BmSPI39的同型串联多聚体及其构建方法和应用与流程

bmspi39的同型串联多聚体及其构建方法和应用
技术领域
1.本发明涉及多聚体构建技术领域，具体涉及bmspi39的同型串联多聚体及其构建方法和应用。


背景技术：

2.家蚕(又称桑蚕)是一种绢丝昆虫，属鳞翅目蚕蛾科，具有非常高的经济价值。研究发现，昆虫体内的免疫过程缺乏淋巴细胞及免疫球蛋白的参与，病原微生物在入侵其宿主的过程中会分泌大量的胞外蛋白酶，这些胞外蛋白酶可作为毒力因子来辅助病原微生物对昆虫的入侵过程。为了抵御病原微生物的入侵，宿主生物在一般情况下都会表达高水平的蛋白酶抑制剂，以抵抗病原微生物所分泌的胞外蛋白酶。因此丝氨酸蛋白酶抑制剂在昆虫的免疫系统中占据非常重要的作用。
3.从家蚕中共鉴定到了80种丝氨酸蛋白酶抑制剂(serine protease inhibitor，spi)，其中包括11种spi结构域的蛋白酶抑制剂，即serpin、kunitz、bpti、kazal、til等。bmspi39属于til类蛋白酶抑制剂，可通过抑制球孢白僵菌分泌的体壁降解蛋白酶cdep
‑
1来防止真菌菌丝穿透家蚕体壁，因此可作为家蚕真菌抗性因子发挥重要的免疫功能。但是研究发现bmspi39单体形式无抑制活性，且发现bmspi39多聚体形式虽然具有对枯草杆菌蛋白酶和蛋白酶k的抑制活性，但是目前多聚体化对蛋白酶抑制剂自身活性的影响尚不完全清楚。且发现，现有技术中bmspi39多聚体活性低、均一性差。


技术实现要素：

4.为解决上述技术问题，本发明提供了bmspi39的同型串联多聚体及其构建方法和应用，利用同尾酶法设计并构建了bmspi39同型串联多聚体的表达载体，再通过转化、诱导表达、纯化获得bmspi39同型串联多聚体，能够成功抑制枯草杆菌蛋白酶、蛋白酶k的活性，且活性更强，表达形式更为均一。
5.本发明的第一个目的是提供bmspi39的同型串联多聚体的构建方法，具体包括如下步骤：
6.s1，设计并合成串联多聚体引物bmspi39
‑
nde i
‑
bamh i
‑
f、bmspi39
‑
not i
‑
r、bmspi39
‑
bgl ii
‑
r和bmspi39
‑
l
‑
bgl ii
‑
r，以bmspi39
‑
p28为模板扩增获得目的基因片段，回收目的片段后与t载体连接，然后转入感受态细胞，培养后筛选阳性克隆，分别记为，ndeⅰ/bamh
ⅰ‑
spi39
‑
notⅰ、nde i/bamh i
‑
spi39
‑
bglⅱ、nde i/bamh i
‑
spi39l
‑
bglⅱ；
7.所述引物bmspi39
‑
nde i
‑
bamh i
‑
f的核苷酸序列如seq id no.1所示；
8.所述引物bmspi39
‑
not i
‑
r的核苷酸序列如seq id no.2所示；
9.所述引物bmspi39
‑
bgl ii
‑
r的核苷酸序列如seq id no.3所示；
10.所述引物bmspi39
‑
l
‑
bgl ii
‑
r的核苷酸序列如seq id no.4所示；
11.s2，利用nde i和not i双酶切，将nde i/bamh i
‑
spi39
‑
not i从t载体上切下，连接到p28载体上，成功构建bmspi39单体的表达载体bmspi39
‑
monomer；
12.s3，同尾酶法(bamh i与bglⅱ互为同尾酶)设计并构建了bmspi39同型串联多聚体的表达载体；
13.所述bmspi39同型串联多聚体的表达载体包括bmspi39二聚体、bmspi39三聚体和bmspi39四聚体的表达载体；
14.s4，将获得的bmspi39单体的表达载体和bmspi39同型串联多聚体的表达载体转入大肠杆菌中，并利用iptg对其进行诱导表达，然后通过离心收集菌体、超声破碎菌体细胞，离心获得表达有bmspi39单体蛋白和bmspi39同型串联多聚体蛋白的菌体上清，然后进行蛋白纯化。
15.本发明的第二个目的是提供了由上述所述的bmspi39的同型串联多聚体的构建方法制备得到的bmspi39同型串联多聚体，所述bmspi39同型串联多聚体包括bmspi39单体、bmspi39同型串联二聚体、bmspi39同型串联三聚体和bmspi39同型串联四聚体。
16.本发明的第三个目的是提供了上述bmspi39同型串联多聚体在抗真菌中的应用。
17.与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
18.1、本发明通过同尾酶法成功构建了家蚕蛋白酶抑制剂bmspi39同型串联多聚体的基础载体，通过sds
‑
page发现，相较于bmspi39单体，串联多聚体能看到明显表达，且表达形式为可溶上清，可见串联形式明显提高了丝氨酸蛋白酶抑制剂bmspi39的表达量。
19.2、本发明获得的bmspi39同型串联多聚体在bl21(de3)以及origami2(de3)菌株中均以可溶形式进行表达，但活性分析发现在bl21(de3)中表达的蛋白活性条带更为均一，因此最佳诱导条件为0.2mm，37℃诱导5h，而且纯化得到的bmspi39串联多聚体蛋白表达量高、更为均一，且无自身多聚化现象，纯化得到的目的蛋白相对纯度达到90％以上，为进一步bmspi39串联多聚体抗真菌能力研究提供了基础条件，也有利于培育抗真菌转基因家蚕素材，有效推动该类抑制剂的应用研究。
20.3、本发明构建的bmspi39串联多聚体蛋白对枯草杆菌蛋白酶、蛋白酶k均表现出较强的抑制活性，bmspi39串联多聚体在bl21(de3)以及origami2(de3)菌株中的表达量均比较高。
附图说明
21.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
22.图1表示本发明中bmspi39串联多聚体载体构建模式图，其中，左半部分为不加linker组，右半部分加linker组；
23.图2表示本发明中bmspi39串联多聚体的载体片段pcr扩增产物电泳检测，其中，pcr扩增产物包括nde i/bamh i
‑
spi39
‑
not i，nde i/bamh i
‑
spi39
‑
bglⅱ和nde i/bamh i
‑
spi39l
‑
bglⅱ；
24.图3表示本发明中基础载体片段的菌液pcr产物电泳检测图；
25.其中，图a表示基础载体nde i/bamh i
‑
spi39
‑
not i和nde i/bamh i
‑
spi39
‑
bglⅱ的菌液pcr产物电泳检测图；
26.图b表示基础载体nde i/bamh i
‑
spi39l
‑
bglⅱ的菌液pcr产物电泳检测；
27.图4表示本发明中bmspi39串联多聚体表达载体的双酶切验证，箭头所指为目的基因片段；p28为空载体对照；
28.图5表示本发明中在大肠杆菌细胞中表达的bmspi39串联多聚体蛋白的sds
‑
page分析；
29.其中，图a表示在bl21(de3)细胞中表达的bmspi39串联多聚体蛋白的sds
‑
page分析；
30.图b表示在origami 2(de3)细胞中表达的bmspi39串联多聚体蛋白的sds
‑
page分析；
31.图6表示本发明在bl21(de3)及origami 2(de3)细胞中表达的bmspi39串联多聚体蛋白的活性分析；
32.图中，“si”为枯草杆菌蛋白酶抑制条带；“ki”为蛋白酶k抑制条带；“hemolymph”为5龄第5天的大造品系的家蚕血液；“control”，为分别转入p28空载体的bl21(de3)和origami 2(de3)的细胞裂解液；
33.图7表示本发明中bmspi39串联多聚体蛋白的纯化检测；
34.其中，图a表示bmspi39
‑
monomer的镍柱亲和层析检测；
35.图b表示bmspi39
‑
dimer的镍柱亲和层析检测；
36.图c表示bmspi39
‑
l
‑
dimer的镍柱亲和层析检测；
37.图d表示bmspi39
‑
trimer的镍柱亲和层析检测；
38.图e表示bmspi39
‑
l
‑
trimer的镍柱亲和层析检测；
39.图f表示bmspi39
‑
tetramer的镍柱亲和层析检测；
40.图g表示bmspi39
‑
l
‑
tetramer的镍柱亲和层析检测；
41.图h表示纯化的bmspi39串联多聚体蛋白检测；
42.图7中“w20”、“w50”、“w100”表示用20、50或100mm咪唑漂洗或洗脱；“e400”表示用400mm咪唑洗脱；箭头所指为目标蛋白纯化条带。
具体实施方式
43.下面对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明各实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
44.实施例1
45.一、实验材料及试剂准备
46.1、实验材料
47.宿主菌大肠杆菌trans1
‑
t1感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司，bl21(de3)感受态细胞购自生工生物工程(上海)股份有限公司，origami 2(de3)菌株由本实验室自己保存，p28载体由陕西理工大学维生素d生理与应用研究所保存。
48.2实验试剂
49.(1)分子克隆相关试剂
50.抗生素贮存溶液及其工作浓度：
51.硫酸卡那霉素，贮存液浓度为50mg/ml(ddh2o)，工作浓度为50μg/ml(ddh2o)，保存条件
‑
20℃；
52.链霉素，贮存液浓度为10mg/ml(ddh2o)，工作浓度为10μg/ml(ddh2o)，保存条件
‑
20℃；
53.盐酸四环素，贮存液浓度为5mg/ml(ddh2o)，工作浓度为5μg/ml(ddh2o)，保存条件
‑
20℃；
[0054]2‑
yt液体培养基
[0055]
成分为：蛋白胨6.4g，nacl 2g，酵母提取物4g，加ddh2o定容至400ml，混合均匀后121℃高压灭菌20min，4℃保存备用。
[0056]2‑
yt固体培养基：琼脂粉6g，nacl 2g，蛋白胨6.4g，加ddh2o定容至400ml，混合均匀后121℃高压灭菌20min。
[0057]
若是配置含有抗生素的培养基，待其冷却到60℃之后，再按照1/1000的工作浓度加入抗生素，混合均匀后再倒平板。
[0058]
iptg储液(24mg/ml)
[0059]
iptg 2.4g，加入超纯水使其混合均匀后，再将其定容至100ml，后使用0.22μm的滤膜过滤除菌，分装至2ml离心管内，
‑
20℃保存。
[0060]
(2)sds
‑
page相关试剂
[0061]
30％丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺：丙烯酰胺290g，甲叉双丙烯酰胺10g，加入部分超纯水使其混合均匀后，再将其定容至1l，之后用0.45μm滤膜过滤一遍，4℃避光保存。
[0062]
1.5m tris
‑
hcl(ph 8.8)：tris 181.7g，先加部分超纯水充分溶解，浓盐酸调ph至8.8，后使用超纯水定容至1l，用0.45μm孔径滤膜过滤除菌，4℃保存。
[0063]
1m tris
‑
hcl(ph 6.8)：tris 121g，先加部分超纯水充分溶解，浓盐酸调ph至6.8，后使用超纯水定容至1l，用0.45μm孔径滤膜过滤除菌，4℃保存。
[0064]
10％sds：sds 0.5g，使其充分溶解于5ml超纯水中，室温保存。
[0065]
10％aps：过硫酸铵1g，加10ml超纯水使其充分溶解，4℃保存，现配现用。
[0066]3×
sds
‑
page上样缓冲液：50％甘油3ml，1m tris
‑
hcl(ph 6.8)1.5ml，sds 0.6g，溴酚蓝0.03g，加超纯水定容至10ml，分装至1.5ml离心管，
‑
20℃冻存。使用前每1ml加入30μlβ
‑
巯基乙醇，混匀后方可使用。
[0067]5×
sds
‑
page电泳缓冲液：甘氨酸94g，sds 5.0g，tris 15.1g，加入超纯水使其混合均匀后，定容至1l，室温保存。
[0068]
考马斯亮蓝染色液：甲醇454ml，冰醋酸92ml，考马斯亮蓝r250 2.5g，加入ddh2o使其混合均匀后定容至1l，滤纸过滤，室温保存。
[0069]
考马斯亮蓝脱色液：冰醋酸75ml，甲醇50ml，加入ddh2o使其混合均匀后，定容至1l，室温保存。
[0070]
(3)活性检测相关试剂
[0071]1×
结合缓冲液：20mm tris
‑
hcl，500mm nacl，ph8.0。
[0072]
a液：tris 36.3g，1m hcl 48ml，temed 0.230ml，加入超纯水使其混合均匀后，定
容至100ml，4℃避光保存。
[0073]
b液：tris 5.98g，1m hcl 48ml，temed 0.46ml，加入超纯水使其混合均匀后，定容至100ml，4℃避光保存。
[0074]
c液：丙烯酰胺30g，甲叉双丙烯酰胺0.8g，加入超纯水使其混合均匀后，定容至100ml，0.45μm滤膜抽滤，4℃避光保存。
[0075]
d液：甲叉双丙烯酰胺2.5g，丙烯酰胺10g，加入超纯水使其混合均匀后，定容至100ml，0.45μm滤膜抽滤，4℃避光保存。
[0076]
e液：核黄素8mg，加入超纯水使其混合均匀后，定容至100ml，4℃避光保存。
[0077]
g液：过硫酸铵(aps)0.7g，加入超纯水使其混合均匀后，定容至100ml，4℃避光保存，一般现配现用。
[0078]4×
native
‑
page上样缓冲液：40mm tris
‑
hcl(8.0)，40％甘油，0.032％溴酚蓝，4℃保存。
[0079]
10
×
tris
‑
glycine电泳缓冲液：甘氨酸28.8g，tris 6g，加超纯水定容至1l，室温保存。
[0080]
基质液：量取200mg n
‑
acetyl
‑
d,l
‑
phenylalanine
‑
β
‑
naphthylester，溶于100ml n,n'
‑
二甲基甲酰胺，4℃避光保存。
[0081]
蛋白酶溶液：蛋白酶14mg，将其溶于200ml 100mm tris
‑
hcl(含20mmcacl2，ph 8.0)溶液中，4℃避光保存。
[0082]
染色液与基质液的混合液：fast blue b salt 0.1g，将其溶于100ml 100mm tris
‑
hcl(含20mm cacl2，ph 8.0)溶液中，搅拌混合，待溶液出现桃红色时，加入10ml基质液，混合均匀，现配现用。
[0083]
(4)蛋白纯化相关试剂
[0084]
20％乙醇：量取无水乙醇20ml，加ddh2o定容至100ml。
[0085]
离子化缓冲液：200mm nicl2。
[0086]4×
结合缓冲液：2m nacl，80mm tris
‑
hcl，ph 8.0。
[0087]1×
结合缓冲液(含1m咪唑)：500mm nacl，20mm tris
‑
hcl，1m咪唑，ph 8.0。
[0088]
1m naoh溶液：naoh 20g，加ddh2o充分溶解后定容至1l，0.45μm滤膜过滤，室温保存。
[0089]
剥离缓冲液：500mm nacl，100mm edta，20mm tris
‑
hcl，ph 8.0。
[0090]
5mm edta溶液：edta na
2 0.93g，加部分ddh2o溶解后，使用naoh调ph至8.0，最后用ddh2o定容至500ml，4℃保存。
[0091]
2％(w/v)nahco3和1mm edta(ph 8.0)混合液：称取固体nahco310g，溶于100ml 5mm edta溶液中，加ddh2o定容至500ml，4℃保存。
[0092]
0.2m nah2po4溶液：nah2po
4 23.996g，ddh2o定容至l。
[0093]
0.2m na2hpo4溶液：na2hpo
4 28.392g，ddh2o定容至1l。
[0094]
0.01m pbs缓冲液(ph 7.4)：0.2m na2hpo
4 87.7ml，0.2m nah2po412.3ml，ddh2o定容至1ml。
[0095]
二、bmspi39的同型串联多聚体的构建方法，具体过程如下：
[0096]
1、bmspi39同型串联多聚体的载体构建
[0097]
(1)pcr扩增目的基因片段
[0098]
利用primer premier 5.0软件进行引物设计，并送至生工生物有限公司进行合成。共设计了两套方案：第一组为不加linker组；第二组为加linker组(linker为串联多聚体表达框间的柔性片段，有利于蛋白表达过程中正确折叠，其编码序列为：
[0099]
ggcggtggtggctcaggcggtggtggctcaggcggtggtggctca)。
[0100]
具体的引物包括bmspi39
‑
nde i
‑
bamh i
‑
f(其核苷酸序列如seq id no.1所示)、bmspi39
‑
not i
‑
r(其核苷酸序列如seq id no.2所示)、bmspi39
‑
bgl ii
‑
r(其核苷酸序列如seq id no.3所示)和bmspi39
‑
l
‑
bgl ii
‑
r(其核苷酸序列如seq id no.4所示)，具体的引物序列如表1所示，pcr扩增反应体系如表2所示，其中模板bmspi39
‑
p28的构建方法记载于本技术人曾申请的专利中(专利号为cn102532305b)，也于论文《til
‑
type protease inhibitors may be used as targeted resistance factors to enhance silkworm defenses against invasive fungi》中有记载，pcr扩增程序如表3所示：
[0101]
表1引物序列
[0102][0103]
注：下划线为linker的编码序列。
[0104]
表2 pcr扩增反应体系
[0105][0106][0107]
表3 pcr扩增程序
[0108][0109]
预计扩增出来的条带为ndeⅰ/bamh
ⅰ‑
spi39
‑
notⅰ、nde i/bamh i
‑
spi39
‑
bglⅱ、nde i/bamh i
‑
spi39l
‑
bglⅱ(目的片段名称均为本实验室团队自己设计、命名)。待扩增结束后，使用1.5％琼脂糖凝胶进行核酸电泳，胶回收步骤可参照easypure胶回收试剂盒，后进行连接。
[0110]
(2)ta克隆连接
[0111]
参照peasy
‑
t1
‑
simple载体(简称t载体)使用说明书,将回收得到的目的片段(ndeⅰ/bamh
ⅰ‑
spi39
‑
notⅰ、nde i/bamh i
‑
spi39
‑
bglⅱ、nde i/bamh i
‑
spi39l
‑
bglⅱ)与载体模板(p28)之间进行连接，连接体系为：回收产物4μl，vector 1μl，连接条件：25℃连接8min；
[0112]
所述peasy
‑
t1
‑
simple载体由北京全式金生物技术有限公司提供。
[0113]
(3)目的片段转化入trans1
‑
t1感受态细胞
[0114]
利用(2)中连接的连接产物将目的片段转化入trans1
‑
t1感受态细胞。具体包括如下步骤：
[0115]
i，提前于
‑
20℃预冷移液器吸头与离心管，从
‑
80℃取出trans1
‑
t1感受态细胞并迅速置于冰上；
[0116]
ii，待感受态细胞刚融化时，向其中加入连接产物，动作轻柔的使它们混匀在一起，注意全程都在冰上操作，混合完成后，冰上冷却半小时；
[0117]
iii，42℃热激90s，后迅速将其冰浴5min；
[0118]
iv，冰浴完成，向离心管内加入900μl无抗性的2
‑
yt液体培养基，然后于恒温摇床进行培养，37℃，220rpm培养1h。
[0119]
v，培养结束，3500rpm离心5min，离心完成弃去部分上清；
[0120]
vi，剩余100μl菌液及菌体沉淀，向其中加入40μl x
‑
gal和4μl iptg，吹吸混和均匀后，涂布于具有卡那霉素抗性的2
‑
yt固体培养基上；
[0121]
vii，在37℃的恒温培养箱中进行培养，先把平板正置培养10min，然后再把平板倒置培养12h。
[0122]
(4)筛选阳性克隆
[0123]
挑选大而圆润的白色单菌落，接种于1ml卡那霉素抗性的液体培养基中37℃，220rpm培养4h以上，将获得的菌液进行pcr筛选阳性克隆，pcr扩增体系如表4所示，扩增程序如表3所示。
[0124]
表4 pcr扩增反应体系
[0125][0126]
pcr结束后，挑选阳性克隆进行测序，得到的测序结果通过bioxm 2.6和chromas 2.3软件进行分析，看是否与预期目的片段一致。
[0127]
(5)bmspi39
‑
monomer(bmspi39单体)载体构建
[0128]
使用ndeⅰ、not内切酶分别对nde/bamh
ⅰ‑
spi39
‑
notⅰ以及p28载体进行双酶切(双酶切体系如表5所示)，在t4连接酶作用下进行连接(连接体系如下表6所示)，连接成功的目的载体为nde i/bamh i
‑
spi39
‑
not i
‑
p28，即bmspi39
‑
monomer(bmspi39单体)表达载体，然后将其转化进大肠杆菌trans1
‑
t1感受态细胞，随后进行一系列细菌培养、质粒提取(参照easypure plasmid miniprep kit步骤进行)等步骤，获得构建成功的bmspi39
‑
monomer质粒，
‑
20℃保存。
[0129]
表5双酶切体系
[0130][0131]
注：37℃过夜酶切。
[0132]
表6连接体系
[0133][0134]
注：16℃，连接3h以上。
[0135]
(6)bmspi39
‑
dimer和bmspi39
‑
l
‑
dimer载体构建
[0136]
同尾酶法构建bmspi39串联二聚体：先使用nde i、bglⅱ两种限制性核酸内切酶对表达在t载体上的nde i/bamh i
‑
spi39
‑
bglⅱ，nde i/bamh i
‑
spi39l
‑
bglⅱ进行双酶切(双酶切体系如表7所示)，再使用nde i和bamh i两种酶对已构建成功的bmspi39
‑
monomer进行双酶切(双酶切体系如表8所示)。酶切结束后使用t4 dna连接酶分别将nde i/bamh i
‑
spi39
‑
bglⅱ与bmspi39
‑
monomer以及nde i/bamh i
‑
spi39l
‑
bglⅱ与bmspi39
‑
monomer进行连接，同上(5)中经转化、细菌培养、提取质粒，获得构建成功的bmspi39
‑
dimer载体(bmspi39串联二聚体载体)。
[0137]
表7 nde i/bgl ii双酶切体系
[0138][0139]
注：将nde i、bgl ii同时加入，37℃过夜酶切。
[0140]
表8 nde i/bamh i双酶切体系
[0141][0142]
注：nde i先37℃过夜酶切12h后加入bamh i，随后在30℃酶切4h。
[0143]
(7)bmspi39
‑
trimer、bmspi39
‑
l
‑
trimer、bmspi39
‑
tetramer和bmspi39
‑
l
‑
tetramer表达载体的构建
[0144]
步骤与(6)中基本相同，利用同尾酶法构建bmspi39
‑
trimer、bmspi39
‑
l
‑
trimer、bmspi39
‑
tetramer和bmspi39
‑
l
‑
tetramer，区别在于nde i/bamh i双酶切体系中(表8)，bmspi39三聚体载体构建中将bmspi39
‑
monomer相应的替换为bmspi39
‑
dimer或bmspi39
‑
l
‑
dimer；bmspi39四聚体载体构建中将bmspi39
‑
monomer相应的替换为bmspi39
‑
trimer或bmspi39
‑
l
‑
trimer；连接体系参照上表6。
[0145]
(8)双酶切验证
[0146]
使用ndeⅰ、notⅰ内切酶分别对构建成功的bmspi39同型串联多聚体载体进行双酶切验证，具体包括对bmspi39
‑
monomer、bmspi39
‑
dimer、bmspi39
‑
l
‑
dimer、bmspi39
‑
trimer、bmspi39
‑
l
‑
trimer、bmspi39
‑
tetramer和bmspi39
‑
l
‑
tetramer的双酶切验证，双酶切体系如表9：
[0147]
表9 nde i/not i双酶切反应体系
[0148][0149]
2、bmspi39同型串联多聚体的原核表达
[0150]
(1)大肠杆菌origami 2(de3)的感受态细胞制备
[0151]
i，取
‑
80℃冰箱冻存的大肠杆菌origami 2(de3)菌株，溶解后稀释涂布于含具有链霉素和四环素抗性的2
‑
yt固体培养基进行活化，于培养箱中37℃倒置培养，待菌落生长到直径2mm左右。
[0152]
ii，挑取生长合适的单菌落，接种于抗四环素、链霉素的2
‑
yt液体培养基中，于恒温摇床37℃，250rpm充分震荡，培养12h。
[0153]
iii，过夜活化的菌液按1/100的比例接种至50ml bt media(已灭菌)中，然后在恒温摇床上37℃，250rpm振荡培养至菌液od
600
＝0.5～0.6。
[0154]
iv，摇好的菌液转存到50ml离心管(已灭菌)中，冰上冷却10min。
[0155]
v，4℃，4000rpm离心5min收集菌体沉淀。
[0156]
vi，使用16ml冰上预冷的bt buffer a对收集到的菌体进行充分重悬，注意动作轻柔，然后冰上静置15min。
[0157]
vii，于4℃，4000rpm，离心3min收集菌体沉淀。
[0158]
viii，紧接着使用4ml冰上预冷的bt buffer b轻柔且充分地重悬菌体，然后分装
至预冷过的1.5ml ep管中，每管分装100μl。
[0159]
ix，分装好的菌体使用液氮进行瞬时冷冻，于
‑
80℃超低温冰箱保存。
[0160]
(2)bmspi39同型串联多聚体转化
[0161]
将bmspi39同型串联多聚体的单体、二聚体、三聚体、四聚体分别转化进大肠杆菌bl21(de3)及origami 2(de3)菌株，转化步骤如下：
[0162]
i，预冷移液器吸头和1.5ml ep管，将从
‑
80℃取出的bl21(de3)/origami2(de3)感受态细胞置冰上快速融化，然后吸取1μl的串联多聚体质粒加入感受态细胞中，轻柔混匀后，冰浴30min。
[0163]
ii，42℃热激90s，热激结束快速插入冰中冷却5min。
[0164]
iii，加入无抗性的2
‑
yt液体培养基900μl，37℃，220rpm孵育1h。
[0165]
iv，菌液摇混后使用3500rpm，离心5min，除去部分上清液。
[0166]
v，剩余菌液吹吸混匀分别涂布于卡那霉素抗性和三种抗性(卡那霉素/链霉素/四环素)的2
‑
yt固体培养基上，后将固体平板37℃倒置培养12h。
[0167]
(3)bmspi39同型串联多聚体诱导
[0168]
i，挑取大而圆润的单菌落，分别置于1ml卡那霉素抗性和三种抗性(卡那霉素/链霉素/四环素)的2
‑
yt液体培养基中，于恒温摇床37℃，220rpm过夜培养；
[0169]
ii，吸取过夜摇混的菌液150μl于15ml具有卡那霉素抗性和三种抗性(卡那霉素/链霉素/四环素)的2
‑
yt液体培养基中，37℃，220rpm培养至菌液od
600
＝0.6～1.0时迅速插入冰中延缓生长；
[0170]
iii，按1/500比例加入0.1m iptg贮藏液(即工作浓度0.2mm)，于37℃，220rpm诱导5h或16℃，220rpm诱导20h；
[0171]
iv，诱导结束后，4℃，6000rpm离心20min，弃去上清液；
[0172]
v，加入1.5ml的1
×
结合缓冲液重悬菌体，4℃，6000rpm离心10min，弃去上清液；
[0173]
vi，再加入1ml 1
×
结合缓冲液重悬菌体，4℃，6000rpm离心10min，弃去上清液；
[0174]
vii，最后加入450μl 1
×
结合缓冲液重悬菌体，
‑
20℃保存。
[0175]
0.2mm iptg工作浓度下分别在bl21(de3)以及origami 2(de3)菌株中进行诱导表达，具体操作步骤同上，并选取最优表达条件进行后续的蛋白表达与纯化。
[0176]
(4)bmspi39同型串联多聚体细胞破碎
[0177]
将冻存的菌体混匀物置于冰上解冻，使用超声波破碎仪30w破碎20min；至菌体混匀液透亮后，16000g，4℃离心30min，分离上清与沉淀，使用250μl的1
×
结合缓冲液吹吸重悬沉淀，
‑
20℃保存上清液及沉淀物。
[0178]
(5)sds
‑
page检测
[0179]
i，配制16.5％分离胶(配方见表10)与配制5％浓缩胶(配方见表11)。
[0180]
ii，吸取10μl样品于500μl离心管中，加入3
×
sds
‑
page上样缓冲液，混和后沸水中煮样10min，蛋白质分子量标准煮沸5min。
[0181]
iii，将5
×
sds
‑
page电泳缓冲液稀释至1
×
sds
‑
page电泳缓冲液，然后分别加入电泳槽的内槽和外槽，点样后接入电源，设置浓缩胶10ma/块、分离胶15ma/块的恒流进行电泳。
[0182]
iv，拆胶后使用考马斯亮蓝染色液进行染色，直至胶面呈深蓝色时停止。
[0183]
v，回收染色液，并用ddh2o反复冲洗胶面，后将胶块置于脱色液中过夜脱色至条带清晰，分析目的蛋白的表达情况。
[0184]
表10 sds
‑
page 16.5％分离胶的配方
[0185][0186]
表11 sds
‑
page 5％浓缩胶的配方
[0187][0188]
3、bmspi39同型串联多聚体的活性分析
[0189]
(1)配制用于native
‑
page的10％分离胶(配方见下表12)和4％浓缩胶(配方见下表13)；
[0190]
(2)吸取12μl上清样品于200μl离心管中，加入4
×
native
‑
page上样缓冲液混合后，使用同上2.2.2.5的恒流于4℃进行蛋白电泳；
[0191]
(3)电泳后的胶用蛋白酶溶液进行孵育，37℃，45rpm避光振荡30min；
[0192]
(3)回收蛋白酶溶液，用ddh2o轻柔冲洗2次后37℃避光静置15min；
[0193]
(4)加入染色液与基质液的混合液，37℃，45rpm避光振荡15min；
[0194]
(5)染色结束后倒掉染色液，使用ddh2o反复清洗胶面终止反应；
[0195]
(6)扫描胶图，观察蛋白酶抑制剂对不同蛋白酶(枯草杆菌蛋白酶、蛋白酶k)抑制情况。
[0196]
表12活性胶10％分离胶的配方
[0197][0198]
表13活性胶4％浓缩胶的配方
[0199][0200]
4、bmspi39同型串联多聚体的纯化
[0201]
(1)上清形式重组蛋白的制备
[0202]
扩大诱导：将表达在bl21(de3)中的bmspi39串联多聚体的菌株重新活化，按照1/100的比例接种于400ml具有三种抗性(卡那霉素/链霉素/四环素)的2
‑
yt液体培养基中，参照先前的原核表达检测结果，调整并选取最优的诱导条件于37℃，220rpm大量诱导5h。
[0203]
离心收集菌体：使用冷冻离心机，4℃，6000rpm离心30min收集菌体。加入1
×
结合缓冲液使沉淀的总体积达到40ml吹吸混匀，相同条件再次离心20min，弃上清，最后用40ml 1
×
结合缓冲液重悬菌体。
[0204]
超声细胞破碎：在冰上操作进行超声破碎，超声条件为：超声2s，停顿3s，功率为250w，对应的超声时间为30min以上。
[0205]
离心收集上清：将破碎好的菌体4℃，16000g离心30min，收集上清冰上保存，以防蛋白降解。
[0206]
(2)bmspi39串联多聚体的镍柱亲和层析纯化
[0207]
镍柱平衡：取一根相应规格的ni
‑
nta预装柱(预装柱体积为1ml)，在其底部安装流速控制设备，将存储缓冲液(20％乙醇)通过重力流出。使用10个柱体积的ddh2o冲洗柱子，避免液体流干损坏镍柱。使用10倍柱体积的binding buffer(1
×
结合缓冲液，不含咪唑)平衡镍柱，注意控制流速0.5～1.0ml/min。
[0208]
样品上柱：将破碎过的上清液蛋白样品4℃，12000rpm离心30min，上清液经0.45μm滤膜过滤(去除粘稠状杂质，防止堵膜)后样品上柱，流速控制在0.5
‑
1.0ml/min。
[0209]
洗脱蛋白：使用梯度浓度咪唑洗脱，洗脱顺序如下：
[0210]
10ml 0mm咪唑除去未结合的蛋白；
i/bamh i
‑
spi39
‑
not i(255bp)、nde i/bamh i
‑
spi39
‑
bglⅱ(248bp)、nde i/bamh i
‑
spi39l
‑
bglⅱ(293bp)3个基因片段扩增成功，且大小与预期一致。
[0236]
(3)bmspi39串联多聚体的载体片段菌液pcr产物电泳检测
[0237]
将nde i/bamh i
‑
spi39
‑
not i，nde i/bamh i
‑
spi39
‑
bglⅱ，nde i/bamh i
‑
spi39l
‑
bglⅱ3个基因片段分别连接到peasy
‑
t1
‑
simple载体上，转化入trans1
‑
t1感受态细胞中。为了筛选阳性克隆，使用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测菌液pcr产物，其检测结果如图3所示。选取能够扩增出预期大小基因片段的菌株送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。
[0238]
(4)bmspi39串联多聚体表达载体的双酶切验证
[0239]
为了验证bmspi39串联多聚体表达载体是否构建成功，我们使用nde i和not i两种酶进行了双酶切验证(如图4)。经过1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如下：箭头所指示条带从左至右，分别代表bmspi39
‑
monomer(248bp)、bmspi39
‑
dimer(476bp)、bmspi39
‑
l
‑
dimer(521bp)、bmspi39
‑
trimer(704bp)、bmspi39
‑
l
‑
trimer(794bp)、bmspi39
‑
tetramer(932bp)、bmspi39
‑
l
‑
tetramer(1067bp)，符合预期，表明bmspi39串联多聚体载体构建成功。
[0240]
2、bmspi39同型串联多聚体sds
‑
page分析
[0241]
为了获得bmspi39串联多聚体蛋白，将串联多聚体表达载体分别转化入大肠杆菌bl21(de3)和origami 2(de3)两种表达菌株中，用工作浓度为0.2mm的iptg进行诱导表达，并以16.5％的分离胶进行sds
‑
page检测(如图5)。结果表明，bmspi39串联多聚体蛋白在bl21(de3)与origami 2(de3)菌株中均主要以可溶形式表达，且二聚体、三聚体、四聚体的表达量明显高于单体。
[0242]
3、bmspi39同型串联多聚体的活性分析
[0243]
使用10％的活性胶对转入bl21(de3)和origami 2(de3)不同菌株的bmspi39串联多聚体表达蛋白进行活性检测，探究它们对枯草杆菌蛋白酶、蛋白酶k的抑制活性(图6)。活性分析结果表明在上样量一致的情况下，在bl21(de3)菌株以及origami 2(de3)菌株中表达的bmspi39串联多聚体蛋白均表现出了对枯草杆菌蛋白酶、蛋白酶k的抑制活性。在origami 2(de3)中表达的bmspi39单体对蛋白酶k的抑制活性强于枯草杆菌蛋白酶；四聚体对枯草杆菌蛋白酶的抑制活性相较于蛋白酶k更强。多聚体活性较强，单体抑制活性则相对较弱。总体来看origami 2(de3)组抑制活性强于bl21(de3)组，但bl21(de3)组表达形式更为均一。
[0244]
4、bmspi39同型串联多聚体的纯化
[0245]
为了获得bmspi39串联多聚体的纯蛋白，将携有bmspi39同型串联多聚体表达载体的bl21(de3)中的菌株重新活化，扩大培养，并选取0.2mm的iptg37℃诱导5h，诱导结束后破碎收集可溶形式的上清液，开始上柱纯化，纯化结果如图7。
[0246]
由图7可知，大部分的目的蛋白在50mm咪唑浓度下开始被洗脱下来，但杂蛋白浓度较高，箭头所标识出来的即为纯化得到目的蛋白。且由图7可知单体、二聚体(bmspi39
‑
dimer、bmspi39
‑
l
‑
dimer)的表达量明显高于三聚体(bmspi39
‑
trimer、bmspi39
‑
l
‑
trimer)、四聚体(bmspi39
‑
tetramer、bmspi39
‑
l
‑
tetramer)，经过第一次纯化得到的目标蛋白也是单体和二聚体浓度更高、纯度更高。通过加大诱导量纯化出足量目的蛋白后进行
收集，透析结束后二次纯化，如图(7，h)目的蛋白的纯度皆在90％以上。
[0247]
综上所述，本发明利用同尾酶法成功构建出了4种形式的bmspi39串联多聚体，包括单体、二聚体、三聚体和四聚体等，并将重组表达载体转化入大肠杆菌bl21(de3)以及origami 2(de3)菌株中表达，经过iptg诱导并破碎细胞后得到可溶上清，使用sds
‑
page分析了串联多聚体的蛋白表达情况。紧接着利用蛋白酶抑制剂胶内活性染色法进行活性分析。结果表明，构建成功的家蚕抗性因子bmspi39串联多聚体蛋白在bl21(de3)菌株和origami 2(de3)菌株中均以可溶形式高量表达，且对枯草杆菌蛋白酶、蛋白酶k均表现出抑制活性，多聚体相比于单体活性更强。经过表达纯化我们也获得了均一的串联多聚体，纯化得到的目的蛋白相对纯度达到90％以上，有利于为后续的抗真菌活性检测试验奠定基础。
[0248]
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
[0249]
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。