一种辣椒杂交种纯度鉴定的SSR核心引物组及其筛选方法与流程

一种辣椒杂交种纯度鉴定的ssr核心引物组及其筛选方法
技术领域
1.本发明涉及分子标记技术领域，特别是涉及一种辣椒杂交种纯度鉴定的ssr核心引物组及其筛选方法。


背景技术：

2.辣椒(capsicum)起源于中南美洲热带地区，栽培历史悠久，遗传资源丰富。环境、栽培措施和优良品种利用是农业增产增收的主要贡献因素，而优良品种利用的贡献率超过60％。随着辣椒育种技术发展，辣椒品种也迅速增多，而辣椒生产中品种和种子质量问题也显得比较突出，在生产实践中，常常出现种子纯度不高、活力下降，造成产量降低、品质变劣，严重影响其经济效益。因此，大力开展辣椒种子纯度检测工作显得尤其重要。
3.随着分子标记技术的发展，分子标记技术已经开始在辣椒品种纯度鉴定中得到应用，其中，rapd标记和ssr标记是应用较多的标记技术。然而，在以往的研究中，为解决少数杂交种的纯度鉴定，往往需要进行大量的引物筛选工作，才能找到适合的鉴定引物。能否确定一套适于纯度鉴定的核心引物，并构建已知品种纯度鉴定标准dna指纹图谱，对已知品种的纯度鉴定至关重要。有了核心引物就不再需要进行繁琐的引物筛选，即使对未知品种，也只需进行少量的筛选，就能迅速找到合适的鉴定引物。ssr标记具有操作简便和稳定可靠等优点，加之具有大量的等位差异，多态性十分丰富，在杂交种子纯度检测中有广阔的应用前景。
4.杂交种纯度鉴定的两个目的：最主要的目的是验自交苗，仅需要1对双亲互补型引物即可；其次是验异型株，需要用特异引物或引物组合，使得出现相同带型品种的概率足够低，从而能有效地区分出异型株。基于这两点，适于纯度鉴定的核心引物必须具备以下两个特征：(1)杂合率高，从而具有较强的区分自交苗的能力，能够比较容易筛选到双亲互补型的引物；(2)多态性高，从而具有较高的区分异型株的能力。只有这样，才能保证预筛时仅采用少数引物就可以比较容易找到符合要求的引物。据此，王凤格等把引物分为3类：(1)多态性高，且杂合率高；(2)多态性高或中，且杂合率高或中；(3)多态性低或中，或杂合率低。其中，第1类引物最适于纯度鉴定，其次是第2类，对于第3类引物，一般不推荐作为纯度鉴定优先选用的引物。
5.然而，目前尚未有关于辣椒杂交种纯度鉴定的核心分子标记引物的报道。


技术实现要素：

6.本发明的目的是提供一种辣椒杂交种纯度鉴定的ssr核心引物组及其筛选方法，以解决上述现有技术存在的问题。
7.为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
8.本发明提供一种辣椒杂交种纯度鉴定的ssr核心引物组，选自如下所述中的一种或两种：
9.a.核心引物组中的一种或几种：
10.hpms1
‑
214、es395和hpms1
‑
5；
11.b.备选核心引物组中的一种或几种：
12.es330、es363、epms923、es120和es64。
13.其中，hpms1
‑
214：
14.f：tgcgagtaccgagttctttctag
15.r：ggcagtcctgggacaactcg
16.es395：
17.f：tgtaattaattgaggtgcgcga
18.r：tctctggttgacaattaggccc
19.hpms1
‑
5：
20.f：ccaaacgaaccgatgaacactc
21.r：gacaatgttgaaaaaggtggaagac
22.es330：
23.f：gtagccatggcagaattggaag
24.r：ttcagcaggttctggttctggt
25.es363：
26.f：gaggaattttggagccacacac
27.r：aggtgaaatgggcagtggtaga
28.epms923：
29.f：caaaaccaaataggtccccc
30.r：cgcgcaataattcaatatcg
31.es120：
32.f：gcggccttttgattcatacaat
33.r：cgttttactgccctatctgcttg
34.es64：
35.f：ttcggctatttgaacagaagca
36.r：tgatcccttcttgtttgatttttg。
37.本发明还提供一种辣椒杂交种纯度鉴定的ssr核心引物组的筛选方法，包括以下步骤：
38.s1、提取性状差异大的辣椒核心种质的dna；
39.s2、以步骤s1获得的dna为模板，对所述dna进行pcr扩增；
40.s3、利用琼脂凝胶电泳进行扩增产物筛分，获得条带清晰、多态性好的ssr引物。
41.进一步地，所述pcr扩增的反应体系总共20μl，包括：dntp0.25mmol/l，正反向引物各0.3mmol/l，taq dna聚合酶0.4u，dna模板50ng，余量的1
×
pcr缓冲液。
42.进一步地，所述pcr扩增的反应程序为：94℃预变性4min；94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸45s，共35个循环；72℃延伸10min，4℃保存。
43.本发明还提供一种上述的辣椒杂交种纯度鉴定的ssr核心引物组在辣椒种质资源遗传多样性分析或品种亲缘关系鉴定中的应用。
44.本发明公开了以下技术效果：
45.本发明通过对100个国内辣椒杂交种的dna指纹分析，确定适于纯度鉴定的核心引物的评估指标，进而确定一套辣椒杂交种纯度鉴定核心引物，确定特定品种的纯度鉴定的特异引物，旨在为构建辣椒杂交种纯度鉴定标准dna指纹图谱奠定基础。
46.本发明根据多态性和杂合率两个指标，确定hpms1
‑
214、es395和hpms1
‑
5为辣椒杂交种纯度鉴定的首选核心引物，利用这3个引物进行筛选，97个品种(占97％)能够找到具有杂合带型的鉴定引物，确定5个引物es330、es363、epms923、es120和es64为辣椒杂交种纯度鉴定的备选核心引物。筛选出14个品种的特异性引物，可进一步筛选每个辣椒杂交种的双亲互补型引物。
具体实施方式
47.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
48.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
49.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
50.在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
51.关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
52.实施例1
53.1.材料与方法
54.1.1材料
55.1.1.1材料
56.供试材料为辣椒杂交种，共100份。包括全国主要育种单位的辣椒品种，如中国农科院蔬菜花卉研究所、湖南湘研种业、江苏农科院、海花公司、河北省农科院、中国热带农业科学院、湖南省蔬菜研究所、四川省农科院等培育的骨干品种。这些品种基本上能代表目前国内辣椒新品种的情况。
57.1.1.2 ssr引物
58.根据“王凤格,赵久然,王璐等.适于玉米杂交种纯度鉴定的ssr核心引物的确定[j].农业生物技术学报,2007,15(6)：964
‑
969.”提出的核心引物的筛选原则，经网上初筛和实验室复筛，确定了17对多态性、稳性、重复性等综合性状好的引物，包括es330、es363、
epms923、hpms1
‑
214、epms697、es110、es120、es285、es292、es297、es395、hpms1
‑
106、epms712、es417、es321、es64和hpms1
‑
5。采用此17对ssr引物进行进一步的引物评估与筛选，以确定适于纯度鉴定的引物。引物正义链5'末端分别标记tamra、hex、rox、6
‑
fam四种荧光，利用dna分析仪检测不同等位变异的扩增片段大小。
[0059]
1.2方法
[0060]
1.2.1 dna提取
[0061]
每个品种随机取5个单株幼嫩组织，采用改进的ctab法进行单株提取dna。
[0062]
1.2.2 ssr扩增
[0063]
反应体系：20μl的反应体积，含每种dntp 0.25mmol/l，正反向引物各0.3mmol/l，taq dna聚合酶0.4u，1
×
pcr缓冲液(含mg
2
)，dna模板50ng。ssr荧光引物由上海生工合成。
[0064]
反应程序：94℃预变性4min，94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸45s，共35个循环；72℃延伸10min，4℃保存。pcr扩增在ab9700上进行。
[0065]
1.2.3电泳检测
[0066]
pcr产物变性后在abi 3130测序仪上分离，每个反应重复2次。
[0067]
1.2.4统计分析
[0068]
使用dna分析仪的片段分析软件，读出每个位点每个样品的等位变异大小数据。由于辣椒是二倍体及ssr标记的共显性特征，因此每个供试品种在每个引物位点上的基因型用纯合位点的等位变异记录为x/x，杂合位点的等位变异记录为x/y，其中x、y为该位点上两个不同的等位变异片段大小，小片段在前，大片段在后。无效等位变异的大小记录为0/0。
[0069]
评估引物多态性高低的指标用多态性信息量(polymorphism information content，pic)：pici＝1
‑
∑p
2ij
，式中，pi和pj分别代表第i个和第j个等位基因的频率，且i≠j。
[0070]
评估引物位点杂合程度的指标用杂合率：
[0071]
杂合率＝该引物位点上具有杂合带型的品种数/总品种数。
[0072]
2.结果
[0073]
2.1适于纯度鉴定用引物的选择
[0074]
利用17对ssr引物建立了100个辣椒品种的dna指纹图谱，根据图谱数据统计分析引物的基因频率及基因分布的基本信息及多态性和杂合表现。如表1所示，辣椒ssr引物的多态性和杂合率均不高，且pic值和杂合率这两个值不完全具有协同性，如epms697的pic值(0.51)较高，但杂合率(0.23)相对较低。
[0075]
表1 ssr引物的基本评估信息
[0076][0077]
按分类标准，把引物分为3类：(1)多态性高，且杂合率高：hpms1
‑
214、es395和hpms1
‑
5；(2)多态性高或中，且杂合率高或中：es330、es363、epms923、es120和es64；(3)多态性低或中，或杂合率低：epms697、es110、es285、es292、es297、hpms1
‑
106、epms712、es417和es321。
[0078]
采用hpms1
‑
214、es395和hpms1
‑
5三个引物，100个品种中97个具有杂合带型，3个品种(超级十六号、兴蔬201、博辣4号)不具有杂合带型，增加es64对这3个品种进行检测，均具有杂合带型。
[0079]
2.2纯度鉴定特异引物的确定
[0080]
特异引物是在特定品种范围内，利用单个引物检测，某品种的基因型仅出现1次(称为特异带型)或者根据基因频率表，预测基因型频率低于一定值的基因型，可将该引物作为该品种在特定品种范围内的特异引物。如果作为纯度鉴定的特异引物，还需限定其基因型应为杂合基因型。
[0081]
表2汇总了所有100个辣椒杂交种利用17个引物检测的结果，累计14个品种的基因型仅出现1次，具有特异引物，其中hpms1
‑
214和hpms1
‑
5作为特异引物的次数最多，分别为5个和7个，而es395没有作为特异引物。从多态性和杂合率上看，es395属于多态性和杂合率较高的引物，而es292属于多态性和杂合率较低的引物，表明能否找到特异引物与引物的多态性和杂合率没有直接的线性关系，而与引物不同等位基因出现频率的均匀程度关系较大。计算出的这些特征带型的实际基因型频率应为1.00e
‑
02(1/100)，而理论基因型频率最高的为2.50e
‑
02，最低的为6.00e
‑
04，7个品种的理论基因型频率高于实际基因型频率。
[0082]
表2具有特异引物的辣椒品种及其基因型
[0083][0084]
表3列出了每个引物理论上所具有的最低基因型频率及对应的基因型，单个引物基因型频率最低的为1.00e
‑
04。如果将预测基因型频率低于1.00e
‑
02(即1/100)的基因型作为特异基因型，则es120、es285、es297和epms712对任何品种均不可能成为特异引物，而其它13个引物则有可能成为具有特定基因型的品种的特异引物。
[0085]
表3引物具有最低基因型频率的基因型
[0086][0087]
3.结论
[0088]
3.1ssr分子标记在辣椒杂交种品种鉴定及纯度检测中的应用
[0089]
ssr分子标记已被广泛用于品种鉴定、指纹图谱、分子辅助育种等研究中，但是由于辣椒育种背景狭窄，ssr分子标记在辣椒杂交种中多态性较低(最高pic值为0.66)，杂合率也不高(最高杂合率为0.67)，难以区分更多的辣椒杂交种，也不利于在杂交种纯度检测，因此需要开发更多的多态性标记。
[0090]
3.2辣椒杂交种纯度鉴定用核心引物的筛选
[0091]
适于纯度鉴定的核心引物必须具备以下两个特征：杂合率高、多态性高。在本发明评估的17个引物中，综合表现最好的3个引物hpms1
‑
214、es395和hpms1
‑
5，采用这3个引物进行筛选，97％的品种均可以找到具有杂合带型的引物，满足检验自交苗的需要，且这3个引物多态性高，具有较高的验杂能力。因此，这3个引物可以推荐作为纯度鉴定的首选核心引物。其它5个中等表现的引物es330、es363、epms923、es120和es64，尽管综合表现比上述两个引物略差，但基本上满足要求，因此，推荐作为纯度鉴定的备选引物，补充解决上述两个引物不能鉴定的品种。其它9个引物，多态性或杂合率偏低，一般不建议作为纯度鉴定的引物。因此，如果不考虑引物的多态性，即引物区分异型株的能力，仅考虑引物区分自交苗的能力，这8个引物完全可以满足纯度鉴定的需要，而且，优先选用其中2
‑
3个引物(如hpms1
‑
214和es395)就可解决绝大部分品种的纯度鉴定。从工作效率上看，纯度鉴定每份样品一般检测100个单株，增加检测的引物数量会造成工作量的成倍增加。因此，核心引物的选择，极大地提高了检测的工作效率。
[0092]
3.3特定品种纯度鉴定所用特异引物筛选
[0093]
确定特定品种的特异引物，其意义在于，对于特定品种不需要多个引物的组合，而仅需一个引物就可以同时检验自交株和异型株，从而大大减少纯度鉴定的成本。
[0094]
作为某个特定品种的纯度鉴定特异引物，需满足两个条件，一是具有双亲互补带型，检验自交株，二是基因型频率足够低，可以区分异型株。如果主要目的是检验自交苗(在实际鉴定中比较普遍)，则特异引物只需是双亲互补型。由于特异引物一般是从推荐的核心引物中筛选到的，多态性较高，因此，仍具有一定的区分异型株的能力，单个引物基本上可以满足一般纯度鉴定的需要。只有在有必要的情况下，才增加引物数检测。
[0095]
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。