一种套膜海葵多肽毒素Ap-GR及其制备方法和应用与流程

一种套膜海葵多肽毒素ap-gr及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明涉及天然药物技术领域，特别涉及一种套膜海葵多肽毒素ap-gr及其制备方法和应用。


背景技术：

2.节肢动物害虫分布于世界的各个角落，破坏了全球约20％-30％的食物供应，而且它们也是许多人类疾病传播的罪魁祸首。近年来，随着化学农药的滥用，已导致许多昆虫物种产生抗药性和农产品农药残留超标等严重问题，农业污染日益严重。
3.为解决农业环境危机和生态安全问题，研发新型、高效、安全生物杀虫剂迫在眉睫。如今世界许多国家从蛇毒、蝎毒、蜘蛛毒、海洋和植物等天然生物资源中筛分和鉴定各种有效生理活性成分，并利用这些天然神经生物毒素构建新型的生物杀虫剂和抗病虫害植物体系。目前，捕食昆虫的动物例如海葵、芋螺、蝎子、蜘蛛和捕食性螨等分泌的多肽类毒素，其通过昆虫的特异性离子通道或受体而起到毒杀和捕获猎物，但其对哺乳动物的毒性很小或无毒副作用。其中，海葵毒素由于其主要作用对象为甲壳类动物,因而在生物毒素来源的杀虫剂开发中受到重视。因此，开展从海葵等海洋有毒生物资源中寻找杀虫活性多肽已成为高效安全杀虫剂研究的热点之一。
4.海葵(sea anemone)属刺胞动物门(cnidaria)、珊瑚虫纲(anthozoa)、六放珊瑚亚纲(hexacorallia)。海葵的适应能力很强，在从潮间带到深渊海底、从热带水域到两极海域的各种海洋环境中都有分布,且在一些海域生物量很大,是重要的生态类群。目前,全球已记录海葵目约50科、400属、1100余种。海葵毒素作为海葵捕食防御的重要武器，其具有复杂多样的成分、特殊的空间结构与强的毒理活性已成为海洋药物与活性物质研究领域的热点。《中华本草》和《中国药用动物志》记载海葵具有收敛固涩、燥湿杀虫等功效，中医用来治疗脱肛、痔疮、绕虫病等。《青岛中草药手册》记载治蛲虫病：将海葵1块塞入肛门，每晚1次，连用1周。现代药理学研究也表明，海葵多肽毒素具有杀虫、抗肿瘤、降压、抗菌、镇痛和神经抑制的作用。在我们之前的研究工作中，已经发现海葵多肽ap-txⅰ可以防治黄粉虫(专利号cn112724220a)，尚未发现可以防治其他节肢动物害虫的海葵多肽。


技术实现要素：

5.鉴以此，本发明提出一种套膜海葵多肽毒素ap-gr及其制备方法和应用。
6.本发明的技术方案是这样实现的：
7.一种套膜海葵多肽毒素ap-gr，其氨基酸序列为gipcrcdknsdelngqrsnvggncgagwkkcrsvnaifnccqkav。
8.优选的，采用fmoc固相多肽合成法，根据如上所述的氨基酸序列，从c端到n端依次缩合，经切割、纯化、氧化折叠处理，制备得到所述套膜海葵多肽毒素ap-gr，具体包括以下步骤：
9.(1)称取树脂，用dcm(二氯甲烷)浸泡5～10min，依次用dmf(n.n-二甲基甲酰胺)、
dcm洗涤，加入fmoc-gly(tbu)-oh，再加入dcm和diea(n,n-二异丙基乙胺)反应80～100min，再加入甲醇和dcm，封闭反应30～40min后，用dmf洗涤，加入哌啶溶液反应20～30min，再用dmf洗涤，得树脂a；
10.(2)向树脂a中加入下一个氨基酸fmoc-ile-oh和缩合剂，再加入dmf和dic反应0.8～1.2h后，用dmf洗涤，得树脂b；
11.(3)向树脂b中加入哌啶溶液反应20～30min，用dmf洗涤；
12.(4)重复步骤(2)和步骤(3)直到肽链结束，得线性肽树脂；
13.(5)向线性肽树脂中加入甲醇进行抽干处理后，加入切割液，摇晃切割，过滤，向滤液中加入冰乙醚，摇晃均匀后离心，弃上清，得粗品多肽，用hplc分离粗品多肽，干燥，得线性肽；
14.(6)取步骤(5)的线性肽进行氧化折叠，采用制备型hplc进行纯化，得纯品套膜海葵多肽毒素ap-gr。
15.优选的，所述树脂为取代度sd＝0.2～1.4mmol/g的2-cl树脂。
16.优选的，所述哌啶溶液为用dmf将哌啶配制成体积浓度20％的哌啶溶液。
17.优选的，所述切割液，按体积百分比计，包括：95％tfa(三氟乙酸)、1％水、2％edt(1,2-乙二硫醇)和2％tis(三异丙基硅烷)。
18.优选的，所述离心为在3000r/min，离心2min。
19.优选的，所述缩合剂为hobt(1-羟基苯并三氮唑)。
20.另一方面的，本发明还提供了所述套膜海葵多肽毒素ap-gr在制备杀虫剂方面的应用。
21.优选的，所述杀虫剂为防治黑刺粉虱的杀虫剂。
22.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
23.本发明提供了一种套膜海葵多肽毒素ap-gr，其氨基酸序列为gipcrcdknsdelngqrsnvggncgagwkkcrsvnaifnccqkav，对黑刺粉虱具有良好的杀虫效果，在高剂量20nm下，氧化肽ap-gr对昆虫的死亡率达到90％，半数致死剂量为10.2nm。
24.本发明采用多肽固相合成法合成线性肽，得到纯度为99.15％的线性肽ap-gr，再将线性肽进行氧化折叠，得到形成了3个二硫键，纯度为98.95％的氧化肽ap-gr。
附图说明
25.图1为本发明海葵线性肽ap-gr的质谱图；
26.图2为海葵多肽氧化肽ap-gr的质谱图；
27.图3为线性肽ap-gr的hplc分析图谱；
28.图4为氧化肽ap-gr的hplc分析图谱；
29.图5为氧化肽ap-gr对黑刺粉虱的室内毒力测定结果；
具体实施方式
30.为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。
31.实施例1
32.一种套膜海葵多肽毒素ap-gr的制备方法，包括以下步骤：
33.(1)称取取代度sd＝0.4mmol/g的2-cl树脂3g，，加入反应器中用dcm(20ml)浸泡5min，用dmf(20ml)洗涤2次，再用dcm洗涤一次，加入0.8mmol的fmoc-gly(tbu)-oh，再加入12ml dcm和2ml diea，反应90min后，加入4ml甲醇和10mldcm，封闭反应30min，用dmf洗涤4次，加入哌啶溶液(20％哌啶 80％dmf)反应20min脱除fmoc，再用dmf洗涤树脂5次，得树脂a；
34.(2)向树脂a中加入下一个氨基酸fmoc-ile-oh(1.8mmol)和hobt(1.8mmol)，倒入10mldmf和2ml dic后反应1h，用dmf洗涤4次，得树脂b。
35.(3)向树脂b中加入哌啶溶液(20％哌啶 80％dmf)反应20min脱除fmoc，用dmf洗涤树脂5次；
36.(4)重复步骤(2)和步骤(3)直到肽链结束，得线性肽树脂；
37.(5)向线性肽树脂中加入甲醇进行抽干处理后，放在50ml离心管，加入40ml切割液(95％tfa 1％h2o 2％edt 2％tis)，摇晃切割2h，过滤，将滤液平分在4个新的50ml离心管中，加入40ml冰乙醚，摇晃均匀后，在3000r/min，离心2min，除去上层的冰乙醚，得粗品多肽，用hplc分离粗品多肽，真空冷冻干燥，得线性肽；
38.(6)取步骤(5)的线性肽用少量水助溶后，按比例1：2加入0.1m nh4hco3，搅拌，进行氧化折叠，并采用制备型hplc进行纯化，得纯品套膜海葵多肽毒素ap-gr。
39.结果分析：
40.采用多肽固相合成法(spps)合成粗品线性肽ap-gr，采用hplc纯化粗品线性肽进行纯化后得到的纯品线性肽，经质谱鉴定分子量为4802.2772da(见图1)。
41.对线性肽氧化折叠终产物进行hplc纯化和质谱鉴定，经质谱鉴定线性肽ap-gr分子量为4802.2772da，氧化肽ap-gr的分子量为4796.2344(见图2)，两者相差约为6da，说明其形成了3个二硫键。
42.采用分析型hplc对线性肽ap-gr进行分析，分析结果显示，线性肽ap-gr的洗脱时间为31.698min，根据峰面积计算其纯度为99.15％(见图3)。
43.采用制备型hplc对氧化72h后的ap-gr进行分离纯化，纯化后再利用分析型hplc进行分析，分析结果显示，氧化肽ap-gr的洗脱时间为28.507min，根据峰面积计算其纯度为98.95％(见图4)。
44.实施例2杀虫效果试验
45.采用室内毒力测定套膜海葵多肽毒素ap-gr对黑刺粉虱的室内毒力
46.供试昆虫：选用黑刺粉虱2龄和3龄若虫；
47.测定方法：取无虫害的椰子叶，每片椰子叶上接入10头黑刺粉虱若虫，喷施不同剂量的氧化肽ap-gr(2.5nm、5nm、10nm、15nm、20nm)，每个剂量重复4次，10d后观察死亡率。另设喷施清水的阴性对照和未喷施氧化肽ap-gr的空白对照。
48.数据处理：采用软件graphpad prism6进行统计和处理，对照组和实验组间的数据采用t检验分析，*表示差异显著(p《0.05)，**表示差异极显著(p《0.01)。
49.结果显示，氧化肽ap-gr对黑刺粉虱具有一定的杀虫效果，黑刺粉虱的死亡率均随着氧化肽ap-gr的剂量增加而增加，与对照组相比均具有显著性差异。高剂量20nm氧化肽ap-gr对昆虫的死亡率达到90％，经软件计算半数致死剂量为10.2nm(见图5)。
50.以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精
神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。