一种促进口腔黏膜间充质干细胞再生能力的方法及其应用与流程

1.本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种促进口腔黏膜间充质干细胞再生能力的方法及其应用。


背景技术：

2.口腔黏膜是组织的天然屏障，对环境变化很敏感，具有很强的愈合与修复能力，固有层中含有间充质干细胞，可以表达干细胞相关蛋白，具有自我更新、能实现跨胚层分化等，在维持组织的动态平衡以及受损后的修复再生发挥重要作用。
3.通过与体内各种组织细胞和环境接触中，口间充质干细胞可以接受周围环境中多种分化信号，进而在适宜的环境中向所需要的细胞类型分化、增殖、迁移，从而发挥填补缺损、重建组织的功能。选择合适的间充质干细胞为种子细胞，建立恰当的细胞增殖和再生培养体系，促进间充质干细胞再生的作用，这种功能不仅与其自身的增殖分化有关，也可与分泌有利于组织再生的细胞因子或者形成促愈合的细胞外基质等成分有关。然而，在没有局部特定宿主环境诱导分化的条件下，间充质干细胞的组织特异性的增殖和分化行为很少受到关注。所以在特定微环境中，研究间充质干细胞的功能，具有重要的意义。


技术实现要素：

4.本发明所要解决的技术问题是提供一种促进口腔黏膜间充质干细胞再生能力的方法及其应用，其解决了现有基质材料难以精确调控干细胞成纤维能力的技术问题，可广泛应用于凝胶纤维调控三维间充质干细胞再生领域。
5.本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：
6.一种促进口腔黏膜间充质干细胞再生能力的方法，包括以下步骤：
7.(1)注射器吸取1ml纤维蛋白胶溶液；
8.(2)口腔黏膜间充质干细胞的培养基悬液的制备；
9.(3)将步骤(1)吸取的纤维蛋白胶溶液迅速注射至培养皿内，同时将步骤(2)制备的口腔黏膜间充质干细胞的培养基悬液也迅速均匀滴至纤维蛋白凝胶上，迅速混匀，均匀固化后置入培养液中保存。
10.优选地，步骤(2)包括以下步骤：
11.(21)口腔黏膜间充质干细胞培养在含10％fbs的α
‑
mem培养液的培养皿中，37℃、5％co2饱和湿度的孵箱中培养；
12.(22)取出细胞培养皿，pbs清洗；
13.(23)加入胰蛋白酶消化贴壁培养的细胞2
‑
3min，吸弃胰蛋白酶，加入含10％fbs的α
‑
mem培养液以终止消化，吹打培养皿底层，转移至离心管，离心弃上清；
14.(24)收集单层培养的口腔黏膜间充质干细胞，用含10％fbs的α
‑
mem培养液充分混匀，反复吹打以机械力离散细胞团块，调整密度至2
×
106个/ml，待用。
15.优选地，步骤(21)的培养皿为直径10cm的培养皿，培养天数为3天。
16.优选地，步骤(22)中pbs清洗为每次3min，重复3次。
17.优选地，步骤(23)中胰蛋白酶的加入量为1ml，含10％fbs的α
‑
mem培养液的加入量为2ml；离心的条件为：1000rpm离心5min。
18.优选地，步骤(3)具体为：
19.将步骤(1)注射器吸取的1ml纤维蛋白溶液迅速均匀注射至培养皿内，再吸取1ml步骤(2)制备的口腔黏膜间充质干细胞培养基悬液同步迅速均匀滴至纤维蛋白溶液上，10s内迅速混匀，均匀固化，静置2min后，在细胞
‑
纤维蛋白胶复合体的培养皿内加入含10％fbs的α
‑
mem培养液，将其在37℃、5％co2、饱和湿度的孵箱内培养。
20.优选地，该方法还包括以下步骤：
21.(4)将步骤(3)的细胞
‑
纤维蛋白胶复合体的团块组织培养数天后，固定、包埋、切片后，分别采用h&e染色和masson染色后观察组织中细胞形态。
22.一种纤维蛋白凝胶，包括促进口腔黏膜间充质干细胞再生能力的方法获得的细胞
‑
纤维蛋白胶复合体。
23.一种促进口腔黏膜间充质干细胞再生能力的方法的应用。
24.优选地，应用于间充质干细胞的再生领域以及对黏膜组织的修复领域。
25.本发明上述技术方案，具有如下有益效果：
26.(1)检测口腔黏膜间充质干细胞在体内的胶原形成能力，生物材料支架可以为口腔黏膜提供一个有利的环境，纤维蛋白凝胶是具有三维结构，由纤维蛋白原在凝血酶的裂解作用下形成，免疫原性低，经过一系列凝固反应后，表现出可降解的性能，它可以广泛应用于手术止血、再生医学和组织工程领域。
27.(2)纤维蛋白凝胶可以作为间充质干细胞的载体，间充质干细胞在其上可以展现天然的生物学行为，对口腔黏膜间充质干细胞的分析表明它们在凝胶内保持纤维蛋白形成能力，所以口腔黏膜间充质干细胞可能是组织工程新的干细胞来源。
28.(3)将间充质干细胞结合纤维蛋白胶，可以成为纤维组织支架，凝胶中的间充质干细胞再生的胶原可有效的用于组织再生。
附图说明
29.被结合在说明书中并构成说明书的一部分的附图示出了本发明的实施例，并且连同其说明一起用于解释本发明的原理。
30.图1为本技术的口腔黏膜间充质干细胞与纤维蛋白胶结合(细胞
‑
纤维蛋白胶复合体)的示意图。
31.图2为本技术的细胞
‑
纤维蛋白胶复合体的团块组织培养数天后h&e染色图。
32.图3为本技术的细胞
‑
纤维蛋白胶复合体的团块组织培养数天后masson染色图。
具体实施方式
33.现在将参照附图来详细描述本发明的各种示例性实施例。应注意到：除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的部件和步骤的相对布置、数字表达式和数值不限制本发明的范围。
34.图1为本技术的口腔黏膜间充质干细胞与纤维蛋白胶结合(细胞
‑
纤维蛋白胶复合
体)的示意图。图2为本技术的细胞
‑
纤维蛋白胶复合体的团块组织培养数天后h&e染色图。图3为本技术的细胞
‑
纤维蛋白胶复合体的团块组织培养数天后masson染色图。如图1、图2和图3所示：
35.一种促进口腔黏膜间充质干细胞再生能力的方法，包括以下步骤：
36.(1)注射器吸取1ml纤维蛋白胶溶液(市售)；
37.(2)口腔黏膜间充质干细胞的培养基悬液的制备：
38.(21)口腔黏膜间充质干细胞培养在含10％fbs的α
‑
mem培养液(市售)的培养皿中，37℃、5％co2饱和湿度的孵箱中培养；
39.(22)取出细胞培养皿，pbs清洗；
40.(23)加入胰蛋白酶消化贴壁培养的细胞2
‑
3min，吸弃胰蛋白酶，加入含10％fbs的α
‑
mem培养液以终止消化，吹打培养皿底层，转移至离心管，离心弃上清；
41.(24)收集单层培养的口腔黏膜间充质干细胞，用含10％fbs的α
‑
mem培养液充分混匀，反复吹打以机械力离散细胞团块，调整密度至2
×
106个/ml，待用；
42.(3)将步骤(1)注射器吸取的1ml纤维蛋白溶液迅速均匀注射至培养皿内，再吸取1ml步骤(2)制备的口腔黏膜间充质干细胞培养基悬液同步迅速均匀滴至纤维蛋白溶液上，10s内迅速混匀，均匀固化，静置2min后，在细胞
‑
纤维蛋白胶复合体的培养皿内加入含10％fbs的α
‑
mem培养液，将其在37℃、5％co2、饱和湿度的孵箱内培养。
43.进一步地，步骤(21)的培养皿为直径10cm的培养皿，培养天数为3天。步骤(22)中pbs清洗为每次3min，重复3次。步骤(23)中胰蛋白酶的加入量为1ml，含10％fbs的α
‑
mem培养液的加入量为2ml；离心的条件为：1000rpm离心5min。当然，本技术并不以此为限，本领域技术人员可根据需要对上述反应条件以及试剂和药品的用量作出调整。
44.进一步地，该方法还包括以下步骤：
45.(4)将步骤(3)的细胞
‑
纤维蛋白胶复合体的团块组织培养1个月后，固定、包埋、切片后，分别采用h&e染色和masson染色后观察组织中细胞形态：h&e和masson染色发现这些组织中细胞呈梭形为主的成纤维细胞样形态，细胞外基质丰富，细胞和胶原纤维走行类似黏膜固有层组织。
46.h&e染色步骤：石蜡切片二甲苯10min 3次；梯度酒精100％、95％、90％、80％、70％各5min；自来水冲洗5min。切片入苏木色精中染色约2min，用自来水流水冲洗使切片颜色发蓝。将切片放入1％盐酸酒精液中褪色，见切片变红，颜色较浅时即可，约数秒至数十秒钟。用0.5％伊红酒精液对比染色2～5min。自来水洗5min；梯度酒精70％、80％、90％、95％、100％脱水，二甲苯10min 3次透明，树胶封片，显微镜下观察。
47.masson三色法步骤：石蜡切片二甲苯10min 3次；梯度酒精100％、95％、90％、80％、70％各5min；铬化处理或去汞盐沉淀。依次自来水和蒸馏水洗5min。用weigert苏木精液染核5
‑
10min。充分水洗,如过染可盐酸酒精分化。蒸馏水洗5min。用masson丽春红酸性复红液5
‑
10min。以2％冰醋酸水溶液浸洗片刻。1％磷钼酸水溶液分化3
‑
5min。不经水洗,直接用苯胺蓝或光绿液染5min。以0.2％冰醋酸水溶液浸洗片刻。95％酒精、无水酒精、二甲苯透明、中性树胶封固。
48.通过上述的促进口腔黏膜间充质干细胞再生能力的方法最终获得的细胞
‑
纤维蛋白胶复合体(如图1所示)。h&e染色可见间充质干细胞在纤维蛋白胶支架上呈梭形为主的成
纤维细胞样形态，形成类似胶原纤维走行的结构(如图2所示)；masson染色发现口腔黏膜间充质干细胞在支架上细胞外基质丰富，形成细胞和胶原纤维走行的类似形态(如图3所示)。
49.一种纤维蛋白凝胶，该凝胶包括上述的细胞
‑
纤维蛋白胶复合体，该凝胶可用于间充质干细胞的再生领域以及黏膜组织的修复。
50.上述的促进口腔黏膜间充质干细胞再生能力的方法或者纤维蛋白凝胶均可应用于间充质干细胞的再生领域以及黏膜组织的修复领域，具有潜在价值。
51.本技术的口腔黏膜间充质干细胞可以表现为一个具有细胞治疗潜能的细胞群，是口腔黏膜组织工程的一个新的细胞来源。此外，纤维蛋白凝胶可为间充质干细胞再生胶原提供载体，这种再生的微环境，促进口腔黏膜间充质干细胞再生能力。
52.虽然本发明已以实施例公开如上，然其并非用于限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，均可作各种不同的选择和修改，因此本发明的保护范围由权利要求书及其等同形式所限定。