300rpm，温度25℃，通气量3 l/min，并用氨水溶液控制催化反应液ph稳定在8.5左右。每隔3h取样进行hplc检测原料转化情况，原料不再进行转化停止催化。
45.（2）催化反应液经硅藻土后过滤、清液加浓盐酸酸沉、过滤得到粗品，用乙酸乙酯萃取、合并有机相，旋蒸得产物3-甲基-4-硝基苯甲酸。
46.底物2,4-二甲基硝基苯转化率89%，所得产物经hplc检测：产品含量98.5%，纯度99.8%。
47.实施例9. 应用改进的重组大肠杆菌（含苯甲醇脱氢酶l163w突变体）制备3-甲基-4-硝基苯甲酸采用含有苯甲醇脱氢酶的突变体l163w的重组大肠杆菌工程菌进行高密度发酵培养，培养方式同实施例1，按照如下步骤进行催化、提取：（1）在发酵罐中加入8l，ph为8.5的磷酸盐缓冲液，向其中加入131.2g 2,4-二甲基硝基苯，131.2 g静息细胞得到催化反应液，催化条件设定搅拌300rpm，温度30℃，通气量8l/min，并用氨水溶液控制催化反应液ph稳定在8.5左右。每隔3h取样进行hplc检测原料转化情况，原料不再进行转化停止催化。
48.（2）催化反应液经硅藻土后过滤、清液加浓盐酸酸沉、过滤得到粗品，用乙酸乙酯萃取、合并有机相，旋蒸得产物3-甲基-4-硝基苯甲酸。
49.底物2,4-二甲基硝基苯转化率88%，所得产物经hplc检测：含量98.4%，纯度99.3%。
50.实施例10. 应用改进的重组大肠杆菌（含苯甲醇脱氢酶l163w突变体）制备3-甲基-4-硝基苯甲酸采用含有苯甲醇脱氢酶的突变体l163w的重组大肠杆菌工程菌进行高密度发酵培养，培养方式同实施例1，按照如下步骤进行催化、提取：（1）在发酵罐中加入40 l，ph为8.5的磷酸盐缓冲液，向其中加入984 g 2,4-二甲基硝基苯，984g静息细胞得到催化反应液，催化条件设定搅拌300rpm，温度30℃，通气量30l/min，并用氨水溶液控制催化反应液ph稳定在8.5左右。每隔3h取样进行hplc检测原料转化情况，原料不再进行转化停止催化。
51.（2）催化反应液经硅藻土后过滤、清液加浓盐酸酸沉、过滤得到粗品，用乙酸乙酯萃取、合并有机相，旋蒸得产物3-甲基-4-硝基苯甲酸。
52.底物2,4-二甲基硝基苯转化率89%，所得产物经hplc检测：含量98.5%，纯度99.5%。
53.序列表 《110》
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迪嘉药业集团有限公司《120》
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一种3-甲基-4-硝基苯甲酸的工程菌及其制备方法《130》
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20210622《160》
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4《170》
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patentin version 3.5《210》seq id no:1《211》
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1107《212》
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dna《213》pseudomonas putida《400》
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