用于细胞聚集体的细胞贮存和运输介质及运输系统和方法与流程

用于细胞聚集体的细胞贮存和运输介质及运输系统和方法
1.相关申请的交叉引用
2.本技术根据35u.s.c
§
120要求2019年5月30日提交的系列号为62/854,556的美国临时申请的优先权权益，本文以该申请的内容为基础并通过引用将其全文纳入本文。
技术领域
3.本公开一般涉及琼脂糖和甲基纤维素细胞贮存和运输介质，用于细胞贮存和运输的系统，以及细胞贮存和运输方法。在特定的方面中，所述运输介质、系统和方法与将3d球体或类器官培养和透气性微图案化设计组合起来的实验室器皿结合使用或者在该实验室器皿中进行，以允许在贮存和运输期间保护和长期维护球体细胞(例如，肝细胞)活力和功能性。


背景技术：

4.以三维形式培养的细胞(例如球体)可以比作为单层以二维形式培养的对应物表现出更加类似体内的功能性。尤其是就细胞通讯和细胞外基质的发展而言，以三维形式培养的细胞与体内组织更相似。因此，对于3d培养的细胞(例如球体)的贮存和运输的需求不断增加，以用于众多生物技术相关领域的各种细胞培养测试和检查。然而，3d培养的细胞(包括球体)的贮存和运输仍然是一项挑战。在二维细胞培养系统中，细胞可附着于在其上培养它们的基材。然而，当细胞以三维形式生长(例如球体或类器官)时，由于在贮存和运输过程期间的扰动，细胞彼此相互作用而不是附着于基材，这使得这些细胞更易受到细胞活力损伤和完整性破坏，甚至细胞死亡。因此，难以运输以三维形式培养的贮存细胞，例如球体。由于琼脂糖具有非结合性表面，因此琼脂糖已经用作3d细胞培养的载体。回收琼脂糖中的细胞通常涉及在细胞无法承受的温度下熔化琼脂糖，这导致经培养的细胞发生细胞活力损伤甚至死亡。进一步地，在培养系统的运输介质中使用琼脂糖常需要使用琼脂糖酶，以及需要促进移除琼脂糖并因此允许细胞释放而形成运输后的培养物的额外步骤。
5.因此，不断需要替代性的运输介质，细胞贮存和运输系统，以及细胞贮存和运输方法，更具体地，需要允许在贮存和运输期间保护和长期维护球体或类器官细胞活力和功能性的替代性的运输介质，细胞贮存和运输系统，以及细胞贮存和运输方法。


技术实现要素：

6.根据本公开的各个实施方式，公开了琼脂糖和甲基纤维素运输介质，用于细胞贮存和运输的系统，以及细胞贮存和运输方法。在特定的方面中，所述运输介质、系统和方法与将3d球体或类器官培养和透气性微图案化设计组合起来的实验室器皿结合使用或者在该实验室器皿中进行，以允许在贮存和运输期间保护和长期维护球体细胞(例如，肝细胞)活力和功能性。
7.在各个实施方式中，公开了细胞贮存和运输介质。在一些方面中，所述细胞贮存和运输介质包括细胞培养介质、琼脂糖和甲基纤维素的混合物，其中，贮存和运输介质中的最
终的琼脂糖浓度为约0.5％至约1.0％，并且贮存和运输介质中的最终的甲基纤维素浓度为约0.5％至约0.7％。
8.在细胞贮存和运输介质的一些方面中，琼脂糖是超低胶凝温度琼脂糖(其可以缩写为“arg-l”)。在一些方面中，琼脂糖的胶凝温度为8-17℃。在一些方面中，细胞贮存和运输介质在4℃时为坚固凝胶。在一些方面中，细胞贮存和运输介质在23℃时为软凝胶。在一些方面中，细胞贮存和运输介质在37℃时为粘性液体。
9.在各个实施方式中，公开了细胞贮存和运输系统。在一些方面中，所述系统包含：细胞；细胞培养制品，其中，所述细胞培养制品包括腔室，所述腔室包括微腔体阵列，每个微腔体经结构化以限制细胞以3d球体或类器官构造(confirmation)生长；以及细胞贮存和运输介质，其包括琼脂糖和甲基纤维素的混合物，其中，贮存和运输介质中的最终的琼脂糖浓度为约0.5％至约1.0％，并且贮存和运输介质中的最终的甲基纤维素浓度为约0.5％至约0.7％。
10.在细胞贮存和运输系统的方面中，细胞培养制品的所述腔室的每个微腔体包括顶孔和液体不可渗透的底部，所述底部包括底表面。在实施方式中，至少一部分的底表面包括在所述底表面之中或之上的低粘性或无粘性材料。在一些实施方式中，包括底表面的液体不可渗透的底部是透气性的。在一些实施方式中，至少一部分的底部是透明的。
11.在细胞贮存和运输系统的方面中，所述底表面包括凹形底表面。在一些实施方式中，所述腔室的每个微腔体的至少一个凹形表面包括半球形表面，从侧壁到底表面具有30至约60度锥度的锥形表面，或其组合。
12.在细胞贮存和运输系统的方面中，所述腔室还包括侧壁。在一些实施方式中，所述腔室的每个微腔体的侧壁表面包括垂直圆柱体，从腔室的顶部到底表面直径减小的垂直圆锥体的一部分，锥形过渡到所述至少一个凹形底表面的垂直方筒(shaft)，或其组合。
13.在细胞贮存和运输系统的方面中，细胞培养制品还包括用于接收用于抽吸的移液器吸头的腔室附件，腔室附件包括与腔室相邻并与腔室流体连通的表面，腔室附件具有与底表面间隔开并且在底表面上方的一定高度处的第二底部，其中第二底部使从移液器分配的流体偏离底表面。
14.在细胞贮存和运输系统的一些方面中，所述细胞培养制品包括1至约2000个所述腔室，其中每个腔室与任何其他腔室物理分离。在一些实施方式中，每个腔室包括约1至约800个所述微腔体/平方厘米。
15.在细胞贮存和运输介质的一些方面中，细胞贮存和运输介质的琼脂糖是超低胶凝温度琼脂糖。在细胞贮存和运输系统的一些方面中，琼脂糖的胶凝温度为8-17℃。在一些方面中，细胞贮存和运输介质在4℃时为坚固凝胶。在细胞贮存和运输系统的一些方面中，细胞贮存和运输介质在23℃时为软凝胶。在细胞贮存和运输系统的一些方面中，细胞贮存和运输介质在37℃时为粘性液体。
16.在各个实施方式中，公开了用于运输细胞的方法。在一些方面中，用于运输细胞的方法包括：a)在细胞培养制品中培养活细胞以形成球体，其中，所述细胞培养制品包括腔室，所述腔室包括微腔体阵列，每个微腔体经结构化以限制细胞以3d球体或类器官构造生长；b)向细胞培养物添加细胞贮存和运输介质，其包括细胞培养介质、琼脂糖和甲基纤维素的混合物，其中，贮存和运输介质中的最终的琼脂糖浓度为0.5％至1.0％，并且贮存和运输
介质中的最终的甲基纤维素浓度为0.5％至0.7％；c)固化细胞贮存和运输介质；和d)运输细胞培养制品。
17.在运输细胞的方法的一些方面中，细胞培养制品的所述腔室的每个微腔体包括顶孔和液体不可渗透的底部，所述底部包括底表面。在一些方面中，至少一部分的底表面包括在所述底表面之中或之上的低粘性或无粘性材料。在一些方面中，包括底表面的液体不可渗透的底部是透气性的。在一些方面中，至少一部分的底部是透明的。
18.在用于运输细胞的方法的一些方面中，所述底表面包括凹形底表面。在一些方面中，所述腔室的每个微腔体的至少一个凹形表面包括半球形表面，从侧壁到底表面具有30至约60度锥度的锥形表面，或其组合。
19.在用于运输细胞的方法的一些方面中，所述腔室还包括侧壁。在一些实施方式中，所述腔室的每个微腔体的侧壁表面包括垂直圆柱体，从腔室的顶部到底表面直径减小的垂直圆锥体的一部分，锥形过渡到所述至少一个凹形底表面的垂直方筒(shaft)，或其组合。
20.在用于运输细胞的方法的一些方面中，细胞培养制品还包括用于接收用于抽吸的移液器吸头的腔室附件，腔室附件包括与腔室相邻并与腔室流体连通的表面，腔室附件具有与底表面间隔开并且在底表面上方的一定高度处的第二底部，其中第二底部使从移液器分配的流体偏离底表面。
21.在用于运输细胞的方法的一些方面中，所述细胞培养制品包括1至约2000个所述腔室，其中每个腔室与任何其他腔室物理分离。在一些实施方式中，每个腔室包括约1至约800个所述微腔体/平方厘米。
22.在用于运输细胞的方法的一些方面中，细胞贮存和运输介质的琼脂糖是超低胶凝温度琼脂糖。在细胞贮存和运输系统的一些方面中，琼脂糖的胶凝温度为8-17℃。在一些方面中，细胞贮存和运输介质在4℃时为坚固凝胶。在细胞贮存和运输系统的一些方面中，细胞贮存和运输介质在23℃时为软凝胶。在细胞贮存和运输系统的一些方面中，细胞贮存和运输介质在37℃时为粘性液体。
23.在运输细胞的方法的一些方面中，b)包括：向在37℃下培养的细胞添加细胞贮存和运输介质。
24.在用于运输细胞的方法的一些方面中，c)在约4℃或更低的温度下进行。在用于运输细胞的方法的一些方面中，d)在约4℃或更低的温度下进行。
25.在用于运输细胞的方法的一些方面中，运输时间不超过48小时或者72小时。
26.在运输细胞的方法的一些方面中，所述方法还包括在运输前密封细胞培养腔室。
27.在运输细胞的方法的一些方面中，所述方法还包括e)回收运输的细胞。在一些方面中，e)包括：移除细胞贮存和运输介质以及用培养介质对其进行替换。在一些方面中，e)包括：在约37℃下孵育细胞培养制品至少约1小时；以及随后移除细胞贮存和运输介质并用培养介质对其进行替换。在一些方面中，e)包括：向细胞贮存和运输介质添加约37℃的细胞培养基；在约37℃下孵育细胞培养制品至少约1小时；以及移除细胞贮存和运输介质并用培养介质对其进行替换。在一些方面中，e)包括：在约37℃下孵育细胞培养制品至少约1小时；以及随后移除细胞贮存和运输介质，并且从细胞培养制品提取3d球体或类器官细胞。
28.在以下的具体实施方式中提出了本公开主题的其他特征和优点，其中的部分特征和优点对本领域的技术人员而言根据所作描述即容易理解，或者通过实施包括以下具体实
l/0.35％mc，而下排的样品从左到右包括0.5％agr-l/1.0％mc，0.5％agr-l/0.7％mc，0.5％agr-l/0.5％mc，和0.5％agr-l/0.35％mc。
40.图10a-c示出了1％agr-l/0.7％mc制剂(对照)的ht-29球体培养物的图像(在2x放大倍数下)。图10a示出了在4℃贮存后培养物保持在原位的图像。图10b示出了在三次稀释周期后的图像，约20％的tm以覆盖表面的凝胶状材料形式保留在容器中。在移除了细胞贮存和运输介质后，球体看上去有点不规则。图10c示出了在移除了细胞贮存和运输介质24小时后，处于回收阶段的培养物的图像。
41.图11a-c示出了0.5％agr-l/0.7％mc制剂的ht-29球体培养物的图像(在2x放大倍数下)。图11a示出了在4℃贮存后培养物保持在原位的图像。图11b示出了在三次稀释周期后从培养容器移除99％的细胞贮存和运输介质之后的图像，并且具有最少的球体损失。图11c示出了在移除了细胞贮存和运输介质24小时后，处于回收阶段的培养物的图像。
42.图12a-c示出了0.5％agr-l/0.5％mc制剂的ht-29球体培养物的图像(在2x放大倍数下)。图12a示出了在4℃贮存后培养物的图像，已经有一些球体从微腔体脱落。图12b示出了在三次稀释周期后从培养容器移除99％的细胞贮存和运输介质之后的图像，并且具有最少的球体损失。图12c示出了在移除了细胞贮存和运输介质24小时后，处于回收阶段的培养物的图像。在微腔体中观察到痕量的细胞贮存和运输介质。
43.图13a-c示出了0.5％agr-l/0.35％mc制剂的ht-29球体培养物的图像(在2x放大倍数下)。图13a示出了在4℃后的培养物的图像。图13b示出了在三次稀释周期后从培养容器移除99％的细胞贮存和运输介质之后的图像，并且具有显著的球体损失。图13c示出了在移除了细胞贮存和运输介质24小时后，处于回收阶段的培养物的图像。
44.图14示出了关于球体健康的结果。通过球体生长(尺寸测量)来监测球体细胞健康。在添加细胞贮存和运输介质制剂之前，在4℃下贮存之后，以及运送测试评估及移除细胞贮存和运输介质制剂后的48小时之后，进行尺寸测量。测量值(图14)指示，在冷贮存后或回收阶段期间，没有不利的副作用(球体解离或尺寸改变)。
45.图15a-d是用绿色荧光蛋白(gfp)标记的ht-29细胞的图像。图15a示出了在具有10％fbs的mccoy’s普通细胞培养生长介质中的细胞。图15b示出了在4℃下贮存24小时后，在细胞贮存和运输介质(在本情况中，0.5％超低胶凝温度琼脂糖/0.7％r&dsystems甲基纤维素介质)中的细胞。图15c示出了移除细胞贮存和运输介质并用生长介质替换后的24小时的细胞。图15d示出了移除细胞贮存和运输介质后的48小时的细胞，并且细胞已经用碘化丙啶染色以检测细胞死亡。没有检测到死亡细胞。
46.图16是模拟运输测试过程的流程图，其详示了用于评估细胞贮存和运输介质(在本情况中，为0.5％超低胶凝温度琼脂糖/0.7％r&d systems甲基纤维素介质)的条件。
具体实施方式
47.下面将对本公开的主题的各个实施方式进行更详细的描述，其中的一些实施方式例示于附图中。图中使用的相同附图标记表示相同的部分、步骤等。但应理解，在给定的附图中使用附图标记来表示某部件并不会对另一附图中用相同附图标记标出的部件构成限制。另外，使用不同附图标记来表示部件不旨在表示不同编号的部件不能与其他编号的部件相同或相似。
48.以下具体的实施方式的说明本质上仅仅是示例性的，并且决不旨在限制本发明的范围、其应用或用途，这些当然是可以变化的。本发明关于本文包括的非限制性定义和术语来描述。这些定义和术语并非旨在限制本发明的范围或实施，而是仅出于说明性和描述性目的给出。除非另外定义，本文中所使用的所有术语(包括技术和科学术语)的含意与本发明所属领域普通技术人员通常所理解的相同。还应理解，术语，诸如在常用词典中定义的术语，应被解释为具有与其在本公开和相关领域的上下文中的含义一致的含义，并且不应当以理想化或过度正式的意义解释，除非本文明确定义。
49.定义
50.除非上下文另外清楚地说明，否则，本文所用的单数形式“一个”、“一种”以及“该/所述”包括复数指代。因此，例如，提到的“结构化底表面”包括具有两个或更多个这样的“结构化底表面”的实例，除非文中有另外的明确表示。
51.如本说明书和所附权利要求书所用，术语“或”一般在其包括“和/或”的意义上使用，除非文中有明确的相反表示。术语“和/或”意为所罗列的要素中的一者或全部，或者所罗列的要素中的任何两者或更多者的组合。
52.如本文中所用的“有”、“具有”、“具备”、“包括”、“包含”、“含”、“涵盖”、“含有”、“包括了”等以其开放意义上使用，一般表示“包括但不限于”、“包含但不限于”或“含有但不限于”。
[0053]“任选”或“任选地”表示随后描述的事件、情形或部分可能发生，也可能不发生，而且该描述包括事件、情形或部分发生的情况和不发生的情况。
[0054]
术语“优选”和“优选地”是指能够在特定条件下产生某些益处的本公开的实施方式。然而，在相同条件或其它条件下，其它实施方式也可以是优选的。此外，一个或多个优选实施方式的描述并不意味着其他实施方式是不可用的，也无意于将其他实施方式排除在本发明技术的范围之外。
[0055]
本文中，范围可表示为从“约”一个具体值开始和/或至“约”另一个具体值终止。当表述这种范围时，实例包括自某一具体值始和/或至另一具体值止。类似地，当用先行词“约”将数值表示为近似值时，应理解具体数值构成了另一个方面。还应理解，每个范围的端点在与另一个端点有关及独立于另一个端点时都是重要的。
[0056]
同样，在本文中，通过端点来描述的数字范围包括该范围内包含的所有数字(例如，1-5包括1、1.5、2、2.75、3、3.80、4、5等)。还应理解，本说明书全文中给出的每个数值范围应包括落入所述较宽数值范围中的每个较窄数值范围，如同本文中明确写明这些较窄数值范围。当数值的范围“大于”、“小于”等特定值时，该值包含在该范围内。
[0057]
本文指代的任何方向，例如“顶部”、“底部”、“左”、“右”、“上”、“下”、“上方”、“下方”及其他方向和取向在本文中是为了清楚起见而参考附图来描述，并且不是对实际的装置或系统或者装置或系统的使用的限制。本文所述的许多装置、制品或系统可以以多种方向和取向来使用。在本文中关于细胞培养设备所用的方向描述常指当出于在设备中培养细胞的目的来对设备进行取向时的方向。
[0058]
还应注意本文中涉及将部件“构造成”或“使其适于”的描述以特定的方式起作用。就这方面而言，将该部件“构造成”或使其“适于”是为了具体表现特定的性质，或者以特定的方式起作用，这样的描述是结构性的描述，而不是对预期应用的描述。更具体而言，本文
所述的将部件“构造成”或“使其适于”的方式表示该部件现有的物理条件，因此可以将其看作该部件的结构特征的限定性描述。
[0059]
如本文所用，术语“细胞培养”是指保持细胞在体外存活。本术语中包含了连续细胞系(例如，具有永生表型)、原代细胞培养物、有限细胞系(例如，非转化细胞)以及体外维持的任何其他细胞群，包括卵母细胞和胚胎。
[0060]
如本文所用，术语“细胞培养介质/培养基”是指用于生长或维持细胞的营养源(在一些方面中，为液体或凝胶)。如本领域技术人员所理解的，营养源可以包含细胞生长和/或生存所需的介质/培养基组分，或者可以包含有助于细胞生长和/或生存的组分。维生素、必需和非必需氨基酸、蛋白质、碳水化合物、脂质、激素、生长因子、矿物质、血清和痕量元素是介质/培养基组分的实例。
[0061]
如本文所用，术语“体外”指人工环境以及在人工环境内发生的过程或反应。体外环境可包括但不限于试管和细胞培养物。术语“体内”是指天然环境(例如，动物或细胞)以及在天然环境中发生的过程或反应。
[0062]
如本文中所用的“长期培养”意在指细胞(例如但不限于肝细胞)已经培养了至少约12小时，任选地，培养了至少约24小时，至少约48小时，或至少约72小时，至少约96小时，至少约7天，至少约14天，至少约21天或至少约28天。长期培养促进了功能性质的确立，例如培养物中的代谢途径。
[0063]
如本文中所用的术语“细胞培养制品”意为用于培养细胞的任何容器，包括板、孔、烧瓶、多孔板、多层烧瓶、插入件、微腔体插入件以及提供细胞培养环境的灌注系统。
[0064]
在方面中，“孔”是以多孔板形式提供的独立的细胞培养环境。在实施方式中，孔可以是4孔板、5孔板、6孔板、12孔板、24孔板、96孔板、384孔板、1536孔板或任何其他多孔板构造的孔。
[0065]
如本文所用，“被结构化以限制关注的细胞以3d构造生长”的腔室、孔、微孔或微腔体等意为腔室、孔、微孔或微腔体具有一定的尺寸或处理，或尺寸和处理的组合，其促进培养中的细胞以3d或球体构造而不是二维细胞片生长。处理例如包括用低结合溶液处理，使表面疏水性降低的处理，或者灭菌处理。
[0066]
如本文所用的“被结构化以提供”或“被构造用于提供”意为制品具有提供所述结果的特征。
[0067]
在一些方面中，单个“球体孔”可以是多孔板的孔，其被结构化以限制关注的细胞在该单个球体孔中作为单个3d细胞团或单个球体(其可以分化以形成类器官)生长。例如，96孔板的孔(传统96孔板的孔)为约10.67mm深，具有约6.86mm的顶孔和约6.35mm的孔底部直径。
[0068]
在一些方面中，“球体板”意为具有单球体孔阵列的多孔板。
[0069]
在一些方面中，孔可以具有“微腔体”阵列。在实施方式中，“微腔体”例如可以是限定了上孔和最低点，上孔的中心以及上孔的中心和最低点之间的中心轴的微孔。在实施方式中，孔围绕轴线旋转对称(即，侧壁是圆柱形的)。在一些实施方式中，上孔限定了跨越上孔的距离，该距离在250μm至6mm之间，或者这些测量值内的任何范围。在一些实施方式中，从上孔到最低点的距离(深度“d”)在200μm至6mm之间，或者在400μm至600μm之间。微腔体阵
列可具有不同的几何结构，例如，抛物线形，双曲线形，v形和横截面几何结构，或其组合。
[0070]
在一些方面中，“微腔体球体板”意为具有孔阵列，并且每个孔具有微腔体阵列的多孔板。
[0071]
在一些方面中，孔或微腔体孔的“圆形底部”例如可以是半球，或者一部分的半球，例如，构成孔或微腔体的底部的半球的水平截面或切片。
[0072]
在一些方面中，术语“3d球体”或“球体”可以是例如培养中的细胞球，其不是平坦的二维细胞片。术语“3d球体”和“球体”在本文中可互换使用。在一些方面中，球体包括单个细胞类型或多个细胞类型，其可以分化以形成类器官，直径例如为约100微米至约5mm，包括其中的值和范围，这取决于例如球体或类器官中的细胞类型。为了避免坏死核的形成，球体直径例如可以是约100微米至约400微米。球体的最大尺寸一般因扩散考虑因素而限制在400μm(关于球体和球体容器的综述，参见achilli,t-m等人，expert opin.biol.ther.(2012)12(10))。
[0073]
本文所用的“插入件”意为适合放入球体板或微腔体球体板的孔的细胞培养孔。插入件具有侧壁和底表面，其限定了用于培养细胞的腔体。如本文所用的“微腔体插入件”意为底表面具有微腔体阵列的插入件。
[0074]
如本文所用的“插入板”意为含有插入件阵列的插入板，所述插入件被结构化以适于放入多孔板的孔阵列。如本文所用的“微腔体插入板”意为插入件阵列中的每个插入件的底表面具有微腔体阵列的插入板。
[0075]
除非另有表述，否则都不旨在将本文所述的任何方法理解为需要使其步骤以具体顺序进行。因此，当方法权利要求实际上没有陈述为其步骤遵循一定的顺序或者其没有在权利要求书或说明书中以任意其他方式具体表示步骤限于具体的顺序，都不旨在暗示该任意特定顺序。在任一项权利要求中所述的任何单个或多个特征或方面可以结合任一项或多项其他权利要求中所述的任何其他特征或方面或与任一项或多项其他权利要求中所述的任何其他特征或方面置换。
[0076]
虽然使用过渡语“包含”可以公开特定实施方式的各个特征、元素或步骤，但是应理解的是，这暗示了包括可采用过渡语“由
……
构成”或“基本上由
……
构成”描述在内的替代性实施方式。
[0077]
如前文所提到的，以三维形式培养的细胞(例如球体或类器官)可以比作为单层以二维形式培养的对应物表现出更加类似体内的功能性。尤其是就细胞通讯和细胞外基质的发展而言，以三维形式培养的细胞与体内组织更相似。因此，对于3d培养的细胞(例如球体和类器官)的贮存和运输的需求不断增加，以用于众多生物技术相关领域的各种细胞培养测试和检查。然而，3d培养的细胞(包括球体和类器官)的贮存和运输仍然是一项挑战。在二维细胞培养系统中，细胞可附着于在其上培养它们的基材。然而，通常，当细胞以三维形式生长(例如球体和类器官)时，由于在贮存和运输过程期间的扰动，细胞彼此相互作用而不是附着于基材，这使得这些细胞更易受到细胞活力损伤和完整性破坏，甚至细胞死亡。因此，难以运输以三维形式培养的贮存细胞，例如球体和类器官。
[0078]
本公开尤其描述了琼脂糖和甲基纤维素运输介质，用于细胞贮存和运输的系统，以及用于3d培养的细胞(包括3d球体和类器官)的细胞贮存和运输方法。本发明人意外地发现，在细胞培养介质中使用特定浓度的特定类型的琼脂糖结合特定浓度范围的甲基纤维
素，提供了能理想地适于3d球体或类器官细胞培养贮存和运输的细胞贮存和运输介质。本公开的琼脂糖和甲基纤维素细胞贮存和运输介质在4℃左右时是坚固凝胶，在23℃左右时是软凝胶，并且在37℃时是粘性液体。因此，所述细胞贮存和运输介质允许在4-37℃的温度范围时贮存/运输/处理3d球体和类器官细胞，所述温度范围是维持细胞活力和代谢活性的最佳温度。这是重要的，因为虽然许多细胞类型的生长的最佳温度在37℃左右，但是高于该温度可导致对细胞活力和完整性有不利影响。比细胞生长的最佳温度低的温度(低至4℃)使得细胞代谢下降或变慢，但是细胞能够维持它们的活力和完整性，并且当返回到正常或最佳生长条件(例如，37℃左右)时，能够恢复到正常生长活性。再次，本公开的细胞贮存和运输介质在4℃左右时是坚固凝胶，在23℃左右时是软凝胶，并且在37℃时是粘性液体。这允许在4℃时运输3d球体或类器官，因为细胞贮存和运输介质表现得像固体凝胶，并因此在运输期间提供足够的强度来维持细胞活力和完整性。进一步地，该固体凝胶状态在37℃时可逆转成液体状态，以允许3d球体或类器官细胞培养的处理和回收。重要的是，使用本公开的浓度的特定类型的琼脂糖结合特定浓度范围的甲基纤维素和细胞培养介质允许在4℃左右形成坚固凝胶，其不抵抗气体传输通过(例如，氧气和二氧化碳传输通过凝胶)，因此允许在4℃左右运输期间，提高维持3d球体或类器官细胞活力和完整性的能力。令人惊奇的是，需要使用超低胶凝温度的琼脂糖来成功地形成具有上述性质的细胞贮存和运输介质。在特定的方面中，所述运输介质、系统和方法与将3d球体或类器官培养和透气性微图案化设计组合起来的实验室器皿结合使用或者在该实验室器皿中进行，以允许在贮存和运输期间保护和长期维持球体细胞(例如，肝细胞)或类器官的活力和功能性，并且还允许在相同条件和介质下处理多个到几千个球体或类器官，与此同时，在各个3d球体或类器官之间提供物理屏障以防止在培养或测试期间发生任何的球体融合。
[0079]
因此，在各个实施方式中，公开了细胞贮存和运输介质。在一些方面中，所述细胞贮存和运输介质包括细胞培养介质、琼脂糖和甲基纤维素的混合物，其中，贮存和运输介质中的最终的琼脂糖浓度为约0.5％至约1.0％，并且贮存和运输介质中的最终的甲基纤维素浓度为约0.5％至约0.7％。
[0080]
琼脂糖是交替的(1-3)连接的β-d-半乳糖和(1-4)连接的(3-6)-内醚-a-l-半乳糖共聚物的热可逆胶凝化多糖，其在寒冷温度时形成凝胶，并且可在较高温度下融化。标准琼脂糖在约37℃时变成凝胶，高胶凝温度琼脂糖在约41℃时变成凝胶，低胶凝温度琼脂糖在26-30℃时变成凝胶，并且超低胶凝温度琼脂糖在8-17℃时变成凝胶。超低胶凝温度琼脂糖在55℃时将重新融化。琼脂糖通常用于形成分子生物学中使用的凝胶，以用于基于质量来分离dna链，但是其也可用于病毒斑分析，以及用作增稠剂。琼脂糖以粉末形式供应，其需加入到水中并在约87℃时融化以形成水性溶液。琼脂糖已经用作3d细胞培养的载体。然而，在培养系统的运输介质中使用琼脂糖将要求所运输的细胞经受大于65℃的温度以使其从凝胶中释放出来。公知的是，使经培养的细胞经受如此高的温度可对经培养的细胞造成细胞活力损伤甚至死亡。进一步地，在培养系统的运输介质中使用琼脂糖常需要使用琼脂糖酶，以及需要促进移除琼脂糖并因此允许细胞释放而形成运输后的培养物的额外步骤。
[0081]
甲基纤维素是能够在水性介质中形成热可逆凝胶的纤维素衍生物。当含甲基纤维素的溶液受热时，其将在合适的浓度和温度下形成凝胶。通常，2％(w/w)的甲基纤维素溶液具有约48℃的胶凝化温度。胶凝化温度随着浓度增加而线性下降到约30℃(10％的溶液)。
在甲基纤维素的情况中，其在冷的液体中可变成溶液，并且在其为溶液形式后，随着溶液被加热，由于聚合物链上的疏水基团的分子间缔合，其变成凝胶。在药物、化妆品和食品应用(1)中，甲基纤维素常用作粘结剂或增稠剂。当与细胞培养介质混合时，甲基纤维素还用于细胞的培养，并且经常使用以能够由干细胞集形成“拟胚体”，这是因为由于甲基纤维素比水或无纤维素衍生物的介质具有更高的密度，其保持细胞悬浮。
[0082]
在细胞贮存和运输介质的一些方面中，琼脂糖是超低熔化温度琼脂糖。在一些方面中，琼脂糖的胶凝温度为8-17℃。这种超低熔化温度琼脂糖和胶凝温度为8-17℃的琼脂糖是可商购的并且在本领域中是已知的。本发明人发现，通过将超低胶凝温度琼脂糖和甲基纤维素组合起来，两种组分的胶凝性质得到改变，以为运输作为球体或类器官的细胞提供了理想条件。在本公开的细胞贮存和运输介质中使用超低胶凝温度琼脂糖[例如，商购的超低胶凝温度琼脂糖，例如但不限于西格玛-奥德里奇公司(sigma-aldrich)(西格玛产品号a5030)出售的]允许介质在约4℃时形成坚固凝胶，该坚固凝胶提供足够的强度以在运输期间维持3d球体或类器官细胞活力和完整性，并且该坚固凝胶还允许气体传输通过凝胶(例如，氧气和二氧化碳传输通过凝胶)。这使得在约4℃时运输期间维持3d球体和类器官细胞活力和完整性的能力得到提高。在一些方面中，细胞贮存和运输介质在4℃时为坚固凝胶。在一些方面中，细胞贮存和运输介质在23℃时为软凝胶。在一些方面中，细胞贮存和运输介质在37℃时为粘性液体。图4是示出了在不同温度下运输介质的实施方式的粘稠性的图。从图片的顶部出发：在4℃时，运输介质的粘稠性为坚固凝胶；在室温(rt，23℃)时，运输介质的粘稠性为软凝胶；并且在37℃时，运输介质是粘性液体。在图4的图片中，这可通过管中的运输介质(粉色材料)的深度来检测，所述管以小的角度保持，该小的角度允许凝胶朝向管的下端移动。
[0083]
在一些方面中，细胞贮存和运输介质包含细胞培养介质。细胞培养介质可包括天然介质或人工/合成介质(例如，已知的细胞培养基，包括但不限于：经平衡的盐溶液，例如pbs、dpbs、hbss、ebss；基础培养基，例如mem或dmem；或者复合培养基，例如rpmi-1640或imdm)以及附加的天然产物。在一些方面中，所述人工/合成介质可以是含血清的、无血清的、化学限定培养基和/或无蛋白培养基。在一些方面中，细胞培养介质还可以包括一种或多种以下物质，如维持被贮存/运输的细胞类型所特有的活力所必需的，例如，营养物(例如，蛋白质、肽、必需和/或非必需氨基酸中的一种或多种)；能量(例如，碳水化合物中的一种或多种，例如葡萄糖)；必需金属和矿物质(例如，钙、镁、铁、磷酸盐、硫酸盐中的一种或多种)；缓冲剂(例如，磷酸盐、乙酸盐、碳酸氢盐中的一种或多种)、ph变化指示剂(例如，酚红、溴甲酚紫中的一种或多种)；选择性试剂(例如，化学品、抗微生物剂中的一种或多种)；本领域已知的其他基本补充剂和生长因子(丙酮酸钠、碳酸氢钠、胰岛素、转铁蛋白、硒和β-巯基乙醇中的一种或多种)等，如本领域已知的。
[0084]
在各个实施方式中，公开了包含上述细胞贮存和运输介质(包括其的所有方面)的细胞贮存和运输系统。所述细胞贮存和运输系统包括实验室器皿，其将3d球体培养和透气性微图案化设计组合起来，以允许在贮存和运输期间保护和长期维持球体细胞(例如，肝细胞)的活力和功能性，并且还允许在相同条件和介质下处理多个到几百个球体，与此同时，在各个3d球体之间提供物理屏障以防止在培养或测试期间发生任何的球体融合。
[0085]
在一些方面中，所述细胞贮存和运输系统包括：细胞；细胞培养制品，其中，所述细
胞培养制品包括腔室，所述腔室包括微腔体阵列，每个微腔体经结构化以限制细胞以3d球体或类器官构造生长；以及细胞贮存和运输介质，其包括细胞培养介质、琼脂糖和甲基纤维素的混合物，其中，贮存和运输介质中的最终的琼脂糖浓度为约0.5％至约1.0％，并且贮存和运输介质中的最终的甲基纤维素浓度为约0.5％至约0.7％。
[0086]
在细胞贮存和运输系统的一些方面中，细胞贮存和运输介质的琼脂糖是超低胶凝温度琼脂糖。在细胞贮存和运输系统的一些方面中，琼脂糖的胶凝温度为8-17℃。在一些方面中，细胞贮存和运输介质在4℃时为坚固凝胶。在细胞贮存和运输系统的一些方面中，细胞贮存和运输介质在23℃时为软凝胶。在细胞贮存和运输系统的一些方面中，细胞贮存和运输介质在37℃时为粘性液体。
[0087]
在细胞贮存和运输系统的一些方面中，细胞贮存和运输介质包含细胞培养介质。细胞培养介质可包括天然介质或人工/合成介质(例如，已知的细胞培养基，包括但不限于：经平衡的盐溶液，例如pbs、dpbs、hbss、ebss；基础培养基，例如mem或dmem；或者复合培养基，例如rpmi-1640或imdm)以及附加的天然产物。在一些方面中，所述人工/合成介质可以是含血清的、无血清的、化学限定培养基和/或无蛋白培养基。在一些方面中，细胞培养介质还可以包括一种或多种以下物质，如维持被贮存/运输的细胞类型所特有的活力所必需的，例如，营养物(例如，蛋白质、肽、必需和/或非必需氨基酸中的一种或多种)；能量(例如，碳水化合物中的一种或多种，例如葡萄糖)；必需金属和矿物质(例如，钙、镁、铁、磷酸盐、硫酸盐中的一种或多种)；缓冲剂(例如，磷酸盐、乙酸盐、碳酸氢盐中的一种或多种)、ph变化指示剂(例如，酚红、溴甲酚紫中的一种或多种)；选择性试剂(例如，化学品、抗微生物剂中的一种或多种)；本领域已知的其他基本补充剂和生长因子(丙酮酸钠、碳酸氢钠、胰岛素、转铁蛋白、硒和β-巯基乙醇中的一种或多种)等，如本领域已知的。
[0088]
在细胞贮存和运输系统的一些方面中，所述腔室的每个微腔体包括顶孔和液体不可渗透的底部，所述底部包括底表面，其中，至少一部分的底表面在底表面之中或之上包括低粘性或无粘性材料。在一些方面中，包括底表面的液体不可渗透的底部是透气性的。在一些方面中，至少一部分的底部是透明的。在一些实施方式中，所述底表面包括凹形底表面。在一些方面中，所述腔室还包括侧壁。在一些方面中，所述腔室的每个微腔体的至少一个凹形底表面包括半球形表面，从侧壁到底表面具有30至约60度的锥度的锥形表面，或其组合。在一些方面中，所述细胞培养制品包括1至约2000个所述腔室，其中每个腔室与任何其他腔室物理分离。在一些方面中，每个腔室包括约1至约800个所述微腔体/平方厘米。例如但非限制，6孔板可以在该6孔板的一个孔中包括约700个微腔体，因此在一个孔内允许有700个球体(共计约120万个细胞)。类似地，24孔板中的每个孔可以包括约100-200个微腔体，而96孔板中的每个孔可以包含约50个微腔体。所有这些微腔体数目是代表性的并且是基于微腔体的尺寸的。
[0089]
现在参考图1a、图1b和图1c，其示出了用于细胞贮存和运输系统及下述方法的一些方面的示例性细胞培养制品。所示的细胞培养制品是微腔体球体板，这种情况中是96孔微腔体球体板，在每个孔的底表面上具有微腔体阵列，并且每个微腔体经结构化以限制所培养的细胞以3d球体构造生长，从而在96孔中的每一孔中提供多个球体。图1a例示了具有孔阵列110的多孔板10。图1b示出了图1a的多孔板10的单个孔110。该单个孔110具有顶孔，液体不可渗透的底表面106和侧壁113。图1c是图1b中的框c中所示的孔110的底表面106的
区域的分解图，其例示了图1b所示的单个孔的底表面中的微腔体阵列112。微腔体阵列112中的每个微腔体115具有侧壁121和液体不可渗透的底表面116。图1a、图1b和图1c所示的微腔体球体板在每个单独的孔110的底部中提供微腔体阵列112，该微腔体球体板可用于在多孔板的每个单独孔的每个微腔体中生长单独的3d球体。通过使用这种类型的容器，使用者可在多孔板的每个孔中生长大量球体，从而提供维持长久细胞活力和功能性的大量3d球体，并且该大量3d球体可在相同的培养和实验条件下处理以用于各种培养或测试。另外，这种类型的容器在各个3d球体之间提供了物理屏障以在培养或测试期间防止任何球体融合。球体融合可导致融合的球体的尺寸超过扩散极限，使得球体核中的细胞会开始失去活力或死亡。因此，本公开的微孔设计提供了物理屏障，其允许在延长的孵育时间期间维持每个球体的完整性。
[0090]
现在参考图2a，其示出了用于细胞贮存和运输系统及下述方法方面的微腔体阵列112的示例性说明。图2a例示了微腔体115，每个微腔体115具有顶孔118，底表面119，深度d，以及由侧壁121限定的宽度w。如图2a所示，微腔体阵列具有液体不可渗透的凹弧形底表面116。在实施方式中，微腔体的底表面可以是圆形或圆锥形，有角度的，平底的，或适于形成3d球体的任何形状。优选圆底。当垂直侧壁过渡到圆底119时，圆底119可以具有过渡区114。其可以是平顺或有角度的过渡区。在实施方式中，“微腔体”可以是例如微孔115，其限定了上孔118和最低点116，上孔的中心以及上孔的中心和最低点之间的中心轴线105。在实施方式中，孔围绕轴线旋转对称(即，侧壁是圆柱形的)。在一些实施方式中，上孔限定了跨越上孔的距离(宽度w)，其在250μm至6mm之间，或者这些测量值内的任何范围。在一些实施方式中，从上孔到最低点的距离(深度“d”)在200μm至6mm之间，或者在400μm至600μm之间。微腔体阵列可具有不同的几何结构，例如，抛物线形，双曲线形，v形和横截面几何结构，或其组合。在实施方式中，微腔体在其下方可以具有保护层130，以保护它们免于与诸如实验室工作台或桌子之类的表面直接接触。在一些实施方式中，可以在孔119的底部与保护层之间提供空气空间110。在实施方式中，空气空间110可以与外部环境连通，或者可以是封闭的。现在参考图2b，其示出了用于细胞贮存和运输系统及下述方法方面的微腔体阵列112的另外的示例性说明。图2b例示了微腔体阵列112可以具有正弦或抛物线形状。这种形状产生圆化的顶边缘或微腔体边缘，在一些方面中，这减少了空气被滞留在微腔体顶部处的尖锐角落或90度角处。如图2b所示，在一些方面中，微腔体115具有顶部开口，其具有顶直径d
顶
；从微腔体的底部116到微腔体的顶部的高度h；在微腔体的顶部与微腔体的底部116之间的高度一半处的微腔体直径dh；以及侧壁113。在这样的方面中，孔的底部是圆化的(例如，半球圆形)，侧壁的直径从孔的底部到顶部增大，并且孔之间的边界是圆化的。由此，孔的顶部不以直角终止。在一些方面中，孔具有在底部与顶部之间的中间点处的直径d(也被称为dh)，在孔的顶部处的直径d
顶
以及从孔的底部到顶部的高度h。在这些实施方式中，d
顶
大于d。
[0091]
在细胞贮存和运输系统的方面中，具有所述至少一个凹弧形底表面的微腔体或“杯子”的底表面例如可以是半球形表面，具有圆底的锥形表面，以及类似的表面几何结构，或者其组合。微腔体底部最终以对球体“友好”的圆化或弯曲表面(例如凹坑、凹陷等凹形截头圆锥形起伏(relief)表面或其组合)终止、结束或见底。在一些方面中，所述腔室的每个微腔体的至少一个凹形表面包括半球形表面，从侧壁到底表面具有30至约60度的锥度的锥形表面，或其组合。在一些方面中，所述至少一个凹弧形底表面可以是例如半球的一部分，
例如半球的水平部分或切片，其直径为例如约250至约6,000微米(即，0.010至0.200英寸)，包括其中的数值和范围，这取决于例如所选择的孔几何结构，每个孔内的凹弧形表面的数量，板中孔的数量及类似的考虑因素。其他凹弧形表面可以具有例如抛物线形，双曲线形，v形等截面几何结构或其组合。
[0092]
在细胞贮存和运输系统的方面中，包含腔室的细胞培养制品(例如，微腔体球体板、微腔体插入件、微腔体插入板等)在一部分腔室上，例如，在所述至少一个底表面上或每个微腔体的所述至少一个凹形底表面上和/或一个或多个侧壁上，还可包括低粘性、超低粘性或无粘性涂层。无粘性材料的实例包括聚二甲基硅氧烷、全氟化聚合物、烯烃、或类似聚合物、或它们的混合物。其他实例包括琼脂糖，非离子型水凝胶(例如聚丙烯酰胺)，或聚醚(例如聚氧化乙烯)，或多元醇(例如聚乙烯基醇)，或类似材料(例如聚乙烯基吡咯烷酮)，或其混合物。
[0093]
在细胞贮存和运输系统的方面中，所述腔室和/或每个微腔体的侧壁表面(即，环绕部)可以是例如垂直圆柱或筒，从腔室顶部到腔室底部的直径减小的垂直圆锥的一部分，具有锥形过渡的垂直方筒或垂直椭圆筒，即，在所述孔的顶部是正方形或椭圆形，过渡到圆锥形，并且以具有至少一个凹弧形表面(即，圆化或弯曲)的底部结束，或其组合。其他说明性几何结构实例包括带孔圆柱、带孔圆锥圆柱，先圆柱后圆锥，以及其他类似几何结构或其组合。
[0094]
在细胞贮存和运输系统的方面中，例如低附着性基材、微腔体的主体和基底部分中的孔曲率以及重力中的一者或多者可诱导细胞自组装成球体或类器官。相对于以2d单层生长的细胞，3d球体或类器官细胞保持分化细胞功能，其指示了更像体内的响应。在一些方面中，球体或类器官例如可以是基本为球体，直径例如为约100微米至约5毫米。
[0095]
在细胞贮存和运输系统的方面中，包括腔室和/或在腔室内的每个微腔体在内的细胞培养制品还可包括不透明侧壁和/或透气且不透液体的底部，其包括至少一个凹形表面。在一些方面中，包括至少一个凹形表面的至少一部分底部是透明的。具有这些特征的细胞培养制品(例如，微腔体球体板、微腔体插入件、微腔体插入板等)可以为本公开的方法提供若干优点，包括不需要将培养的细胞从一个多孔板(球体或类器官在其中形成并且可以可视化)转移到另一个板以进行测定，因此节省了时间并避免了任何不必要的球体破坏。另外，透气性底部(例如，由在特定的给定厚度下具有透气性质的聚合物制成的孔底部)可使得3d球体或类器官细胞接收的氧合增加。示例性的透气性底部可以由一定厚度的多种类型的聚合物或聚合物掺混物形成，包括聚苯乙烯，聚烯烃(例如聚4-甲基戊烷或聚乙烯、聚丙烯及其共聚物)，聚碳酸酯，全氟聚合物或者诸如聚二甲基硅氧烷之类的聚合物。取决于所用的特定聚合物的氧气和二氧化碳的渗透性，透气性聚合物的代表性厚度和范围可以是，例如，约0.001英寸至约0.025英寸，0.0015英寸至约0.03英寸，包括其中的数值和范围(其中1英寸＝25,400微米；0.000039英寸＝1微米)。附加或替代地，具有高透气性的其他材料，例如聚二甲基硅氧烷聚合物，可以在例如厚达约1英寸的厚度下提供足够的气体扩散。
[0096]
在细胞贮存和运输系统的方面中，细胞培养制品还可包括腔室附件，腔室延伸区域或辅助侧腔室，以用于接收用于抽吸的移液器吸头，腔室附件或腔室延伸部(例如，侧袋)可以是，例如，与腔室相邻并与腔室流体连通的整体表面。腔室附件可具有与腔室和/或腔室内的微腔体的液体不可渗透的底部间隔开的第二底部。腔室附件和腔室附件的第二底部
可以例如与腔室的液体不可渗透的底部间隔开，例如在较高的高度或相对高度处。腔室附件的第二底部使从移液器分配的流体偏离腔室的液体不可渗透的底部(以及腔室内的每个微腔体的液体不可渗透的底部)，以避免破坏或干扰球体。
[0097]
在细胞贮存和运输系统的方面中，微腔体插入件或微腔体插入板可与本公开的系统和方法中的细胞培养制品组合使用，以培养关注的细胞，使其以3d球体或类器官构造来生长。例如，如图3所示，插入件具有顶孔418，侧壁421和底表面419，它们形成了微腔体阵列420。应理解，插入件可以许多种构造来获得，包括但不限于6孔微腔体插入件，12孔微腔体插入件，24孔微腔体插入件，48孔微腔体插入件，96孔微腔体插入件，以及单个板包含多个插入件的插入板构造，并且多孔插入板被结构化成插入到多孔板中的互补孔阵列中。
[0098]
在各个实施方式中，公开了运输细胞的方法，所述方法包括上述细胞贮存和运输系统(包括其细胞培养制品的所有方面)及贮存和运输介质(包括上文公开的所有方面)。在一些方面中，用于运输细胞的方法包括：a)在细胞培养制品中培养活细胞以形成球体，其中，所述细胞培养制品包括腔室，所述腔室包括微腔体阵列，每个微腔体经结构化以限制细胞以3d球体构造生长；b)向细胞培养物添加细胞贮存和运输介质，其包括琼脂糖和甲基纤维素以及细胞培养介质的混合物，其中，贮存和运输介质中的最终的琼脂糖浓度为0.5％至1.0％，并且贮存和运输介质中的最终的甲基纤维素浓度为0.5％至0.7％；c)固化细胞贮存和运输介质；和d)运输细胞培养制品。
[0099]
在运输细胞的方法的一些方面中，细胞贮存和运输介质的琼脂糖是超低胶凝温度琼脂糖。在细胞贮存和运输系统的一些方面中，琼脂糖的胶凝温度为8-17℃。在一些方面中，细胞贮存和运输介质在4℃时为坚固凝胶。在细胞贮存和运输系统的一些方面中，细胞贮存和运输介质在23℃时为软凝胶。在细胞贮存和运输系统的一些方面中，细胞贮存和运输介质在37℃时为粘性液体。
[0100]
在运输细胞的方法的一些方面中，细胞贮存和运输介质包含细胞培养介质。细胞培养介质可包括天然介质或人工/合成介质(例如，已知的细胞培养基，包括但不限于：经平衡的盐溶液，例如pbs、dpbs、hbss、ebss；基础培养基，例如mem或dmem；或者复合培养基，例如rpmi-1640或imdm)以及附加的天然产物。在一些方面中，所述人工/合成介质可以是含血清的、无血清的、化学限定培养基和/或无蛋白培养基。在一些方面中，细胞培养介质还可以包括一种或多种以下物质，如维持被贮存/运输的细胞类型所特有的活力所必需的，例如，营养物(例如，蛋白质、肽、必需和/或非必需氨基酸中的一种或多种)；能量(例如，碳水化合物中的一种或多种，例如葡萄糖)；必需金属和矿物质(例如，钙、镁、铁、磷酸盐、硫酸盐中的一种或多种)；缓冲剂(例如，磷酸盐、乙酸盐、碳酸氢盐中的一种或多种)、ph变化指示剂(例如，酚红、溴甲酚紫中的一种或多种)；选择性试剂(例如，化学品、抗微生物剂中的一种或多种)；本领域已知的其他基本补充剂和生长因子(丙酮酸钠、碳酸氢钠、胰岛素、转铁蛋白、硒和β-巯基乙醇中的一种或多种)等，如本领域已知的。
[0101]
在运输细胞的方法的一些方面中，所述腔室的每个微腔体包括顶孔和液体不可渗透的底部，所述底部包括底表面，其中，至少一部分的底表面在底表面之中或之上包括低粘性或无粘性材料。在一些方面中，包括底表面的液体不可渗透的底部是透气性的。在一些实施方式中，至少一部分的底部是透明的。在一些实施方式中，所述底表面包括凹形底表面。在一些实施方式中，所述腔室还包括侧壁。在一些方面中，所述腔室的每个微腔体的至少一
个凹形底表面包括半球形表面，从侧壁到底表面具有30至约60度的锥度的锥形表面，或其组合。在一些方面中，所述细胞培养制品包括1至约2000个所述腔室，其中每个腔室与任何其他腔室物理分离。在一些实施方式中，每个腔室包括约1至约800个所述微腔体/平方厘米。例如但非限制，6孔板可以在该6孔板的一个孔中包括约700个微腔体，因此在一个孔内允许有700个球体(共计约120万个细胞)。类似地，24孔板中的每个孔可以包括约100-200个微腔体，而96孔板中的每个孔可以包含约50个微腔体。所有这些微腔体数目是代表性的并且是基于微腔体的尺寸的。
[0102]
在一些方面中，用于运输细胞的方法的细胞培养制品包括图2-4中公开的特征。
[0103]
在用于运输细胞的方法的一些方面中，具有所述至少一个凹弧形底表面的微腔体或“杯子”的底表面例如可以是半球形表面，具有圆底的锥形表面，以及类似的表面几何结构，或者其组合。微腔体底部最终以对球体“友好”的圆化或弯曲表面(例如凹坑、凹陷等凹形截头圆锥形起伏(relief)表面或其组合)终止、结束或见底。在实施方式中，所述腔室的每个微腔体的至少一个凹形表面包括半球形表面，从侧壁到底表面具有30至约60度的锥度的锥形表面，或其组合。在一些实施方式中，所述至少一个凹弧形底表面可以是例如半球的一部分，例如半球的水平部分或切片，其直径为例如约250至约5000微米(即，0.010至0.200英寸)，包括中间值和范围，这取决于例如所选择的孔几何结构，每个孔内的凹弧形表面的数量，板中孔的数量及类似的考虑因素。其他凹弧形表面可以具有例如抛物线形，双曲线形，v形等截面几何结构或其组合。
[0104]
在用于运输细胞的方法的一些方面中，包含腔室的细胞培养制品(例如，微腔体球体板、微腔体插入件、微腔体插入板等)在一部分腔室上，例如，在所述至少一个底表面上或每个微腔体的所述至少一个凹形底表面上和/或一个或多个侧壁上，还可包括低粘性、超低粘性或无粘性涂层。无粘性材料的实例包括聚二甲基硅氧烷、全氟化聚合物、烯烃、或类似聚合物、或它们的混合物。其他实例包括琼脂糖，非离子型水凝胶(例如聚丙烯酰胺)，或聚醚(例如聚氧化乙烯)，或多元醇(例如聚乙烯基醇)，或类似材料(例如聚乙烯基吡咯烷酮)，或其混合物。
[0105]
在用于运输细胞的方法的一些方面中，所述腔室和/或每个微腔体的侧壁表面(即，环绕部)可以是例如垂直圆柱或筒，从腔室顶部到腔室底部的直径减小的垂直圆锥的一部分，具有锥形过渡的垂直方筒或垂直椭圆筒，即，在所述孔的顶部是正方形或椭圆形，过渡到圆锥形，并且以具有至少一个凹弧形表面(即，圆化或弯曲)的底部结束，或其组合。其他说明性几何结构实例包括带孔圆柱、带孔圆锥圆柱，先圆柱后圆锥，以及其他类似几何结构或其组合。
[0106]
在用于运输细胞的方法的方面中，例如低附着性基材、微腔体的主体和基底部分中的孔曲率以及重力中的一者或多者可诱导细胞自组装成球体。相对于以2d单层生长的细胞，以3d生长的细胞保持分化细胞功能，其指示了更像体内的响应。在实施方式中，球体或类器官例如可以是基本为球体，直径例如为约100微米至约5毫米。
[0107]
在用于运输细胞的方法的方面中，包括腔室和/或在腔室内的每个微腔体在内的细胞培养制品还可包括不透明侧壁和/或透气且不透液体的底部，其包括至少一个凹形表面。在一些实施方式中，包括至少一个凹形表面的至少一部分底部是透明的。具有这些特征的细胞培养制品(例如微腔体球体板、微腔体插入件、微腔体插入板等)可以为本公开的方
法提供若干优点，包括不需要将培养的细胞球体从一个多孔板(其中形成球体并且可以可视化)转移到另一个板以进行测定，因此节省了时间并避免了任何不必要的球体破坏。另外，透气性底部(例如，由在特定的给定厚度下具有透气性质的聚合物制成的孔底部)可使得3d球体或类器官接收的氧合增加。示例性的透气性底部可以由一定厚度的多种类型的聚合物或聚合物掺混物形成，包括聚苯乙烯，聚烯烃(例如聚4-甲基戊烷或聚乙烯、聚丙烯及其共聚物)，聚碳酸酯，全氟聚合物或者诸如聚二甲基硅氧烷之类的聚合物。取决于所用的特定聚合物的氧气和二氧化碳的渗透性，透气性聚合物的代表性厚度和范围可以是，例如，约0.001英寸至约0.025英寸，0.0015英寸至约0.03英寸，包括其中的数值和范围(其中1英寸＝25,400微米；0.000039英寸＝1微米)。附加或替代地，具有高透气性的其他材料，例如聚二甲基硅氧烷聚合物，可以在例如厚达约1英寸的厚度下提供足够的气体扩散。
[0108]
在用于运输细胞的方法中，细胞培养制品还可包括腔室附件，腔室延伸区域或辅助侧腔室，以用于接收用于抽吸的移液器吸头，腔室附件或腔室延伸部(例如，侧袋)可以是，例如，与腔室相邻并与腔室流体连通的整体表面。腔室附件可具有与腔室的液体不可渗透的底部和/或腔室内的微腔体间隔开的第二底部。腔室附件和腔室附件的第二底部可以例如与腔室的液体不可渗透的底部间隔开，例如在较高的高度或相对高度处。腔室附件的第二底部使从移液器分配的流体偏离腔室的液体不可渗透的底部(以及腔室内的每个微腔体的液体不可渗透的底部)，以避免破坏或干扰球体。
[0109]
在用于运输细胞的方法(以及本公开的细胞贮存和运输系统)的方面中，所述细胞可以是任何来源的未经改造或者经基因改造的细胞。因此，细胞可包括动物细胞，包括但不限于人细胞、大鼠细胞、小鼠细胞、猴细胞、猪细胞、狗细胞、豚鼠细胞和鱼细胞。细胞还可包括病理或非病理来源的已知的确立细胞系和原代动物细胞培养物(包括癌细胞系)。此类细胞包括但不限于肝细胞、肾细胞、神经元、神经胶质细胞、非神经胶质细胞、成骨细胞、骨细胞、破骨细胞、成软骨细胞、软骨细胞、成纤维细胞、角质形成细胞、黑素细胞、腺细胞、角膜细胞、视网膜细胞、间充质细胞干细胞、造血干细胞、胚胎干细胞、诱导多能干细胞、上皮细胞、血小板、胸腺细胞、淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、肌细胞、尿道细胞和/或生殖细胞。
[0110]
在用于运输细胞的方法的一些方面中，a)包括：针对培养中的特定细胞类型，将细胞维持在标准培养条件直到达到b)。在本公开方法的一些实施方式中，形成3d球体或类器官的经培养的细胞作为长期培养物来培养。在一些实施方式中，使所培养的细胞培养至少约12小时，任选地，培养至少约24小时，至少约48小时，或至少约72小时，至少约96小时，至少约7天，至少约14天，至少约21天，或者至少约28天，或者在一些类器官的情况中，培养至少约3-4个月。长期培养促进了功能性质的确立，例如培养物中的代谢途径。
[0111]
在运输细胞的方法的一些方面中，b)包括：向在37℃下培养的细胞添加细胞贮存和运输介质。在一些方面中，在b)中的添加细胞贮存和运输介质之前，移除用于培养3d球体细胞或类器官的任何细胞培养基。
[0112]
在运输细胞的方法的一些方面中，c)在约4℃的温度下进行，以使得细胞贮存和运输介质是坚固凝胶。在运输细胞的方法的一些方面中，d)的运输经培养的制品在约4℃的温度下进行，以使得细胞贮存和运输介质是坚固凝胶，并因此提供足够的强度以在运输期间维持细胞活力和完整性。
[0113]
在运输细胞的方法的一些方面中，运输时间不超过48小时或者不超过72小时。在
一些方面中，运输时间在0-48小时之间或0-72小时之间，包括其间的任何数值或范围。运输可以是本领域已知的任何运输方法，包括由卡车、汽车、飞机、船等运输。
[0114]
在运输细胞的方法的一些方面中，所述方法还包括在运输前密封细胞培养腔室。例如，在细胞培养制品的腔室的每个微腔体的顶孔中形成的开口部分可以被密封装置(例如，膜、帽或盖)覆盖，以在贮存/运输期间使细胞与外界分离。如本领域已知的，密封装置可以由阻挡或允许液体或气体流动的材料制成，例如，阻挡或允许二氧化碳或氧气渗透的材料。
[0115]
在运输细胞的方法的方面中，所述方法还包括e)回收运输的细胞，以使得它们可用于不同的应用，包括进一步的培养和/或测试。在一些方面中，e)包括：移除细胞贮存和运输介质以及用培养介质对其进行替换。在一些方面中，e)包括：在约37℃下孵育细胞培养制品至少约1小时；以及随后移除细胞贮存和运输介质并用培养介质对其进行替换。因此，细胞贮存和运输介质的固体凝胶状态在37℃时可逆转成液体状态，以允许3d球体或类器官细胞培养的处理和回收。在一些方面中，e)包括：向细胞贮存和运输介质添加约37℃的细胞培养基；在约37℃下孵育细胞培养制品至少约1小时；以及移除细胞贮存和运输介质并用培养介质对其进行替换。在一些方面中，e)包括：在约37℃下孵育细胞培养制品至少约1小时；以及随后移除细胞贮存和运输介质，并且从细胞培养制品提取3d球体或类器官细胞。
[0116]
方面
[0117]
本文描述了组合物、系统和方法的各个方面。下文提供了这些组合物、系统和方法的一些选择的实例概述。
[0118]
第1方面是一种细胞贮存和运输介质，其包括细胞培养介质和琼脂糖和甲基纤维素的混合物，其中，贮存和运输介质中的最终的琼脂糖浓度为约0.5％至约1.0％，并且贮存和运输介质中的最终的甲基纤维素浓度为约0.5％至约0.7％。
[0119]
第2方面是第1方面的细胞贮存和运输介质，其中，琼脂糖是超低胶凝温度琼脂糖。
[0120]
第3方面是第1或第2方面的细胞贮存和运输介质，其中，琼脂糖具有8-17℃的胶凝温度。
[0121]
第4方面是方面1-3中任一方面的细胞贮存和运输介质，其中，细胞贮存和运输介质在4℃时是坚固凝胶。
[0122]
第5方面是方面1-4的细胞贮存和运输介质，其中，细胞贮存和运输介质在23℃时是软凝胶。
[0123]
第6方面是方面1-5中任一方面的细胞贮存和运输介质，其中，细胞贮存和运输介质在37℃时是粘性液体。
[0124]
第7方面是一种细胞贮存和运输系统，所述系统包括：细胞；细胞培养制品，其中，所述细胞培养制品包括腔室，所述腔室包括微腔体阵列，每个微腔体经结构化以限制细胞以3d球体构造生长；以及细胞贮存和运输介质，其包括细胞培养介质、琼脂糖和甲基纤维素的混合物，其中，贮存和运输介质中的最终的琼脂糖浓度为0.5％至1.0％，并且贮存和运输介质中的最终的甲基纤维素浓度为约0.5％至约0.7％。
[0125]
第8方面是如方面7所述的细胞贮存和运输系统，其中，所述腔室的每个微腔体包括：顶孔和液体不可渗透的底部，所述底部包括底表面，其中，至少一部分的底部在底表面之中或之上包括低粘性或无粘性材料。
[0126]
第9方面是如方面8所述的细胞贮存和运输系统，其中，包含底表面的液体不可渗透的底部是透气性的。
[0127]
第10方面是如方面8-9中任一方面所述的细胞贮存和运输系统，其中，底表面包括凹形底表面。
[0128]
第11方面是如方面8-10中任一方面所述的细胞贮存和运输系统，其中，至少一部分的底部是透明的。
[0129]
第12方面是如方面10所述的细胞贮存和运输系统，其中，凹形表面包括半球形表面，从侧壁到底表面具有30至约60度的锥度的锥形表面，或其组合。
[0130]
第13方面是如方面7-12中任一方面所述的细胞贮存和运输系统，其中，所述腔室的每个微腔体还包括侧壁。
[0131]
第14方面是如方面13所述的细胞贮存和运输系统，其中，侧壁表面包括垂直圆柱体，从腔室的顶部到底表面直径减小的垂直圆锥体的一部分，锥形过渡到凹形底表面的垂直方筒，或其组合。
[0132]
第15方面是如方面7-14中任一方面所述的细胞贮存和运输系统，其中，所述细胞培养制品包括1至约2000个所述腔室，其中，每个腔室与任何其他腔室物理分离。
[0133]
第16方面是方面7-15中任一方面的细胞贮存和运输系统，其中，琼脂糖是超低胶凝温度琼脂糖。
[0134]
第17方面是方面7-16中任一方面的细胞贮存和运输系统，其中，琼脂糖具有8-17℃的胶凝温度。
[0135]
第18方面是方面7-17中任一方面的细胞贮存和运输系统，其中，细胞储存和运输介质在4℃时是坚固凝胶。
[0136]
第19方面是方面7-18中任一方面的细胞贮存和运输系统，其中，细胞储存和运输介质在23℃时是软凝胶。
[0137]
第20方面是方面7-19中任一方面的细胞贮存和运输系统，其中，细胞贮存和运输介质在37℃时是粘性液体。
[0138]
第21方面是一种用于运输细胞的方法，所述方法包括：a)在细胞培养制品中培养活细胞以形成球体或类器官，其中，所述细胞培养制品包括腔室，所述腔室包括微腔体阵列，每个微腔体经结构化以限制细胞以3d球体或类器官构造生长；b)向细胞培养物添加细胞贮存和运输介质，其包括细胞培养介质、琼脂糖和甲基纤维素的混合物，其中，贮存和运输介质中的最终的琼脂糖浓度为约0.5％至约1.0％，并且贮存和运输介质中的最终的甲基纤维素浓度为约0.5％至约0.7％；c)固化细胞贮存和运输介质；和d)运输细胞培养制品。
[0139]
第22方面是如方面21所述的方法，其还包括：其中，所述腔室的每个微腔体包括：顶孔和液体不可渗透的底部，所述底部包括底表面，其中，至少一部分的底部在底表面之中或之上包括低粘性或无粘性材料。
[0140]
第23方面是如方面22所述的方法，其中，包括底表面的所述液体不可渗透的底部是透气性的。
[0141]
第24方面是如方面22-23中任一方面所述的方法，其中，底表面包括凹形底表面。
[0142]
第25方面是如方面22-24中任一方面所述的方法，其中，至少一部分的底部是透明的。
[0143]
第26方面是如方面22-25中任一方面所述的方法，其中，凹形表面包括半球形表面，从侧壁到底表面具有30至约60度的锥度的锥形表面，或其组合。
[0144]
第27方面是如方面21-26中任一方面所述的方法，其中，所述腔室的每个微腔体还包括侧壁。
[0145]
第28方面是如方面27所述的方法，其中，侧壁表面包括垂直圆柱体，从腔室的顶部到底表面直径减小的垂直圆锥体的一部分，锥形过渡到凹形底表面的垂直方筒，或其组合。
[0146]
第29方面是如方面21-28中任一方面所述的方法，其中，所述细胞培养制品包括1至约2000个所述腔室，其中，每个腔室与任何其他腔室物理分离。
[0147]
第30方面是方面21-29中任一方面的方法，其中，琼脂糖是超低胶凝温度琼脂糖。
[0148]
第31方面是方面21-30中任一方面的方法，其中，琼脂糖具有8-17℃的胶凝温度。
[0149]
第32方面是方面21-31中任一方面的方法，其中，细胞贮存和运输介质在4℃时是坚固凝胶。
[0150]
第33方面是方面21-32中任一方面的方法，其中，细胞贮存和运输介质在23℃时是软凝胶。
[0151]
第34方面是方面21-33中任一方面的方法，其中，细胞贮存和运输介质在37℃时是粘性液体。
[0152]
第35方面是方面21-34中任一方面的方法，其中，b)包括：在37℃时，向3d球体细胞或类器官添加细胞贮存和运输介质。在一些方面中，在b)中的添加细胞贮存和运输介质之前，移除用于培养3d球体细胞或类器官的任何细胞培养基。
[0153]
第36方面是如方面21-35中任一方面的方法，其中，步骤c)在约4℃的温度时进行。
[0154]
第37方面是如方面21-36中任一方面的方法，其中，步骤d)在约4℃的温度时进行。
[0155]
第38方面是方面21-37中任一方面的方法，其中，运输时间不超过48小时或72小时。
[0156]
第39方面是如方面21-38中任一方面的方法，其还包括：密封细胞培养腔室。
[0157]
第40方面是方面21-39中任一方面的方法，其还包括：e)回收运输的细胞。
[0158]
第41方面是方面40的方法，其中，e)包括：移除运输介质并用培养介质对其进行替换。
[0159]
第42方面是方面40的方法，其中，e)包括：在约37℃下孵育细胞培养制品至少约1小时；以及随后移除运输介质并用培养介质对其进行替换。
[0160]
第43方面是方面40的方法，其中，e)包括：向运输介质添加约37℃的细胞培养基；在约37℃下孵育细胞培养制品至少约1小时；以及移除运输介质并用培养介质对其进行替换。
[0161]
第44方面是方面40的方法，其中，e)包括：在约37℃下孵育细胞培养制品至少约1小时；以及随后移除运输介质并从细胞培养制品提取3d球体细胞。
[0162]
实施例
[0163]
以下实施例用于说明本公开的某些优选的实施方式和方面，并不构成对其范围的限制。
[0164]
实施例1
[0165]
细胞贮存和运输介质制剂
[0166]
先前的细胞贮存和运输介质评估证明，超低胶凝琼脂糖溶液的最大浓度为1.0％且最小浓度为0.5％，并且甲基纤维素溶液的最大浓度为1％。所述混合物还展现出非牛顿流体的一些性质，因为如果混合物在37℃时看上去是固体，则在混合物上施加剪切力(通过敲打容器)将造成混合物液化。这种性质常称为“剪切稀化”。此处，进一步评估超低胶凝琼脂糖和甲基纤维素的浓度范围。
[0167]
材料
[0168]
初始评估：超低胶凝温度琼脂糖(agr-l，西格玛公司目录号a5030)，在细胞培养级别水中制备成4％并蒸汽灭菌；甲基纤维素浓缩物(mc,r&d systems公司，目录号：hsc011)2.8％(在水中，灭菌)；2x imdm(来自4x母液)，其补充有20％fbs(胎牛血清)，4mm glutagrotm,6.04g/l碳酸氢钠(nahco3)和2x its(胰岛素，转铁蛋白，硒)溶液；1x imdm，无补充；细胞培养级别水；和ula(超低附着)涂覆的60mm盘。
[0169]
用下述进行细胞培养评估：在t25微腔体容器中生成的ht-29球体培养物；生长介质是具有10％fbs的mccoy’s培养基；用evos-fl显微镜观察球体培养物；tryple和trypsin/edta用作解离剂；并且用于细胞计数和活力评估。
[0170]
冷贮存后的性能/评估
[0171]
在室温下评估细胞贮存和运输介质样品，以随着贮存温度从4℃变化到室温，监测溶液的粘稠性。
[0172]
方法
[0173]
无细胞培养的情况下的初始评估：
[0174]
1.超低胶凝温度琼脂糖(agr-l)溶液：
[0175]
a.2％agr-l(12ml),4％agr-l和2x imdm的1:1稀释液
[0176]
b.1％agr-l(8ml),2％agr-l和1x imdm的1:1稀释液
[0177]
2.甲基纤维素(mc)溶液
[0178]
a.2％mc(8ml)，用2x imdm稀释2.8％母液
[0179]
b.1.4％mc(5ml)，2.8％母液和2x imdm的1:1稀释液
[0180]
c.1％mc(5ml)，2％(母液)和1x imdm的1:1稀释液
[0181]
d.0.7％mc(5ml)，1.4％(母液)和1x imdm的1:1稀释液
[0182]
3.细胞贮存和运输介质制剂，每个样品具有1％agr-l,4ml
[0183]
a.1％agr-l&1％mc——2％agr-l和2％mc的1:1稀释液
[0184]
b.1％agr-l&0.7％mc——2％agr-l和1.4％mc的1:1稀释液
[0185]
c.1％agr-l&0.5％mc——2％agr-l和1％mc的1:1稀释液
[0186]
d.1％agr-l&0.35％mc——2％agr-l和0.7％mc的1:1稀释液
[0187]
4.细胞贮存和运输介质制剂，每个样品具有0.5％agr-l,4ml
[0188]
a.0.5％agr-l&1％mc——2％agr-l和2％mc的1:1稀释液
[0189]
b.0.5％agr-l&0.7％mc——2％agr-l和1.4％mc的1:1稀释液
[0190]
c.0.5％agr-l&0.5％mc——2％agr-l和1％mc的1:1稀释液
[0191]
d.0.5％agr-l&0.35％mc——2％agr-l和0.7％mc的1:1稀释液
[0192]
5.将tm溶液分配到ula涂覆的60mm盘中
[0193]
6.在37℃下孵育所述盘20分钟，然后转移到4℃贮存过夜
[0194]
7.在冷贮存后对培养基制剂评估以下性质：
[0195]
a.细胞贮存和运输介质在冷温度下固化并且随着其达到室温而保持固体的能力
[0196]
b.细胞贮存和运输介质因敲打而相变(固体变为液体)的能力
[0197]
8.评估从培养物(盘)移除细胞贮存和运输介质的容易性
[0198]
a.为了稀释细胞贮存和运输介质，向每个盘添加2ml的pbs，在37℃下孵育所述盘30分钟
[0199]
b.从盘中移除/抽吸细胞贮存和运输介质
[0200]
c.反复稀释/孵育周期共三次
[0201]
注释/评论
[0202]
agr-l和mc的1％浓度的制剂太稠并且难以操作。
[0203]
用浓度低于0.7％的mc配制的细胞贮存和运输介质极易操作；易于在盘中均匀混合、分配以及铺展开。
[0204]
在37℃下孵育后，除1％的细胞贮存和运输介质制剂外，其余所有均相变(液化)并在盘中均匀铺展开。
[0205]
0.5％agr-l/0.35％的组合太稀。
[0206]
结果
[0207]
冷贮存后的1％agr-l tm制剂
[0208]
1％agr-l/1％mc是稠的溶液并且在寒冷温度下是固体。溶液在敲打的情况下未相变(液化)。图5a示出了当盘向前倾斜时，作为从表面滑落的固体塞物的制剂。
[0209]
1％agr-l/0.7％mc是稠的溶液并且在寒冷温度下是固体，在敲打后，材料有一定的液化。材料在室温下迅速软化成粘性凝胶状材料。图5b示出了当盘向前倾斜时，作为保留在表面上的稠/粘材料的薄覆盖物的制剂。
[0210]
1％agr-l/0.5％mc——该制剂与具有0.7％mc的制剂极为相似，其在制备期间更易混合。虽然在寒冷温度下为固体，但是其在室温下迅速软化成粘性凝胶状材料，并且在敲打后液化。图5c示出了当盘向前倾斜时，作为保留在表面上的粘性材料的制剂。
[0211]
1％agr-l/0.35％mc——该制剂在4℃时不固化，而是形成为软材料，其在离开冷贮存后迅速液化。图5d示出了随着盘略微向前倾斜，制剂液体在底部汇集。
[0212]
在冷贮存后以及使得在达到室温(23℃)后的1％agr-l细胞贮存和运输介质制剂。图6示出了使得在达到室温后，在ula涂覆的60mm盘中的1％agr-l细胞贮存和运输介质制剂的图像。图6从左到右示出了1％agr-l/0.35％mc，1％agr-l/0.5％mc，1％agr-l/0.7％mc和1％agr-l/1.％mc。将盘向前倾斜以证明细胞贮存和运输介质制剂在室温时的粘稠性。0.35％mc制剂的组分在室温时分离。图片显示出，液体组分在盘的底部处汇集，而较稠的组分保留在盘的表面上。0.5％至0.7％mc浓度迅速软化成粘性凝胶状材料，但是显示出保留在表面，即使当向前倾斜时也如此。对于0.5％浓度，观察到液体培养基与其他组分有略微的分离。图片显示出在盘的底部处有小滩的液体(培养基)，而粘性材料保持在原位。1％mc制剂保持为固体并且有一些液体分离。
[0213]
冷贮存后的0.5％agr-l细胞贮存和运输介质制剂
[0214]
0.5％agr-l/1％mc——其是稠的溶液但是易于操作。其在4℃时形成固体塞物。图7a示出了当盘向前倾斜时，向下滑的制剂塞物。在敲打后，材料确实有略微软化。
[0215]
0.5％agr-l/0.7％mc—对于混合和制备极类似于上述制剂。在寒冷温度下为固体，敲打增加了相从固体到粘性凝胶的改变。图7b示出了随着盘向前倾斜时的制剂——保留在原位的粘性材料。
[0216]
0.5％agr-l/0.5％mc—在混合步骤期间易于操作。在4℃时，其形成为稠的凝胶状材料。图7c示出了随着盘向前倾斜时的制剂——向下滑动的凝胶状材料。
[0217]
0.5％agr-l/0.35％mc—在混合步骤期间易于操作。如图7d所示，制剂在4℃时不固化，而是形成凝胶状材料，一旦从冷贮存取出，其迅速变成粘性液体。
[0218]
在冷贮存后以及在使得达到室温后的0.5％agr-l细胞贮存和运输介质制剂。图8示出了使得在达到室温后，在ula涂覆的60mm盘中的0.5％agr-l细胞贮存和运输介质制剂的图像。图8从左到右示出了0.5％agr-l/0.35％mc，0.5％agr-l/0.5％mc，0.5％agr-l/0.7％mc和0.5％agr-l/1.0％mc。将盘向前倾斜以证明制剂在室温时的粘稠性。0.35％mc制剂在室温时变成稠的液体，并且可见到细胞贮存和运输介质制剂的组分分离。0.7％和0.5％mc制剂在室温时均迅速变为粘性凝胶，并且在敲打后组分(agr-l和mc)有一些分离。1.0％mc制剂在室温时软化成凝胶状塞物。
[0219]
注释/评论
[0220]
1.0％agr-l制剂在室温时保持较稠/更像固体的粘稠性。
[0221]
0.5％agr-l制剂在室温时迅速变为软凝胶。
[0222]
较低的agr-l和mc的组合似乎不稳定，因为在冷贮存后组分从溶液中出来。
[0223]
细胞贮存和运输介质制剂的移除。为了评估移除细胞贮存和运输介质制剂的容易性，向样品添加pbs(2ml/盘)。然后在37℃下孵育样品30分钟。从盘中抽吸出稀释/软化的细胞贮存和运输介质制剂。反复稀释/热周期共三次。结果示于图9。图9示出了在三次稀释/热周期以及移除液化/软化的材料后，具有残余的细胞贮存和运输介质制剂材料的ula涂覆的60mm盘的图像。图9显示的盘带盖以用于识别目的。在图9中，上排的样品从左到右包括：1.0％agr-l/1％mc，1.0％agr-l/0.7％mc，1.0％agr-l/0.5％mc和1.0％agr-l/0.35％mc，而下排的样品从左到右包括0.5％agr-l/1.0％mc，0.5％agr-l/0.7％mc，0.5％agr-l/0.5％mc和0.5％agr-l/0.35％mc。
[0224]
注释/评论
[0225]
对于所有的1％agr-l组合(图9的上排)，在稀释/抽吸步骤后，细胞贮存和运输介质制剂的固体块保留在盘中。
[0226]
用1％mc配制的细胞贮存和运输介质也难以溶解/稀释。
[0227]
在0.5％agr-l(图9的下排)，容易从盘中移除大部分细胞贮存和运输介质制剂，尤其是当在较低的mc浓度(0.5％至.35％)下操作时。
[0228]
在0.35％mc时，观察到材料有一些分离/凝结。
[0229]
概要
[0230]
0.5％agr-l制剂在冷贮存时保持粘稠状的粘稠度但是在室温下迅速软化。当与1.0％agr-l制剂相比时，它们在较暖的温度下更难以操作，但是更易从培养物中移除。
[0231]
1.0％mc浓度的操作难度太大，并且其不产生易于移除的期望粘度。
[0232]
0.35％mc浓度似乎太低而不能保持细胞贮存和运输介质制剂的期望粘稠性。
[0233]
0.5％agr-l制剂在室温时迅速变为软凝胶。
[0234]
较低的agr-l和mc的组合似乎不稳定，因为在冷贮存后组分从溶液中出来。
[0235]
细胞培养评估
[0236]
就细胞培养而言来评估细胞贮存和运输介质样品，尤其是相比于1.0％agr-l/0.7％mc制剂，0.5％agr-l浓度以及0.7％至0.35％的mc浓度范围。
[0237]
方法
[0238]
1.在t25微腔体烧瓶中产生ht-29球体(48小时培养物)。
[0239]
2.制备细胞贮存和运输介质制剂以用于评估；
[0240]
a.1％agr-l/0.7％mc(对照)
[0241]
b.0.5％agr-l和浓度为0.7％、0.5％和0.35％的mc
[0242]
3.从容器移除废介质，用4ml的细胞贮存和运输介质制剂替换。每个条件一个容器。
[0243]
4.在37℃下孵育烧瓶30分钟以使细胞贮存和运输介质制剂均匀散布。
[0244]
5.将烧瓶封闭在具有冰袋的聚苯乙烯泡沫箱(styrofoam box)中以模拟运送条件。将箱子在4℃下贮存过夜。
[0245]
6.运送/掉落测试；从冷贮存下取出箱子，翻转并掉落箱子四次以模拟运送条件。
[0246]
7.就球体的健康情况，球体保留，从细胞培养物移除细胞贮存和运输介质制剂的容易性方面来评估培养物。
[0247]
a.通过追踪球体培养物的生长来监测细胞健康
[0248]
b.通过对评估前后的培养物进行成像来监测球体保留
[0249]
c.利用三个稀释/热周期从容器移除细胞贮存和运输介质制剂，以评估细胞贮存和运输介质制剂的移除。
[0250]
注释/评论
[0251]
0.5％agr-l/0.5％mc浓度最易混合和操作。
[0252]
0.5％和0.35％mc细胞贮存和运输介质制剂太稀，在初始向烧瓶添加细胞贮存和运输介质制剂期间，球体有一些脱落。
[0253]
在冷条件(4℃)下，对于所有的细胞贮存和运输介质制剂，在运送/掉落测试后，球体保持在原位。
[0254]
在细胞贮存和运输介质制剂评估后，对球体培养物没有明显的不利影响，所有培养物看上去均类似于对照。
[0255]
细胞贮存和运输介质制剂移除和培养物回收的结果
[0256]
图10a-c、图11a-c、图12a-c、图13a-c和图14示出了结果。
[0257]
图10a-c示出了1％agr-l/0.7％mc制剂(对照)的ht-29球体培养物的图像(在2x放大倍数下)。图10a示出了在4℃贮存后球体培养物的图像，在这期间，球体保持在原位。图10b示出了在三次稀释周期后的图像，其中，约20％的tm以覆盖表面的凝胶状材料形式保留在容器中。在移除了细胞贮存和运输介质后，球体看上去有点不规则。图10c示出了在移除了细胞贮存和运输介质24小时后，处于回收阶段的ht29球体培养物的图像。
[0258]
图11a-c示出了0.5％agr-l/0.7％mc制剂的ht-29球体培养物的图像(在2x放大倍数下)。图11a示出了在4℃贮存后球体培养物的图像，在这期间，球体保持在原位。图11b示出了在三次稀释周期后从培养容器移除99％的细胞贮存和运输介质之后的图像，并且具有
最少的球体损失。图11c示出了在移除了细胞贮存和运输介质24小时后，处于回收阶段的球体培养物的图像。
[0259]
图12a-c示出了0.5％agr-l/0.5％mc制剂的ht-29球体培养物的图像(在2x放大倍数下)。图12a示出了在4℃贮存后球体培养物的图像，其指示已经有一些球体从微腔体脱落。图12b示出了在三次稀释周期后从球体培养容器移除99％的细胞贮存和运输介质之后的图像，并且具有最少的球体损失，其再次显示出一些球体的移位。图12c示出了在移除了细胞贮存和运输介质24小时后的培养物图像，其中，细胞球体处于回收阶段。在微腔体中观察到痕量的细胞贮存和运输介质，并且由于球体移位，许多微腔体看上去是空的。
[0260]
图13a-c示出了0.5％agr-l/0.35％mc制剂的ht-29球体培养物的图像(在2x放大倍数下)。图13a示出了在4℃后培养物的图像，其指示已经有一些球体从微腔体脱落。图12b示出了在三次稀释周期后从球体培养容器移除99％的细胞贮存和运输介质之后的图像，其具有明显的球体损失。图12c示出了在移除了细胞贮存和运输介质24小时后，处于回收阶段的球体培养物的图像，其中，由于球体移位，许多微腔体看上去是空的。
[0261]
图14示出了关于球体健康的结果。通过球体生长(尺寸测量)来监测球体细胞健康。在添加细胞贮存和运输介质制剂之前，在4℃下贮存之后以及运送测试评估(包括移除细胞贮存和运输介质制剂)后的48小时之后，进行尺寸测量。测量值(图14)指示，在冷贮存后或回收阶段期间，没有不利的副作用(球体解离或尺寸改变)。
[0262]
注释/评论
[0263]
0.35％mc浓度太低，其不能有效地防止球体在运输评估期间移位。
[0264]
具有0.7％mc和0.5％mc浓度的0.5％agr-l细胞贮存和运输介质制剂在球体保留方面类似于对照，但是更易从培养物移除。
[0265]
结论/概述
[0266]
进行评估以确定本公开的细胞贮存和运输介质的琼脂糖和甲基纤维素组分的可接受的浓度范围。
[0267]
先前的工作确立了1.0％至0.5％为琼脂糖组分的可接受的工作范围。现有的对照制剂是在imdm中的1％agr-l/0.7％mc。
[0268]
1％mc浓度使得太难从培养物移除。
[0269]
0.35％mc情况显示出在评估期间有最高的球体损耗并且最不稳定。
[0270]
0.7％至0.5％的甲基纤维素(mc)范围在运输测试过程中维持球体在原位，易于操作，以及在评估后易于从球体培养物移除方面很有效。
[0271]
基于上述，细胞贮存和运输介质制剂范围包括1.0％至0.5％agr-l和0.7％至0.5％mc。
[0272]
实施例2
[0273]
贮存测试
[0274]
确定在细胞贮存和运输介质中进行贮存测试的球体中细胞的活力评估。用ht-29细胞(人结肠癌细胞)进行该评估。细胞贮存和运输介质包括超低胶凝温度琼脂糖(agr-l，西格玛产品#a5030)和甲基纤维素(r&d systems产品#hsc006)，并且对两种物质的胶凝性质进行改性，以为作为球体的运输细胞提供理想条件。在水中制备浓度为2％的agr-l，然后用2x浓缩细胞培养介质稀释到1％以维持适当的介质组分浓度。当与甲基纤维素介质以1:1
混合时，agr-l变成0.5％。甲基纤维素以在介质(imdm)中的1.4％母液溶液原样使用，当与agr-l混合时，其变成稀释到0.7％。比值为1:1的甲基纤维素和琼脂糖能够在4℃时形成凝胶，并且在37℃时返回到粘性液体状态。所述混合物还展现出非牛顿流体的一些性质，因为如果混合物在37℃时看上去是固体，则在混合物上施加剪切力(通过敲打容器)将造成混合物液化。这种性质常称为“剪切稀化”。
[0275]
图15a-d示出了贮存测试的结果，图15a-d是用绿色荧光蛋白(gfp)标记的ht-29细胞的图像，其已经形成了球体。图15a示出了在具有10％fbs的mccoy’s普通细胞培养生长介质中的球体。图15b示出了在4℃下贮存24小时后，在细胞贮存和运输介质(0.5％超低胶凝温度琼脂糖/0.7％r&d systems imdm甲基纤维素介质)中的细胞。图15c示出了移除细胞贮存和运输介质并用生长介质替换后的24小时的细胞。图15d示出了移除细胞贮存和运输介质后的48小时的细胞，并且细胞已经用碘化丙啶染色以检测细胞死亡。死细胞看上去会是红色，但是没有检测到红色。该活力评估数据证明了使用本公开的细胞贮存介质、系统和方法可以成功地贮存球体中的细胞。
[0276]
实施例3
[0277]
模拟运输测试
[0278]
确定在细胞贮存和运输介质中进行模拟运输测试的球体中细胞的活力评估。如下文以及如图16所阐述的进行运输介质实验：1)移除普通培养介质并且用运输介质替换。2)将微腔体培养容器放置在37℃下1小时。3)将运输介质中的微腔体培养物移到4℃并维持24小时。4)将测试容器封装到具有冰袋的聚苯乙烯泡沫箱中以保持运输介质为固体状态。5)抛掷及晃动容纳有微腔体容器并且所述微腔体容器具有在运输介质中的球体的聚苯乙烯泡沫箱，以模拟运输条件。6)从聚苯乙烯泡沫箱中取出微腔体容器并且放置在橱中，向其中添加37℃的培养介质。7)将微腔体容器放置在37℃下1小时或者直到微腔体容器中的介质稀到足以在不干扰球体的情况下移除。8)移除稀释的运输介质并且用新鲜培养介质替换。9)在评估球体中的细胞的活力之前，将微腔体容器放回孵育器并维持24小时。10)使用胰蛋白酶/edta将球体解离成单个细胞，并且使用nucleocounter计数器获得活力。为了比较，对照使用未经受过运输测试的球体的细胞。使用本公开的细胞贮存和运输介质进行模拟运输测试的细胞之间的活力比较证明了优异的活力(数据未示出)，证明了使用本公开的细胞贮存介质、系统和方法可以成功的贮存和运输球体中的细胞。
[0279]
*有或没有血清，其他列出和已知的介质。
[0280]
上述说明书中提及的所有出版物和专利都通过引用纳入本文。对本领域技术人员显而易见的是，可以对本发明技术进行各种修改和变动而不偏离本公开的精神和范围。虽然已结合具体的优选实施方式对本公开作了描述，但应了解，如权利要求所述，本公开不应过分地受限于这些具体实施方式。因为本领域技术人员可以结合本发明技术的精神和实质，对所述的实施方式进行各种改良、组合、子项组合和变化，因此应认为本发明技术包括所附权利要求书范围内的全部内容及其等同内容。