一种制备高纯度的诱导性多能干细胞来源的人脑多巴胺能神经元的方法与流程

技术特征：
1.一种用于快速高效制备高纯度的中脑foxa2

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多巴胺能神经元的培养液，其特征在于，包括分化培养液一、分化培养液二、分化培养液三、分化培养液四和分化培养液五；所述分化培养液一含有以下组分：dmem/f12、knockout serum replacement、glutamax、neaa、β
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me、sb431542和shh
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c24ii；所述分化培养液二含有以下组分：dmem/f12、knockout serum replacement、glutamax、neaa、β
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me、sb431542、shh
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c24ii、chir99021和fgf8b；所述分化培养液三含有以下组分：dmem/f12、neurobasal、glutamax、n2 supplement和fgf8b；所述分化培养液四含有以下组分：neurobasal、glutamax、b27 without vitamin a、fgf8b、bdnf、gdnf、l
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aa和db
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camp；所述分化培养液五含有以下组分：neurobasal、glutamax、b27 without vitamin a、bdnf、gdnf、l
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aa、db
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camp、dapt和tgfβ3。2.一种快速高效制备高纯度的中脑foxa2

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多巴胺能神经元的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)培养人类诱导多能干细胞；(2)中脑多巴胺能神经元前体细胞诱导；(3)中脑多巴胺能神经元前体细胞的鉴定及神经元的分化。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)具体步骤为：细胞每7天使用relesr消化以1：6的细胞数目比例进行传代；待细胞密度达到70％后可进行后续神经诱导实验。4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)具体步骤为：第0天：使用所述分化培养液一制备ipsc单细胞悬液，在经过聚合物基质lam
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111预处理的培养板孔中以一定密度加入单细胞悬浮液，轻摇培养板使细胞均匀分布，5％co2的湿润环境下37℃培养；第1～2天：吸除全部旧的培养液，并向培养板中每个孔加入预热的所述分化培养液一，放回37℃，5％co2的湿润环境中培养；第3～7天：每隔一天吸除全部旧的培养液，并向培养板中每个孔内加入预热的所述分化培养液二，放回37℃，5％co2的湿润环境中培养；第8～9天：吸除全部旧的培养液，并向培养板中每个孔内加入预热的所述分化培养液三，放回37℃，5％co2的湿润环境中培养；第10天：采用accutase消化细胞后使用所述分化培养液四制备ipsc单细胞悬液，在经过聚合物基质lam
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111预处理的培养板孔中以一定密度加入单细胞悬浮液，轻摇培养板使细胞均匀分布，5％co2的湿润环境下37℃培养；第11～15天：每隔一天吸除全部旧的培养液，并向培养板中每个孔加入预热的所述分化培养液四，放回37℃，5％co2的湿润环境中培养。5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(3)具体步骤为：第16天：采用accutase消化细胞后使用所述分化培养液五制备ipsc单细胞悬液，取少量细胞做免疫荧光染色检测中脑多巴胺能神经元前体细胞的标志物的表达；其余细胞以一
定密度接种至经过聚合物基质lam
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111预处理的培养板孔中，轻摇培养板使细胞均匀分布，在5％co2的湿润环境下37℃培养；第17天起：每隔两天吸除全部旧的培养液，并向培养板中每个孔加入预热的所述分化培养液五，放回37℃，5％co2的湿润环境中培养；待细胞具有典型神经元形态后可进行免疫荧光染色鉴定。6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述中脑多巴胺能神经元前体细胞的标志物为lmx1、foxa2、otx2和nestin中的至少一种。7.权利要求1所述培养液或权利要求2～6任一所述的方法在快速高效制备高纯度的中脑foxa2

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多巴胺能神经元中的应用。

技术总结
本发明涉及细胞培养领域，尤其涉及一种制备高纯度的诱导性多能干细胞来源的人脑多巴胺能神经元的方法。本发明提供一种人类多巴胺能神经元诱导方法和相关培养液配方。培养液中包括无血清基础培养基、细胞添加剂、神经发育因子和抑制剂。其中，利用无血清基础培养基可以避免引入外源性物质，降低污染风险，同时，多种营养成分，如细胞添加剂和神经发育因子，能够使iPSC细胞受到信号刺激，活化iPSC细胞，促进分化。本发明提供的细胞培养方法，简单高效、成本低、短周期内可诱导获得高质量的人类多巴胺能神经元细胞。胺能神经元细胞。胺能神经元细胞。


技术研发人员：张凌 何翠敏
受保护的技术使用者：广州瑞臻再生医学科技有限公司
技术研发日：2021.08.27
技术公布日：2021/12/14