核酸提取纯化和扩增检测的方法及系统与流程

1.本发明涉及一种核酸提取纯化和扩增检测的方法及系统，尤其涉及一种低成本的利用智能手机实现的核酸提取纯化的方法及其装置，以及核酸扩增及荧光检测的方法和装置，属于核酸扩增检测技术领域。


背景技术：

2.核酸是由许多核苷酸单体聚合成的生物大分子化合物，为生命的最基本物质之一，包括脱氧核糖核酸dna和核糖核酸rna两大类，广泛存在于所有动植物、微生物及生物体内。核酸与蛋白质结合形成核蛋白。不同的核酸，其化学组成、核苷酸排列顺序不同。核酸是基本的遗传物质，所有生物包括动植物，细菌病毒等都要靠核酸来遗传，每一个种属都有它自己特定的核酸顺序。通过检测核酸的顺序，就可以来确定到底是哪一种类型的生物，比如有一种感染，就通过进行核酸的测序能够肯定是什么样的小生物造成的，并且能够使用药物来控制消除它。在肿瘤的治疗中，也可以根据肿瘤的核酸性质遗传物质来确定用什么药，用什么药物的敏感从而选择更加好的药物。
3.常用的核酸分析方法包括测序、扩增检测和杂交检测等，这些分析方法一般都包括核酸的提取纯化、扩增和检测等步骤。
4.核酸的提取纯化技术是指将其与蛋白质、多糖、脂类等生物大分子物质分离，并且保证核酸分子的完整性，是进行分子生物学各方面研究的基础，是生命科学研究与应用的关键技术。在20世纪90年代初期，核酸的提取纯化技术还是一项耗时且繁琐的技术，同时，需要采用苯酚、氯仿等有毒试剂进行萃取。随着固相萃取技术的出现和商业化试剂盒的有效性及实用性对于核酸的提取有着较快速及可靠的帮助，从而推动了能够从全血、血清、唾液、尿液、粪便和组织等生物样本中提取出高质量的核酸技术的发展。商品化的固相萃取技术主要分为两类：离心柱纯化法和磁珠纯化法。用离心柱纯化法和磁珠纯化法进行核酸提取纯化通常都包括细胞裂解、吸附、清洗和洗脱等步骤。离心柱纯化法是目前试剂盒提取广泛应用的方法，其利用核酸在一定的离子环境下可被选择性地吸附到硅羟基膜表面而与其他生物分子分离。纯化过程中每步加入的液体通过离心后会进入另外一个离心管中，与含有核酸的柱子完全是分开的，所以洗涤彻底，纯度的稳定性很高。但是纯化过程需要反复离心，操作复杂，自动化困难。磁珠纯化法利用超顺磁性氧化硅纳米磁珠的硅羟基表面高盐低ph结合核酸，低盐ph值洗脱，来实现核酸纯化；利用磁珠的超顺磁性，通过磁场从液相分离磁珠而无需离心,具有易于自动化优点。
5.核酸扩增检测是通过酶的作用将待检核酸序列进行扩增，然后检出的方法，包括以聚合酶链式反应(pcr)为代表的热循环扩增方法，以及rpa和lamp为代表的恒温扩增方法。pcr是利用dna在体95℃高温时变性会变成单链，低温(经常是60℃左右)时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至dna聚合酶最适反应温度(72℃左右)，dna聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。荧光定量pcr是在反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的变化实时监测pcr扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化。
6.核酸的提取纯化和扩增检测通常需要在专业的分子实验室进行，对实验室环境和专业操作人员都有严苛的要求。因此pcr实验室想要渗透到多有生物相关行业内部难度相当大。比如近期爆发的新型冠状病毒肺炎和近期爆发非洲猪瘟，对在现场进行核酸分析提出了新的需求。近年来研发的现场快速检验(poct)核酸检测系统，采用“样本进，结果出”的核酸分析检测模式大大简化操作流程，使得现场部署和非分子检验专业人员操作成为可能。采用全密封式卡盒，将细胞/细菌/病毒裂解、核酸纯化、反转录和实时定量pcr扩增及检测等核酸分析的全部过程在卡盒内自动完成。基于智能手机的核酸提取纯化和扩增检测系统已成为一种经济实惠且快速的分子诊断技术，因为它们可提供快速的检测周期，便于通过移动通信与远程专家和人工智能系统连接，在资源有限的环境中提供准确的健康信息。
7.因此，如何将核酸提取纯化，以及扩增检测与基于实时定量pcr核酸扩增及荧光检测技术的核酸实时检测设备相结合，寻求一种低成本的利用智能手机实现的核酸提取纯化和核酸扩增检测的方法及其系统，已然成为业界研究人员长期以来一直努力的方向。


技术实现要素：

8.本发明的主要目的就是针对以上现状，提供一种核酸提取纯化装置及方法，以克服现有技术中的不足。
9.本发明的另一主要目的在于提供一种核酸扩增检测装置。
10.本发明的另一主要目的在于提供一种核酸提取纯化和扩增检测的方法及系统。
11.为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：
12.本发明实施例提供了一种核酸提取纯化装置，其包括：
13.提取机构，其包括紧密配合的第一组件和第二组件，所述第二组件具有通道，所述第一组件的至少局部区域能够在所述通道内往复运动，且所述通道允许含有核酸的样品被抽吸到所述通道中，所述第二组件的底端设置有液体管路，且所述液体管路与通道连通；
14.拦截结构，其设置于所述第二组件的底端，并拦截所述核酸；
15.储液机构，其包括复数个容置腔，每个所述容置腔的底面上均设置有凸出部，所述凸出部至少能够封闭所述液体管路。
16.本发明实施例还提供了一种核酸提取纯化方法，所述方法主要基于前述的核酸提取纯化装置而实施，并且，所述核酸提取纯化方法包括：
17.(1)将液体管路的末端置于第一容置腔的第一试剂内，对第一组件施加拉力，使含有核酸的样品通过液体管路和拦截结构被抽吸到第二组件的通道中，从而使核酸吸附于第二组件的内壁上；
18.(2)将所述液体管路的出口端与凸出部表面密封接触，从而使液体管路和通道密封，之后对所述第一组件施加推力，使液体通过拦截结构被推注至第一容置腔内；
19.(3)按照步骤(1)和(2)依次进行核酸的清洗、洗脱处理，获得纯核酸溶液。
20.本发明实施例还提供了一种核酸扩增检测装置，其包括：
21.微流控芯片，至少用以容置用于检测核酸的引物、探针及pcr反应体系；
22.温度控制单元，至少用以调控微流控芯片的工作温度；
23.激发单元，至少用以提供激发光，所述激发光照射在微流控芯片中的pcr反应产物上产生荧光；以及，
24.检测单元，至少用以采集产生的荧光，并进行分析检测。
25.进一步地，所述核酸扩增检测装置还包括微处理器单元，其至少用以控制温度控制单元、激发单元、检测单元的工作状态。
26.本发明实施例还提供了前述核酸扩增检测装置于核酸扩增检测领域中的用途，应用所述核酸扩增检测装置进行核酸扩增检测的方法包括：
27.将待检测样本置于所述加样孔内，pcr反应体系置于反应腔室内，用于检测核酸的引物、探针置于分配腔室内；
28.采用温度控制单元对所述微流控芯片进行加热或制冷来完成热循环，使所述反应腔室内的温度条件能够进行pcr反应，以及采用温度传感器检测反应腔室的温度，采用微处理器单元的自动控制算法来进行温度控制，使温度控制在pcr反应范围内；
29.采用激发单元使激发光照射在所述微流控芯片中的pcr反应产物上产生荧光；
30.采用检测单元采集产生的荧光，并进行分析检测。
31.相应的，本发明实施例还提供了一种核酸提取纯化和扩增检测的系统，其包括：
32.前述核酸提取纯化装置；以及
33.前述核酸扩增检测装置。
34.相应的，本发明实施例还提供了一种核酸提取纯化和扩增检测的方法，其包括：
35.按照前述方法进行核酸提取纯化；以及
36.按照前述方法进行核酸扩增和检测。
37.本发明提出了一套基于智能手机实现的核酸提取纯化和扩增检测的方法和装置，与现有技术相比，本发明的优点包括：
38.1)本发明提供了一种低成本的核酸提取方法和装置，其中抽取液体可以通过内径较大的液体管道和硅羟基膜，而推回液体只能通过硅羟基膜。与抽取液体和推出液体都只能通过硅羟基膜相比，拉开活塞形成的真空吸力远小于推进活塞形成的压力，有利于相对粘稠的液体，如组织裂解产物，通过硅羟基膜完成吸附和洗脱的过程；与磁珠法需要反复移动磁铁实现固液分离相比，装置较为简单，这一核酸提取方法可以手动实现，也可以通过智能手机和单片机配合操控几个步进电机完成；
39.2)本发明利用智能手机控制热循环和荧光采集，利用智能手机的多个物理摄像头结合多个不同中心波长的led实现多色荧光检测，与传统通过机械运动切换不同荧光通道的方式相比较，本发明中的多色荧光检测的激发光源通过电子方式控制开关和强度，采集通过智能手机多个物理摄像头配合发射滤色片独立进行，可实现4-6通道荧光采集，利用多通发射滤色片，还可将荧光通道扩展到12-18通道，无机械运动部件，降低系统故障率并提高便携性。
附图说明
40.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
41.图1a和图1b是本发明一典型实施方案中一种核酸提取纯化装置的结构示意图。
42.图2a和图2b是本发明一典型实施方案中一种核酸提取装置的第一组件位于第二组件底端时的结构示意图。
43.图2c和图2d是本发明一典型实施方案中一种核酸提取装置的第一组件向上抽拉时的结构示意图。
44.图2e和图2f是本发明一典型实施方案中一种核酸提取装置的第一组件向下推注时的结构示意图。
45.图3是本发明一典型实施方案中一种核酸扩增检测装置的结构示意图。
46.图4a和图4b是本发明一典型实施方案中核酸扩增检测方法的原理示意图。
47.图5是本发明一典型实施方案中核酸扩增检测装置用来恒温控制、光源驱动的控制框图。
48.图6a是本发明一典型实施方案中核酸扩增检测装置中微流控芯片与热电半导体制冷器件组装图。
49.图6b是微流控芯片的结构示意图。
50.图7a和图7b是本发明实施例3中100μl假病毒(约为10e4假病毒)或阴性对照(水)作为样品扩增后，经软件分析后荧光随时间变化曲线图。
51.附图标记说明：10-活塞，20-空筒，21-通道，30-液体管路，40-硅羟基膜，50-储液机构，51-第一储液池，51a-加热套筒，52-第二储液池，53-第三储液池，54-第四储液池，55-凸出部，56-连接电机轴；100-微流控芯片，100a-芯片进出仓组件，110-反应腔室，120-分配腔室，130-加样孔，140-溢出孔，200-激发单元，210-四色led光源，211-恒定电流驱动，220-三带通滤色片，221-带通滤色片，222-多通滤色片，300-温度控制单元，310-帕尔帖，311-大功率双向h桥驱动，320-热电偶传感器，321-热电偶测温转换器，330-导热垫，340-铝散热块，350-风扇，400-检测单元，410-智能手机，410a-智能手机支架，411-内置摄像头，412-开关电源模块，413-蓝牙模块，414-低压差线性稳压器，420-带通滤色片，422-平凸透镜，500-微处理器单元，501-自制pcb控制板，a-光学组件，1-设备外壳。
具体实施方式
52.借助智能手机快速发展，越来越多的智能手机拥有多个内置摄像头，从android系统从9.0版本开始可对每个内置的物理摄像头独立控制，并且内置相机的分辨率越来越高，同时智能手机的内存和处理器已经强大到可以用来进行实时图像处理，因此，可以用智能手机内置摄像头来进行多通道荧光图像采集，并通过图像处理算法来计算出荧光强度。
53.鉴于现有技术的不足和缺陷，本案发明人经长期研究和大量实践，得以提出本发明的技术方案，提供了一种低成本的核酸提取方法和装置，其核心是从储液池(结合液、清洗液和洗脱液)中抽取液体，然后将液体通过硅羟基膜推回液体池，依次完成核酸的吸附、清洗和洗脱的过程。其特点是抽取液体可以通过内径较大的管道和硅羟基膜，而推回液体只能通过硅羟基膜。与抽取液体和推出液体都只能通过硅羟基膜相比，拉开活塞形成的真空吸力远小于推进活塞形成的压力，有利于相对粘稠的液体，如组织裂解产物，通过硅羟基膜完成吸附和洗脱的过程；与磁珠法需要反复移动磁铁实现固液分离相比，装置较为简单。这一核酸提取方法可以手动实现，也可以通过智能手机和单片机配合操控几个步进电机完成。
54.本发明利用智能手机控制热循环和荧光采集。利用智能手机的多个物理摄像头结合多个不同中心波长的led实现多色荧光检测，与传统通过机械运动切换不同荧光通道的方式相比较，本发明中的多色荧光检测的激发光源通过电子方式控制开关和强度，采集通过智能手机多个物理摄像头配合发射滤色片独立进行，可实现4-6通道荧光采集，利用多通发射滤色片，还可将荧光通道扩展到12-18通道，无机械运动部件，降低系统故障率并提高便携性。
55.如下将对该技术方案、其实施过程及原理等作进一步的解释说明。
56.下文将对本发明的技术方案作更为详尽的解释说明。但是，应当理解，在本发明范围内，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
57.本发明实施例的一个方面提供了一种核酸提取纯化装置，其包括：
58.提取机构，其包括紧密配合的第一组件和第二组件，所述第二组件具有通道，所述第一组件的至少局部区域能够在所述通道内往复运动，且所述通道允许含有核酸的样品被抽吸到所述通道中，所述第二组件的底端设置有液体管路，且所述液体管路与通道连通；
59.拦截结构，其设置于所述第二组件的底端，并拦截所述核酸；
60.储液机构，其包括复数个容置腔，每个所述容置腔的底面上均设置有凸出部，所述凸出部至少能够封闭所述液体管路。
61.在一些实施例中，所述第一组件可以是活塞件，但不限于此。
62.在一些实施例中，所述第二组件可以是具有中空结构的筒状结构，但不限于此。
63.在一些实施例中，所述核酸提取纯化装置还包括固定件，所述拦截结构通过所述固定件设置于所述第二组件的底端。
64.进一步地，所述固定件可以是固定压环，但不限于此。
65.在一些实施例中，所述拦截结构包括可在不同条件下吸附和洗脱核酸的多孔膜，例如可以优选为孔径在0.1μm-10μm的硅羟基膜(如whatman gf/f等)，但不限于此。
66.在一些实施例中，所述凸出部与液体管路的出口端一一对应设置。
67.进一步地，所述凸出部的尺寸不小于所述液体管路的直径。
68.在一些实施例中，所述储液机构包括：
69.存储有第一试剂的第一容置腔，所述第一试剂包括含有核酸的样品；
70.存储有第二试剂的第二容置腔，所述第二试剂包括清洗液；
71.存储有第三试剂的第三容置腔，所述第三试剂包括洗脱液。
72.进一步地，所述第二容置腔的数量可以是一个或两个以上，数量不作限制。
73.在一些实施例中，所述核酸提取纯化装置还包括加热机构，所述加热机构环设于所述第一容置腔外侧。
74.进一步地，所述加热机构可以是加热套环，但不限于此。
75.进一步地，所述核酸提取纯化装置还包括控制机构，所述控制机构通过微处理器单元与一智能移动终端连接。
76.其中，在一些更为具体的实施案例之中，所述核酸提取纯化装置具体可以包括：一个类似注射器的结构和储液机构，内依次存放含有核酸的样品(亦可称为结合液)、第一清洗液、第二清洗液和洗脱液。液体可以在开始纯化前加入，也可以预存在储液机构中，预存
了液体的储液机构用铝箔密封，在开始提取前戳破或者在提取过程中按需求逐个戳破。
77.进一步地，存储含有核酸的样品的容置腔(亦可称为储液池)周围还具有可以放入加热套环的结构，可以根据需要加热液体。容置腔底部还具有密封突起，用于推注液体时封闭抽吸液体的管路。类似注射器的结构包括活塞、空筒、液体管路、硅羟基膜(如whatman gf/f等)和固定压环等。拉开活塞形成的真空吸力远小于推进活塞形成的压力，液体管路有利于将粘稠的液体，如组织裂解产物，抽入空筒。
78.本发明实施例的另一个方面提供了一种核酸提取纯化方法，所述方法主要基于前述的核酸提取纯化装置而实施，并且，所述核酸提取纯化方法包括：
79.(1)将液体管路的末端置于第一容置腔的第一试剂内，对第一组件施加拉力，使含有核酸的样品通过液体管路和拦截结构被抽吸到第二组件的通道中，从而使核酸吸附于第二组件的内壁上；
80.(2)将所述液体管路的出口端与凸出部表面密封接触，从而使液体管路和通道密封，之后对所述第一组件施加推力，使液体通过拦截结构被推注至第一容置腔内；
81.(3)按照步骤(1)和(2)依次进行核酸的清洗、洗脱处理，获得纯核酸溶液。
82.进一步地，所述核酸提取过程包括：将提取机构的前端，即液体管路的末端置入结合液储液池，拉出活塞，液体可以通过内径较大的液体管路和硅羟基膜吸入空筒内；转动空筒90度并下压至储液池的突起结构，密封液体通道；推进活塞，液体只能通过硅羟基膜被推回到储液池。转动储液池，依次在第一清洗液、第二清洗液和洗脱液的储液池中完成同样的操作。洗脱液储液池可以作为扩增反应腔使用。洗脱液储液池也可以只存储分子生物学级水，利用注射器抽取水，推进活塞将水推过硅羟基膜，洗脱纯化后的核酸转移至另一个反应腔进行扩增反应。
83.进一步地，核酸提取方法可以手动实现，也可以通过智能手机和单片机配合操控几个步进电机完成。
84.本发明实施例的另一个方面还提供了一种核酸扩增检测装置，其包括：
85.微流控芯片，至少用以容置用于检测核酸的引物、探针及pcr反应体系；
86.温度控制单元，至少用以调控微流控芯片的工作温度；
87.激发单元，至少用以提供激发光，所述激发光照射在微流控芯片中的pcr反应产物上产生荧光；以及，
88.检测单元，至少用以采集产生的荧光，并进行分析检测。
89.在一些实施例中，所述核酸扩增检测装置还包括微处理器单元，其至少用以控制温度控制单元、激发单元、检测单元的工作状态。
90.在一些实施例中，所述微流控芯片包括相互连通的反应腔室、分配腔室、至少用于连通各腔室的微流道、加样孔以及溢出孔，所述反应腔室至少用以存储pcr反应体系，所述分配腔室至少用以存储用于检测核酸的引物、探针。
91.在一些实施例中，所述激发单元包括led光源和滤光组件，所述led光源设置于所述滤光组件上方，所述滤光组件至少用以产生所需波长的激发光。
92.进一步地，所述led光源包括四色led光源，但不限于此。
93.进一步地，所述滤光组件包括单通滤色片、两通滤光片或多通滤色片，尤其优选为三带通滤色片，但不限于此。
94.进一步地，所述led光源与所述微处理器单元通过led驱动组件(例如可以采用恒定电流led驱动)连接。
95.在一些实施例中，所述检测单元包括具有一个以上荧光图像采集组件的智能移动终端，以及一个以上滤光组件，所述荧光图像采集组件一一对应设置于所述滤光组件上方，所述荧光图像采集组件与滤光组件之间设置有平凸透镜，其至少用于将荧光汇聚到荧光图像采集组件上。
96.进一步地，所述智能移动终端与所述微处理器单元通过蓝牙模块连接。
97.进一步地，所述检测系统还包括一开关电源模块或大容量充电电源，优选为开关电源模块，其至少用于为智能移动终端、核酸扩增检测装置提供电源。
98.进一步地，所述开关电源模块或充电电源与所述微处理器单元电性连接，优选采用低压差线性稳压器进行连接。
99.在一些实施例中，所述智能移动终端包括智能手机、平板电脑以及基于arm处理器的微型电脑主板模块等，但不限于此。
100.进一步地，所述荧光图像采集组件包括摄像头组件，优选采用内置摄像头。
101.在一些实施例中，所述温度控制单元包括加热制冷组件和温度传感组件，所述加热制冷组件至少用以快速加热或快速制冷，并使所述反应腔室内的温度快速变化来达到pcr反应所需要的快速热循环。
102.进一步地，所述加热制冷组件包括热电半导体制冷器件，但不限于此。
103.进一步地，所述温度传感组件包括热电偶传感器，但不限于此。
104.在一些实施例中，所述加热制冷组件与所述微处理器单元通过大功率双向h桥驱动组件连接，所述温度传感组件与所述微处理器单元通过热电偶测温转换器连接。
105.进一步地，所述微处理器单元包括单片机，但不限于此。
106.其中，在一些更为具体的实施案例之中，所述基于实时定量pcr技术的核酸扩增检测装置整体具体可以包括：
107.(1)具有多个内置摄像头，并且每个物理摄像头可以独立控制采集图像的智能手机；
108.(2)根据手机摄像头的原用途(近摄、远摄等)，在摄像头前方根据需求固定透镜，使在摄像头前方约10厘米左右的微流控芯片可以清晰成像；
109.(3)在摄像头或者摄像头和透镜前方固定一定带宽，如半峰全宽(fwhm)为1nm-100nm的发射滤色片；滤色片可以为单通，双通或多通，用于指定的荧光信号采集；
110.(4)一组或多组由多个不同中心波长，如300nm
–
800nm的led光源，及对各个led光源进行独立开关和亮度控制的电路板；
111.(5)在led光源前方固定与光源中心波长匹配的，具有一定带宽，如半峰全宽(fwhm)为1nm-100nm的激发滤色片；或者多个led光源共用一块与其各自中心波长匹配的多通滤色片；
112.(6)帕尔贴(热电半导体致冷器)热惯性非常小，制冷制热时间很快。结合温度实时检测，单片机通过大功率h桥驱动组件来驱动帕尔贴，由温度自动控制算法来实现pcr扩增反应所需要的快速温度热循环；
113.(7)一次性的微流控芯片，能在芯片的反应腔内进行pcr反应；
114.(8)温度探头，为热电偶或热敏电阻温度检测传感器等；
115.(9)辅助硬件，如芯片进出仓电机，位置传感器等；
116.(10)微处理器单元，用于采集温度和控制辅助硬件等；智能手机和单片机之间通过蓝牙进行通信；
117.(11)智能手机应用，包括与单片机通信，图像采集及分析，用户界面和中心数据库/专家系统通讯模块；
118.(12)系统可用开关电源模块大容量或可充电锂电电池提供电源；
119.(13)便携式机箱，将所有组件都牢固地固定在一起，形成一个紧凑的设备；形成一个密闭的荧光信号采集空间。
120.本发明实施例的另一个方面还提供了前述核酸扩增检测装置于核酸扩增检测领域中的用途。
121.本发明实施例的另一个方面还提供了一种应用所述核酸扩增检测装置进行核酸扩增检测的方法，其包括：
122.将待检测样本置于所述加样孔内，pcr反应体系置于反应腔室内，用于检测核酸的引物、探针置于分配腔室内；
123.采用温度控制单元对所述微流控芯片进行加热或制冷来完成热循环，使所述反应腔室内的温度条件能够进行pcr反应，以及采用温度传感器检测反应腔室的温度，采用微处理器单元的自动控制算法来进行温度控制，使温度控制在pcr反应范围内；
124.采用激发单元使激发光照射在所述微流控芯片中的pcr反应产物上产生荧光；
125.采用检测单元采集产生的荧光，并进行分析检测。
126.在一些更为具体的实施例中，所述检测方法包括：
127.将待检测样本置于所述加样孔内，pcr反应体系置于反应腔室内；
128.采用温度控制单元对所述微流控芯片以高温变性(经常是95℃左右)、低温退火(经常是60℃左右)、适温扩增(经常是72℃左右)等三阶段为一周期进行多周期快速热循环，使所述反应腔室内温度快速变化来进行pcr反应，以及采用温度传感器来实时检测反应腔室温度，由单片机通过自动控制算法由大功率双向h桥驱动帕尔帖来实现温度自动控制。
129.采用激发单元使激发光照射在所述微流控芯片中的pcr反应产物上产生荧光；
130.采用检测单元采集产生的荧光，并进行分析检测。
131.进一步地，所述方法包括：实时监测采集pcr反应产物的荧光强度，通过荧光强度随时间变化的扩增曲线分析结果。
132.综上所述，本发明提供了一种基于微流控技术实现pcr扩增实时荧光检测的集成式核酸的检测方法、引物和荧光探针、微流控芯片和检测系统。
133.更为具体的，本案发明人设计一个基于实时定量pcr核酸扩增及荧光检测技术的手持式核酸实时检测原型设备。该设备配备了一个小型热循环仪，led四色功率光源和固定式多通道滤光组件，以及基于多摄像头智能手机的多通道荧光实时检测系统。首先，该设备通过消除机械运动部件来提高便携性，采用固定式的多通道滤光镜提高多色荧光检测的速度；开发了一种多色荧光检测方法，将亮度可调节、颜色可切换的多色led光源，与智能手机中的多个可单独控制的后置摄像头同步切换荧光检测通道，实现多色荧光顺序检测方法。其次，为了实现pcr快速温度热循环，采用单片机控制帕尔贴(热电半导体致冷器)，通过自
动温度控制算法实现一种快速升温、降温的热循环仪。最后，在智能手机上开发了android app软件，控制智能手机多个内置摄像头获取荧光图像并进行实时图像处理，还通过蓝牙通信技术控制自制pcb控制板来实现快速热循环、光源亮度调节、颜色切换和核酸提取。鉴于功能高度集成、高移动性的优势，本案发明人基于智能手机的设备非常适合在资源有限的非实验室环境中进行快速核酸扩增和实时定量分析。
134.本发明利用智能手机的多个物理摄像头结合多个不同中心波长的led实现多色荧光检测，与传统通过机械运动切换不同荧光通道的方式相比较，本发明中的多色荧光检测的激发光源通过电子方式控制开关和强度，采集通过智能手机多个物理摄像头配合发射滤色片独立进行，可实现4-6通道荧光采集，利用多通发射滤色片，还可将荧光通道扩展到12-18通道，无机械运动部件，降低系统故障率并提高便携性。
135.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行详细的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
136.本发明一具体实施例中提供的一种低成本的核酸提取方法和装置如图1a-图1b所示，所述核酸提取纯化装置包括提取机构、拦截机构和储液机构。
137.所述提取机构包括紧密配合的第一组件和第二组件，所述第一组件可以是活塞10，所述第二组件可以是具有中空结构的筒状结构，即空筒20，所述空筒20具有通道21，所述活塞10能够在所述通道21内往复运动(即抽吸和推注)，且所述通道21允许含有核酸的样品被抽吸到所述通道中，所述空筒20的底端设置有液体管路30，且所述液体管路30与通道21连通。所述拦截机构可以是硅羟基膜40，固定压环41将硅羟基膜40固定设置于空筒20的底端。所述凸出部55与液体管路30的出口端一一对应设置，且所述凸出部55的尺寸不小于所述液体管路30的直径，以保证密封贴合。
138.所述储液机构50包括存储有含有核酸的样品的第一容置腔(即第一储液池51)、存储有清洗液的第二容置腔(即第二储液池52)、第三容置腔(即第三储液池53)、存储有洗脱剂的第三容置腔(即第四储液池54)。
139.所述核酸提取纯化装置还可包括加热机构，所述加热机构环设于第一储液池51外侧，所述加热机构可以选用加热套筒51a。所述核酸提取纯化装置还包括控制机构，所述控制机构通过微处理单元与一智能移动终端连接。
140.所述核酸提取装置包括一个类似注射器的结构和若干个储液池，第一储液池51、第二储液池52、第三储液池53和第四储液池54内依次存放结合液(含有核酸的样品)、第一清洗液、第二清洗液和洗脱液。液体可以在开始纯化前加入，也可以预存在储液池中，预存了液体的储液池用铝箔密封，在开始提取前戳破或者在提取过程中按需求逐个戳破。存储结合液的储液池周围还具有可以放入加热套环的结构，可以根据需要加热液体。储液池底部还具有密封突起(凸出部)，用于推注液体时封闭抽吸液体的管路。类似注射器的结构包括活塞、空筒、抽吸液体管路、硅羟基膜(如whatman gf/f等)和固定压环等。拉开活塞形成的真空吸力远小于推进活塞形成的压力，抽吸液体管路有利于将粘稠的液体，如组织裂解产物，抽入空筒20。
141.本发明一具体实施例中提供的一种核酸提取纯化方法，核酸提取过程如图2a-图
2f所示，将提取机构前端即液体管路30的末端置入容置有结合液的第一储液池51(图2a-图2b)，拉出活塞10，液体可以通过内径较大的液体管道30和硅羟基膜40吸入空筒20内(图2c-图2d)；转动空筒90度并下压至第一储液池51的突起结构(即凸出部55)，密封液体通道；推进活塞10，液体只能通过硅羟基膜40被推回到第一储液池51(图2e-图2f)。转动储液机构50，依次在第一清洗液、第二清洗液和洗脱液的第二储液池52、第三储液池53和第四储液池54中完成同样的操作。容置有洗脱液的第四储液池54可以作为扩增反应腔使用。容置有洗脱液的第四储液池54也可以只存储分子生物学级水，利用注射器抽取水，推进活塞10将水推过硅羟基膜40，洗脱纯化后的核酸转移至另一个反应腔进行扩增反应。
142.核酸提取方法可以手动实现，也可以通过智能手机和单片机配合操控几个步进电机完成，所述进步电极设置于连接电机轴56上。
143.请参阅图5所示，本发明一具体实施例中提供的一种核酸扩增检测装置，其包括微流控芯片100、激发单元200、温度控制单元300、检测单元400和微处理器单元500。
144.其中，所述微流控芯片100包括加样孔130、溢出孔140、分配腔室120、反应腔室110组成，如图6b所示。所述反应腔室110至少用以存储pcr反应体系，所述分配腔室120至少用以存储用于检测核酸的引物、探针。
145.所述激发单元200包括四色led光源210和三带通滤色片220，所述四色led光源210设置于所述三带通滤色片220上方。所述四色led光源210与所述微处理器单元500通过恒定电流led驱动211连接。
146.所述检测单元400包括智能手机410及三个带通滤色片420，所述智能手机410具有三个内置摄像头411，所述内置摄像头411一一对应设置于所述带通滤色片420上方，所述内置摄像头411与带通滤色片420之间设置有平凸透镜422。所述智能手机410与所述微处理器单元500通过蓝牙模块413连接。所述核酸扩增检测装置还包括开关电源模块412或充电电源，其至少用于为智能手机410提供电源。所述开关电源模块412与所述微处理器单元500通过低压差线性稳压器414电性连接。
147.所述温度控制单元300包括帕尔帖310和热电偶传感器320，所述帕尔帖310至少用以加热和制冷，并使所述反应腔室内达到pcr反应所需的温度热循环。所述帕尔帖310与所述微处理器单元500通过大功率双向h桥驱动311连接，所述热电偶传感器320与所述微处理器单元500通过热电偶测温转换器321连接。
148.其中，图5中虚线区域中滤色片可统称为光学组件a区域，恒定电流led驱动、热电偶测温转换器、开关电源模块、蓝牙模块、低压差线性稳压器等均设置在含微处理器单元、温度控制单元和蓝牙模块等自制pcb控制板501上。
149.实施例1便携式智能手机核酸扩增检测装置
150.核酸扩增检测装置的设备整体尺寸约为180mm
×
90mm
×
110mm，重量约为300g，通过3d打印机制作的计算机辅助设计(3d cad)设计的，3d打印材料使用光敏树脂，完整组装后的设备外观如图3所示。智能手机采用华为公司mate 20，其背面具有3个独立的物理摄像头，操作系统为android 9.0,可以独立操控3物理摄像头。mate 20的远摄镜头焦距较长，不能在距离10cm内清晰成像。选用平凸透镜矫正焦距，如edmund optics,#67-146,60mm焦距平凸透镜，使得3个物理摄像头同时可以对60mm附近的微流控芯片成像。3个物理摄像头前分别前分别安装发射滤色片，如选用newport的8mm x 8mm方型滤色片，中心波长分别为
pie(9.0)和api版本28中发布的新相机功能，允许控制多摄像头智能手机中的单个物理摄像头，因此可以实现手机内置多个摄像头的单独控制，从而给不同的摄像头设置不同的控制参数，如曝光时间，白平衡和焦点位置，可以通过自开发软件来实现独立控制，最终通过分别设置三个内置摄像头来实现三个通道荧光实时采集。
157.实施例2核酸提取
158.核酸提取试剂采用viral rnamini试剂盒中的试剂。样品为复百澳生物提供的fnv-2019-ncov-aben假病毒。储液池61存储560μl 100％乙醇，储液池62存储500μl aw1,储液池63存储500μl aw2,储液池64存储100μl rnase free的水。
159.将100μl假病毒(约为10e4假病毒)或阴性对照(水)加入560μlavl,室温孵育10分钟后，加入储液池61并混匀。采用图1a-图1b所示的核酸提取装置，从第一储液池51抽吸溶液(如图2c-图2d所示)，提取装置转动90度，压紧液体管路30后，推进活塞10使液体通过1层至5层whatman gf/f硅羟基膜，进行核酸结合(如图2e-图2f所示)；然后将提取装置的空筒20反方向转动90度，移至第二储液池52，抽吸溶液(如图2c-图2d所示)，提取装置的空筒20转动90度，压紧液体管路30后，推进活塞10使液体通过1层至5层whatman gf/f硅羟基膜，进行第一次清洗(如图2e-图2f所示)；然后将提取装置的空筒20反方向转动90度，移至第三储液池53，抽吸溶液(如图2c-图2d所示)，提取装置的空筒20转动90度，压紧液体管路30后，推进活塞10使液体通过1层至5层whatman gf/f硅羟基膜，进行第二次清洗(如图2e-图2f所示)；然后将提取装置的空筒20反方向转动90度，移至第四储液池64，抽吸溶液(如图2c-图2d所示)，提取装置的空筒20转动90度，压紧液体管路30后，推进活塞10使液体通过1层至5层whatman gf/f硅羟基膜，洗脱核酸。
160.实施例3 rt-qpcr检测
161.rt-qpcr检测使用takara公司一步法rt-qpcr试剂盒rr064a。按下表1比例配制反应液，其中水不加。引物和探针序列如表2(序列为美国cdc推荐检测新型冠状病毒肺炎rt-qpcr引物和探针序列。按反应腔体积的68％加入相应的体积的反应液，冻干后用压敏光学膜封闭。
162.将按照实施例2中所述方法提取纯化的核酸转移至加样孔，通过智能手机设置温度程序，(45℃/5min,95℃10sec,40x(95℃10sec,58℃30sec)，由下位机控制电路和peltier加热/制冷器件完成温度循环。在延伸温度(58℃)最后10秒，手机的三个摄像头依次采集一幅荧光图像，使用android系统上的opencv 3.4.1(开源计算机视觉库)进行图像处理。荧光图像以无损数字负片(dng)格式来存储。首先，本案发明人将荧光图像从dng格式转换为mat格式；随后，使用top-hat方法进行背景滤除，该方法可将因为不均匀照明而导致的荧光图像干扰背景最小化。然后，使用形态学方法(例如hough变换)快速定位微流控芯片上的标记点和孔。通过孔与标记点的比率来计算每个孔的位置。100μl假病毒(约为10e4假病毒)或阴性对照(水)作为样品扩增后，经软件分析后荧光随时间变化进行绘制，分别如图7a和图7b所示。
163.表1反应液成分和比例
[0164][0165][0166]
表2引物和探针序列
[0167][0168]
综上所述，藉由上述技术方案，本发明可以实现核酸提取纯化，利用智能手机控制热循环和荧光采集，利用智能手机的多个物理摄像头结合多个不同中心波长的led实现多色荧光检测，与传统通过机械运动切换不同荧光通道的方式相比较，本发明中的多色荧光
检测的激发光源通过电子方式控制开关和强度，采集通过智能手机多个物理摄像头配合发射滤色片独立进行，可实现4-6通道荧光采集，利用多通发射滤色片，还可将荧光通道扩展到12-18通道，无机械运动部件，降低系统故障率并提高便携性。
[0169]
本发明的各方面、实施例、特征及实例应视为在所有方面为说明性的且不打算限制本发明，本发明的范围仅由权利要求书界定。在不背离所主张的本发明的精神及范围的情况下，所属领域的技术人员将明了其它实施例、修改及使用。
[0170]
在本发明案中标题及章节的使用不意味着限制本发明；每一章节可应用于本发明的任何方面、实施例或特征。
[0171]
在本发明案通篇中，在将组合物描述为具有、包含或包括特定组份之处或者在将过程描述为具有、包含或包括特定过程步骤之处，预期本发明教示的组合物也基本上由所叙述组份组成或由所叙述组份组成，且本发明教示的过程也基本上由所叙述过程步骤组成或由所叙述过程步骤组组成。
[0172]
应理解，各步骤的次序或执行特定动作的次序并非十分重要，只要本发明教示保持可操作即可。此外，可同时进行两个或两个以上步骤或动作。
[0173]
此外，本案发明人还参照前述实施例，以本说明书述及的其它原料、工艺操作、工艺条件进行了试验，并均获得了较为理想的结果。
[0174]
尽管已参考说明性实施例描述了本发明，但所属领域的技术人员将理解，在不背离本发明的精神及范围的情况下可做出各种其它改变、省略及/或添加且可用实质等效物替代所述实施例的元件。另外，可在不背离本发明的范围的情况下做出许多修改以使特定情形或材料适应本发明的教示。因此，本文并不打算将本发明限制于用于执行本发明的所揭示特定实施例，而是打算使本发明将包含归属于所附权利要求书的范围内的所有实施例。