T细胞受体及其使用方法与流程

t细胞受体及其使用方法
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‑
web以电子方式提交的序列表的引用
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技术领域
5.本公开提供特异性地结合人gp100的重组t细胞受体(“tcr”)及其用途。
6.发明背景
7.在与包括癌症的多种疾病的斗争中免疫疗法作为关键工具而出现。t细胞疗法处于免疫治疗剂发展的最前方，并且抗肿瘤t细胞的过继转移已显示在癌症患者中诱导临床应答。虽然许多t细胞疗法靶向突变的肿瘤抗原，但对于各患者而言绝大多数新抗原并非共同拥有的而为独特的。
8.潜在非突变抗原超出突变抗原数目多个数量级。阐明源自共同拥有的抗原的t细胞表位可促进较大群组癌症患者轻易可获得的有效且安全的过继t细胞疗法的稳健发展。然而，非突变抗原的绝对数目和hla基因的高多态性可能已妨碍了对非突变抗原的抗肿瘤t细胞应答的特异性的综合分析。
9.本公开提供非突变抗原gp100的新颖表位和能够特异性地结合所述表位的tcr。这些新颖表位与特定hla等位基因相关。这些肿瘤反应性hla限制性gp100 tcr的使用支持加宽抗gp100 tcr基因疗法尤其在免疫肿瘤学中的适用性。


技术实现要素：

10.本公开的某些方面涉及一种核酸分子，所述核酸分子包含(i)第一核苷酸序列，所述第一核苷酸序列编码特异性地结合人gp100的重组t细胞受体(tcr)或其抗原结合部分(“抗gp100 tcr”)；和(ii)第二核苷酸序列，其中所述第二核苷酸序列或由第二核苷酸序列编码的多肽抑制内源性tcr的表达，其中所述抗gp100 tcr与参考tcr交叉竞争结合于人gp100，所述参考tcr包含α链和β链，并且其中所述α链包含如seq id no:1中所列的氨基酸序列且所述β链包含如seq id no:2中所列的氨基酸序列。
11.本公开的某些方面涉及一种核酸分子，所述核酸分子包含(i)第一核苷酸序列，所述第一核苷酸序列编码特异性地结合人gp100的重组t细胞受体(tcr)或其抗原结合部分(“抗gp100 tcr”)；和(ii)第二核苷酸序列，其中所述第二核苷酸序列或由所述第二核苷酸序列编码的多肽抑制内源性tcr的表达，其中所述抗gp100 tcr与参考tcr结合人gp100的相同表位或重叠表位，所述参考tcr包含α链和β链，其中所述α链包含如seq id no:1中所列的氨基酸序列且所述β链包含如seq id no:2中所列的氨基酸序列。
12.在一些实施方案中，所述抗gp100 tcr结合于gp100的由如seq id no:13中所列的
氨基酸序列组成的表位。在一些实施方案中，所述表位与hla i类分子复合。
13.在一些实施方案中，所述hla i类分子为hla
‑
a、hla
‑
b、hla
‑
c、hla
‑
e、hla
‑
f或hla
‑
g等位基因。在一些实施方案中，所述hla i类分子为hla
‑
b*40等位基因。在一些实施方案中，所述hla i类分子选自hla
‑
b*40:01等位基因、hla
‑
b*40:02等位基因、hla
‑
b*40:03等位基因、hla
‑
b*40:04等位基因、hla
‑
b*40:05等位基因和hla
‑
b*40:06等位基因。在一些实施方案中，所述hla i类分子为hla
‑
b*40:01等位基因。
14.在一些实施方案中，所述抗gp100 tcr包含α链和β链，其中所述α链包含含有α链cdr1、α链cdr2和α链cdr3的可变区；并且其中所述β链包含含有β链cdr1、β链cdr2和β链cdr3的可变结构域；其中所述α链cdr3包含如seq id no:7中所列的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗gp100 tcr的β链cdr3包含如seq id no:10中所列的氨基酸序列。
15.在一些实施方案中，所述抗gp100 tcr包含α链和β链，其中所述α链包含含有α链cdr1、α链cdr2和α链cdr3的可变区；并且其中所述β链包含含有β链cdr1、β链cdr2和β链cdr3的可变结构域；其中所述抗gp100 tcr的β链cdr3包含如seq id no:10中所列的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗gp100 tcr的α链cdr3包含如seq id no:7中所列的氨基酸序列。
16.在一些实施方案中，所述抗gp100 tcr的α链cdr1包含如seq id no:5中所列的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗gp100tcr的β链cdr1包含如seq id no:8中所列的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗gp100 tcr的α链cdr2包含如seq id no:6中所列的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗gp100 tcr的β链cdr2包含如seq id no:9中所列的氨基酸序列。
17.在一些实施方案中，所述抗gp100 tcr的α链可变结构域包含seq id no:1所列的氨基酸序列中存在的可变结构域的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗gp100 tcr的β链可变结构域包含seq id no:2所列的氨基酸序列中存在的可变结构域的氨基酸序列。
18.在一些实施方案中，所述抗gp100 tcr的α链还包含恒定区，其中所述恒定区不同于所述α链的内源性恒定区。在一些实施方案中，所述抗gp100 tcr的α链还包含恒定区，其中所述α链恒定区包含与seq id no:1所列的氨基酸序列中存在的恒定区具有至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述α链恒定区包含相对于seq id no:1所列的氨基酸序列中存在的恒定区包含至少1个、至少2个、至少3个、至少4个或至少5个氨基酸取代的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗gp100 tcr的β链还包含恒定区，其中所述恒定区不同于所述β链的内源性恒定区。
19.在一些实施方案中，所述抗gp100 tcr的β链还包含恒定区，其中所述β链恒定区包含与seq id no:2所列的氨基酸序列中存在的恒定区具有至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述β链恒定区包含相对于seq id no:2所列的氨基酸序列中存在的恒定区包含至少1个、至少2个、至少3个、至少4个或至少5个氨基酸取代的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗gp100 tcr的α链包含如seq id no:1中所列的氨基酸序列。
20.在一些实施方案中，所述抗gp100 tcr的β链包含如seq id no:2中所列的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述第二核苷酸序列为降低内源性tcr的表达的一种或多种
sirna。
21.在一些实施方案中，所述一种或多种sirna与编码内源性tcr的恒定区的核苷酸序列内的靶序列互补。在一些实施方案中，所述一种或多种sirna包含选自由seq id no:53
‑
56组成的组的一个或多个核苷酸序列。
22.在一些实施方案中，所述第二核苷酸序列编码cas9。
23.在一些实施方案中，所述抗gp100 tcr包含α链恒定区、β链恒定区或两者；并且其中所述α链恒定区、β链恒定区或两者包含相对于内源性tcr的对应氨基酸序列在靶序列内具有至少1个、至少2个、至少3个、至少4个或至少5个取代的氨基酸序列。
24.本公开的某些方面涉及一种包含本文所公开的核酸分子的载体。在一些实施方案中，所述载体为病毒载体、哺乳动物载体或细菌载体。在一些实施方案中，所述载体为逆转录病毒载体。在一些实施方案中，所述载体选自由以下组成的组：腺病毒载体、慢病毒、仙台病毒(sendai virus)载体、杆状病毒载体、爱泼斯坦巴尔病毒载体(epstein barr viral vector)、乳多空病毒载体、痘苗病毒载体、单纯疱疹病毒载体、杂合载体和腺相关病毒(aav)载体。在一些实施方案中，所述载体为慢病毒。
25.本公开的某些方面涉及一种t细胞受体(tcr)或其抗原结合部分，其包含本文所公开的抗gp100 tcr的α链可变结构域和本文所公开的抗gp100 tcr的β链可变结构域。在一些实施方案中，所述特异性地结合人gp100的重组t细胞受体(tcr)或其抗原结合部分(“抗gp100 tcr”)与参考tcr交叉竞争结合于人gp100；其中所述参考tcr包含α链和β链，并且其中所述α链包含如seq id no:1中所列的氨基酸序列且所述β链包含如seq id no:2中所列的氨基酸序列；并且其中所述抗gp100 tcr包含α链和β链，其中所述α链包含恒定区，并且其中所述β链包含恒定区；其中(i)所述α链恒定区包含相对于seq id no:1中所列的氨基酸序列中存在的恒定区具有至少1个、至少2个、至少3个、至少4个或至少5个氨基酸取代的氨基酸序列，或(ii)所述β链恒定区包含相对于seq id no:2的氨基酸序列中存在的恒定区具有至少1个、至少2个、至少3个、至少4个或至少5个氨基酸取代的氨基酸序列。
26.本公开的某些方面涉及一种特异性地结合人gp100的重组t细胞受体(tcr)或其抗原结合部分(“抗gp100 tcr”)，其与参考tcr结合人gp100的相同表位或重叠表位；其中所述参考tcr包含α链和β链，并且其中所述α链包含如seq id no:1中所列的氨基酸序列且所述β链包含如seq id no:2中所列的氨基酸序列；并且其中所述抗gp100 tcr包含α链和β链，其中所述α链包含恒定区，并且其中所述β链包含恒定区；其中(i)所述α链恒定区包含相对于seq id no:1中所列的氨基酸序列中存在的恒定区具有至少1个、至少2个、至少3个、至少4个或至少5个氨基酸取代的氨基酸序列，或(ii)所述β链恒定区包含相对于seq id no:2中所列的氨基酸序列中存在的恒定区具有至少1个、至少2个、至少3个、至少4个或至少5个氨基酸取代的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗gp100 tcr结合于gp100的由如seq id no:13中所列的氨基酸序列组成的表位。
27.在一些实施方案中，所述表位与hla i类分子复合。在一些实施方案中，所述hla i类分子为hla
‑
a、hla
‑
b、hla
‑
c、hla
‑
e、hla
‑
f或hla
‑
g等位基因。在一些实施方案中，所述hla i类分子为hla
‑
b*40等位基因。在一些实施方案中，所述hla i类分子选自hla
‑
b*40:01等位基因、hla
‑
b*40:02等位基因、hla
‑
b*40:03等位基因、hla
‑
b*40:04等位基因、hla
‑
b*40:05等位基因和hla
‑
b*40:06等位基因。在一些实施方案中，所述hla i类分子为hla
‑
b*40:01等
位基因。
28.在一些实施方案中，所述抗gp100 tcr的α链包含含有α链cdr1、α链cdr2和α链cdr3的可变结构域；并且其中所述抗gp100 tcr的β链包含含有β链cdr1、β链cdr2和β链cdr3的可变结构域；其中所述抗gp100的α链cdr3包含如seq id no:7中所列的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗gp100 tcr的β链cdr3包含如seq id no:10中所列的氨基酸序列。
29.在一些实施方案中，所述抗gp100 tcr的α链包含含有α链cdr1、α链cdr2和α链cdr3的可变结构域；并且其中所述抗gp100 tcr的β链包含含有β链cdr1、β链cdr2和β链cdr3的可变结构域；其中所述抗gp100 tcr的β链cdr3包含如seq id no:10中所列的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗gp100 tcr的α链cdr3包含如seq id no:7中所列的氨基酸序列。
30.在一些实施方案中，所述抗gp100 tcr的α链cdr1包含如seq id no:5中所列的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗gp100tcr的β链cdr1包含如seq id no:8中所列的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗gp100 tcr的α链cdr2包含如seq id no:6中所列的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗gp100 tcr的β链cdr2包含如seq id no:9中所列的氨基酸序列。
31.在一些实施方案中，所述抗gp100 tcr的α链可变结构域包含seq id no:1中所列的氨基酸序列中存在的可变结构域的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗gp100 tcr的β链可变结构域包含seq id no:2中所列的氨基酸序列中存在的可变结构域的氨基酸序列。
32.在一些实施方案中，所述α链恒定区包含与seq id no:1中所列的氨基酸序列中存在的恒定区的氨基酸序列具有至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。
33.在一些实施方案中，所述β链恒定区包含与seq id no:2中所列的氨基酸序列中存在的恒定区的氨基酸序列具有至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。
34.在一些实施方案中，所述抗gp100 tcr的α链包含如seq id no:1中所列的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗gp100 tcr的β链包含如seq id no:2中所列的氨基酸序列。
35.本公开的某些方面涉及一种包含第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域的双特异性tcr，其中所述第一抗原结合结构域包含本文所公开的tcr或其抗原结合部分或本文所公开的tcr或其抗原结合部分。在一些实施方案中，所述第一抗原结合结构域包含单链可变片段(“scfv”)。在一些实施方案中，所述第二抗原结合结构域特异性地结合于t细胞表面上表达的蛋白质。在一些实施方案中，所述第二抗原结合结构域特异性地结合于cd3。在一些实施方案中，所述第二抗原结合结构域包含scfv。在一些实施方案中，所述第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域通过共价键连接或缔合。在一些实施方案中，所述第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域通过肽键连接。
36.本公开的某些方面涉及一种包含本文所公开的核酸分子、本文所公开的载体、本文所公开的tcr、本文所公开的重组tcr或本文所公开的双特异性tcr的细胞。在一些实施方案中，所述细胞进一步表达cd3。在一些实施方案中，所述细胞选自由以下组成的组：t细胞、自然杀伤(nk)细胞、自然杀伤t(nkt)细胞或ilc细胞。
37.本公开的某些方面涉及一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括向
所述受试者施用本文所公开的细胞。在一些实施方案中，所述癌症选自由以下组成的组：黑素瘤、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛门区癌症、胃癌、睪丸癌、子宫癌、输卵管癌瘤、子宫内膜癌瘤、子宫颈癌瘤、阴道癌瘤、外阴癌瘤、霍奇金氏病(hodgkin's disease)、非霍奇金氏淋巴瘤(nhl)、原发性纵隔大b细胞淋巴瘤(pmbc)、弥漫性大b细胞淋巴瘤(dlbcl)、滤泡性淋巴瘤(fl)、转化的滤泡性淋巴瘤、脾边缘区淋巴瘤(smzl)、食管癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、慢性或急性白血病、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、急性成淋巴细胞性白血病(all)(包括非t细胞all)、慢性淋巴细胞性白血病(cll)、儿童期实体肿瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾脏或输尿管癌、肾盂癌瘤、中枢神经系统(cns)赘瘤、原发性cns淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊柱轴肿瘤、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西氏肉瘤(kaposi's sarcoma)、表皮样癌、鳞状细胞癌、t细胞淋巴瘤、环境诱发的癌症(包括由石棉诱发的那些癌症)、其他b细胞恶性肿瘤和所述癌症的组合。
38.在一些实施方案中，所述癌症为复发性或难治性的。在一些实施方案中，所述癌症为局部晚期的。在一些实施方案中，所述癌症为晚期的。在一些实施方案中，所述癌症为转移性的。
39.在一些实施方案中，所述细胞获自受试者。在一些实施方案中，所述细胞获自除所述受试者外的供体。在一些实施方案中，所述受试者在施用所述细胞之前经预处理。在一些实施方案中，所述预处理包括向所述受试者施用化学疗法、细胞因子、蛋白质、小分子或其任何组合。在一些实施方案中，所述预处理包括施用白细胞介素。在一些实施方案中，所述预处理包括施用il
‑
2、il
‑
4、il
‑
7、il
‑
9、il
‑
15、il
‑
21或其任何组合。在一些实施方案中，所述预处理包括施用选自由以下组成的组的预处理剂：环磷酰胺、氟达拉滨(fludarabine)、维生素c、akt抑制剂、atra、雷帕霉素(rapamycin)或其任何组合。在一些实施方案中，所述预处理包括施用环磷酰胺、氟达拉滨或两者。
40.本公开的某些方面涉及一种对靶向抗原的细胞进行工程改造的方法，所述方法包括将从需要t细胞疗法的受试者收集的细胞用本文所公开的核酸或本文所公开的载体转导。在一些实施方案中，所述靶向抗原的细胞进一步表达cd3。在一些实施方案中，所述细胞为t细胞或自然杀伤(nk)细胞。
41.本公开的某些方面涉及一种与肽复合的hla i类分子，其中所述hla i类分子包含α1结构域、α2结构域、α3结构域和β2m，并且其中所述肽由如seq id no:14中所列的氨基酸序列组成。
42.在一些实施方案中，所述hla i类分子为hla
‑
a、hla
‑
b、hla
‑
c、hla
‑
e、hla
‑
f或hla
‑
g。在一些实施方案中，所述hla i类分子为hla
‑
b。在一些实施方案中，所述hla i类分子为hla
‑
b*40等位基因。在一些实施方案中，所述hla i类分子选自hla
‑
b*40:01等位基因、hla
‑
b*40:02等位基因、hla
‑
b*40:03等位基因、hla
‑
b*40:04等位基因、hla
‑
b*40:05等位基因和hla
‑
b*40:06等位基因。在一些实施方案中，所述hla i类分子为hla
‑
b*40:01等位基因。在一些实施方案中，所述hla i类分子为hla
‑
b*40:02等位基因。
43.在一些实施方案中，所述hla i类分子为单体。在一些实施方案中，所述hla i类分子为二聚体。在一些实施方案中，所述hla i类分子为三聚体。在一些实施方案中，所述hla i类分子为四聚体。在一些实施方案中，所述hla i类分子为五聚体。
44.本公开的某些方面涉及一种抗原呈递细胞(apc)，所述抗原呈递细胞包含本文所公开的hla i类分子。在一些实施方案中，所述hla i类分子在所述apc的表面上表达。
45.本公开的某些方面涉及一种富集获自人受试者的靶t细胞群体的方法，所述方法包括使所述t细胞与本文所公开的hla i类分子或本文所公开的apc接触，其中在所述接触之后，相对于所述接触之前能够结合所述hla i类分子的t细胞数目，经富集的t细胞群体包含更高数目的能够结合所述hla i类分子的t细胞。
46.本公开的某些方面涉及一种富集获自人受试者的靶t细胞群体的方法，所述方法包括使所述t细胞在体外与肽接触，其中所述肽由如seq id no:13中所列的氨基酸序列组成，其中在所述接触之后，相对于所述接触之前能够靶向肿瘤细胞的t细胞数目，经富集的t细胞群体包含更高数目的能够靶向肿瘤细胞的t细胞。
47.在一些实施方案中，所述获自人受试者的t细胞为肿瘤浸润淋巴细胞(til)。
48.本公开的某些方面涉及一种治疗有需要的受试者的肿瘤的方法，所述方法包括向所述受试者施用本文所公开的经富集的t细胞群体。
49.本公开的某些方面涉及一种增强罹患癌症的受试者中细胞毒性t细胞介导的癌细胞靶向的方法，所述方法包括向所述受试者施用具有如seq id no:13中所列的氨基酸序列的肽。
50.本公开的某些方面涉及一种癌症疫苗，所述癌症疫苗包含具有如seq id no:13中所列的氨基酸序列的肽。
51.本公开的某些方面涉及一种选择能够靶向肿瘤细胞的t细胞的方法，所述方法包括使经分离的t细胞的群体在体外与肽接触，其中所述肽由如seq id no:11中所列的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，所述t细胞为肿瘤浸润淋巴细胞(til)。
附图说明
52.图1为说明在用使用重叠肽脉冲处理的人工apc刺激之后黑素瘤til中的b*40:01/gp100 t细胞的数目的条形图。在ifn
‑
γelispot分析中，采用用使用用于涵盖gp100的全蛋白的重叠肽脉冲处理的b*40:01
‑
人工apc刺激一次的til作为应答细胞。将使用gp100来源的重叠肽脉冲处理的b*40:01
‑
人工apc用作刺激细胞。在一次受控肽特异性刺激之后，til显示对具有共同拥有的序列
446
stesitgslgplldg
460
的两个相邻肽的阳性应答。(亦参见表5)。
53.图2a
‑
2d为黑素瘤til的b*40:01/gp100
448
‑
458
多聚体染色的图形表示。将til用使用gp100
448
esitgslgpll
458
肽脉冲处理的b*40:01
‑
人工apc刺激一次。显示关于刺激之前(第0天；图2a和2c)和刺激之后14天(第14天；图2b和2d)b*40:01/gp100
448
‑
458
(图2a
‑
2b)或对照b*40:01/hiv nef
92
‑
100
(图2c
‑
2d)多聚体染色的数据。显示cd8

t细胞中多聚体

细胞的百分比。
54.图3为示出b*40:01/gp100
448
‑
458
多聚体阳性黑素瘤til的功能评估的条形图。在一次肽特异性刺激之后til以b*40:01/gp100
448
‑
458
特异性方式产生ifn
‑
γ。在ifn
‑
γelispot分析中，采用用使用gp100
448
‑
458
肽脉冲处理的b*40:01
‑
人工apc刺激一次的til作为应答细胞。将使用所指示的肽脉冲处理的b*40:01
‑
人工apc用作刺激细胞。采用hiv nef
92
‑
100和
gp100
448
‑
458
肽作为对照。一式三份进行实验，并且误差线展示sd。*p<0.05。
55.图4a
‑
4i为用在同源多聚体情况下b*40:01/gp100
448
‑
458
tcr基因转导的jurkat 76/cd8细胞的阳性染色的图形表示。将用b*40:01/gp100
448
‑
458
tcr(图4b、4e和4h)转导的jurkat 76/cd8细胞用b*40:01/gp100
448
‑
458
多聚体(图4b)染色。采用b*40:01/ny
‑
eso
‑1125
‑
133
多聚体(图4d、4e和4f)、b*40:01/未交换多聚体(图4g、4h和4i)和用b*40:01/ny
‑
eso
‑1125
‑
133
tcr转导和未转导(图4a、4d和4g)的jurkat 76/cd8细胞作为对照。显示多聚体

cd8

细胞的百分比。
56.图5a
‑
5d为用在同源多聚体情况下b*40:01/gp100
448
‑
458
tcr基因(图5b和5d)转导的人原代t细胞的阳性染色的图形表示。将用b*40:01/gp100
448
‑
458
tcr转导的原代t细胞用b*40:01/gp100
448
‑
458
(图5b)或b*40:01/hiv nef
92
‑
100
对照多聚体(图5d)染色。采用未转导的原代t细胞作为阴性对照(图5a和5c)。显示多聚体

cd8

t细胞的百分比。
57.图6为说明用b*40:01/gp100
448
‑
458
tcr基因转导的人原代t细胞与由靶i类分子呈递的同源肽强烈反应的条形图。在ifn
‑
γelispot分析中，将用b*40:01/gp100
448
‑
458
tcr基因转导的原代t细胞或未转导的原代t细胞用作应答细胞。产生了hla
‑
b*40:01转导的t2细胞(t2
‑
b*40:01)。采用t2或用gp100
448
‑
458
或hiv nef
92
‑
100
肽(对照)脉冲处理的t2
‑
b*40:01细胞作为刺激细胞。一式三份进行实验，并且误差线展示sd。*p<0.05,**p<0.01。
58.图7a为说明用b*40:01/gp100
448
‑
458
tcr基因转导的原代t细胞识别肿瘤细胞的图形表示。在ifn
‑
γelispot分析中，采用用b*40:01/gp100
448
‑
458
tcr基因转导的原代t细胞或未转导的原代t细胞作为应答细胞。如图7b(图7a的图例)中所指示，在用100ng/ml ifnγ处理48小时后，采用未转导或用hla
‑
b*40:01和/或gp100转导的sk
‑
mel
‑
28和sk
‑
mel
‑
37细胞作为刺激细胞。一式三份进行实验，并且误差线展示sd。*p<0.05,**p<0.01。
59.图8a
‑
8d为源自内源性或经转导的全长基因的gp100的表达的图形表示。在用抗gp100 mab(空心曲线)和同种型对照(实心曲线)染色之后，经由细胞内流式细胞术对源自内源性或经转导的全长基因的gp100在靶细胞中的表达进行分析。
60.图9a
‑
9b为δngfr在用使用δngfr标记的全长hla
‑
b*40:01基因转导的靶细胞(图9b)中的表达的图形表示。在用抗ngfr mab(空心曲线)和同种型对照(实心曲线)染色之后，通过流式细胞术对δngfr在用使用δngfr标记的全长hla
‑
b*40:01基因转导的靶细胞中的表面表达进行分析。将单独δngfr用作对照(图9a)。
具体实施方式
61.本公开涉及特异性地结合于gp100上的表位的tcr或其抗原结合部分、编码所述tcr的核酸分子以及包含所述tcr或所述核酸分子的细胞。本公开的一些方面涉及治疗有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用所述细胞。本公开的其他方面涉及与包含gp100的表位的肽复合的hla i类分子。
62.i.术语
63.为使本公开可更容易理解，首先定义某些术语。如本技术中所用，除非本文中以其他方式明确提供，否则以下术语中的每一者应具有下文所阐述的含义。本技术中阐述了其他定义。
64.应当注意，术语“一个/种(a/an)”实体是指一个或多个(种)所述实体；举例而言，“一个核苷酸序列”应理解为表示一个或多个核苷酸序列。因而，术语“一个/种(a/an)”、“一
个/种或多个/种”和“至少一个/种”在本文中可互换使用。
65.此外，“和/或”当在本文中使用时应视为在存在或不存在另一者的情况下特定地公开两种指定特征或组分中的每一者。因此，术语“和/或”当在本文中用于诸如“a和/或b”的短语中时意图包括“a和b”、“a或b”、“a”(单独)以及“b”(单独)。同样地，术语“和/或”当用于诸如“a、b和/或c”的短语中时意图涵盖以下方面中的每一者：a、b和c；a、b或c；a或c；a或b；b或c；a和c；a和b；b和c；a(单独)；b(单独)；和c(单独)。
66.术语“约”在本文中用于指大约、大致、约或在
……
附近。当术语“约”与数值范围结合使用时，其通过扩大所阐述数值以上和以下的界限来修饰所述范围。一般而言，术语“约”在本文中用于修饰向上或向下(更高或更低)偏差为10％的高于和低于所陈述值的数值。
67.应了解，在本文中无论何处使用措辞“包含”描述方面，均还提供以术语“由
……
组成”和/或“基本上由
……
组成”描述的以其他方式类似的方面。
68.除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有本领域普通技术人员通常所理解相同的含义。举例而言，concise dictionary of biomedicine and molecular biology,juo,pei
‑
show,第2版,2002,crc press；the dictionary of cell and molecular biology,第3版,1999,academic press；和oxford dictionary of biochemistry and molecular biology,修订版,2000,oxford university press为技术人员提供本公开中所用的许多术语的综合词典。
69.单位、前缀和符号以其国际单位制(syst
è
me international de unites，si)所接受的形式表示。数值范围包括界定范围的数字。除非另外指出，否则核苷酸序列从左至右以5’至3’方向书写。氨基酸序列从左至右以氨基至羧基方向书写。本文所提供的标题并非对本公开的各种方面的限制，可通过参考说明书作为整体而具有所述标题。因此，下文紧接着所定义的术语通过整体地参考本说明书而被更完整地定义。
[0070]“施用”是指使用本领域技术人员已知的各种方法和递送系统中的任一者以物理方式向受试者引入剂。用于本文所公开的制剂的示例性施用途径包括静脉内、肌肉内、皮下、腹膜内、经脊柱或其他胃肠外施用途径，例如通过注射或输注。如本文所用的短语“胃肠外施用”意指除经肠和局部施用外的施用模式，通常通过注射进行，并且包括但不限于静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、淋巴管内、病灶内、囊内、眶内、心内、真皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注以及体内电穿孔。在一些实施方案中，经由非胃肠外途径(例如经口)施用制剂。其他非胃肠外途径包括经局部、经表皮或经粘膜施用途径，例如鼻内、经阴道、经直肠、舌下或经局部施用。还可例如一次、多次和/或在一个或多个延长的时间段内进行施用。
[0071]
如本文所用，术语“t细胞受体”(tcr)是指能够特异性地与靶抗原相互作用的异质细胞表面受体。如本文所用，“tcr”包括但不限于天然存在和非天然存在的tcr；全长tcr及其抗原结合部分；嵌合tcr；tcr融合构建体；以及合成tcr。在人中，tcr在t细胞的表面上表达，并且其负责t细胞识别和抗原呈递细胞的靶向。抗原呈递细胞(apc)展示外来蛋白(抗原)与主要组织相容性复合物(mhc；本文中也称为与hla分子，例如hla 1类分子复合)复合的片段。tcr识别且结合于抗原:hla复合物，并且募集cd3(由t细胞表达)，从而活化tcr。活化的tcr起始下游信号传导和免疫应答，包括epc的破坏。
[0072]
一般而言，tcr可包含通过二硫键相互连接的两条链，α链和β链(或不太常见为γ
链和δ链)。每条链包含可变结构域(α链可变结构域和β链可变结构域)和恒定区(α链恒定区和β链恒定区)。可变结构域定位于细胞膜远端，并且可变结构域与抗原相互作用。恒定区定位于细胞膜近端。tcr还可包含跨膜区和短胞质尾部。如本文所用，术语“恒定区”涵盖跨膜区和胞质尾部(当存在时)以及传统“恒定区”。
[0073]
可变结构域可进一步细分成散布有更保守的称为框架区(fr)的区域的具有高可变性的区域，称为互补决定区(cdr)。各α链可变结构域和β链可变结构域包含三个cdr和四个fr：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4。各可变结构域含有与抗原相互作用的结合结构域。虽然各链上的所有三个cdr都参与抗原结合，但据信cdr3为主要抗原结合区。cdr1也与抗原相互作用，而cd2据信主要识别hla复合物。
[0074]
在未明确陈述的情况下，并且除非上下文另外指示，否则术语“tcr”还包括本文所公开的任何tcr的抗原结合片段或抗原结合部分，并且包括单价和二价片段或部分，和单链tcr。术语“tcr”不限于结合于t细胞表面的天然存在的tcr。如本文所用，术语“tcr”进一步指本文所描述的在除t细胞外的细胞(例如如本文所描述天然表达或经修饰以表达cd3的细胞)表面上表达的tcr，或本文所描述的不含细胞膜的tcr(例如经分离的tcr或可溶性tcr)。
[0075]“抗原结合分子”、“tcr的部分”或“tcr片段”是指tcr的小于整体的任何部分。抗原结合分子可包括抗原互补决定区(cdr)。
[0076]“抗原”是指引起免疫应答或能够由tcr结合的任何分子，例如肽。如本文所用，“表位”是指多肽中引起免疫应答或能够由tcr结合的部分。免疫应答可涉及抗体产生或特异性免疫活性细胞的活化或两者。本领域技术人员将容易理解，包括实际上所有蛋白质或肽的任何大分子均可充当抗原。抗原和/或表位可内源性表达，即由基因组dna表达，或者可重组表达。抗原和/或表位可对某一组织(诸如癌细胞)具有特异性，或者其可广泛表达。此外，较大分子的片段可充当抗原。在一个实施方案中，抗原为肿瘤抗原。表位可存在于较长多肽中(例如蛋白质中)，或者表位可作为较长多肽的片段而存在。在一些实施方案中，表位与主要组织相容性复合物(mhc；本文中也称为与hla分子，例如hla 1类分子复合)复合。
[0077]
如本文所用，“gp100”、“糖蛋白100”、“黑素细胞蛋白pmel”或“me20m”是指在例如黑素瘤中具有表达的肿瘤抗原。gp100为分子量为70kd的661个氨基酸的疏水性糖蛋白(genbank登录号_nm_006928)。参见例如eisenberg等人,cell imunol.266(1):98
‑
103(2010)。在体内，gp100参与黑素体从i期至ii期的成熟。如本文所用，gp100不仅指全长规范序列，而且指其变体和片段。gp100的已知变体提供于www.uniprot.org(uniprotkb
‑
p40967；最后访问日期2019年3月1日)。
[0078]
表1.gp100氨基酸序列
[0079][0080]
如本文所用，术语“hla”是指人白细胞抗原。hla基因编码人中的主要组织相容性复合物(mhc)蛋白。mhc蛋白在细胞表面上表达，并且参与免疫应答的活化。hla i类基因编码mhc i类分子，其以与自身或非自身蛋白的肽片段(抗原)的复合物形式在细胞表面上表达。表达tcr和cd3的t细胞识别抗原:mhc i类复合物且起始免疫应答以靶向和破坏展示非自身蛋白的抗原呈递细胞。
[0081]
如本文所用，“hla i类分子”或“hla i类分子”是指编码mhc i类分子的野生型或变体hla i类基因的蛋白质产物。因此，“hla i类分子”和“mhc i类分子”在本文中可互换使用。
[0082]
mhc i类分子包含两条蛋白质链：α链和β2
‑
微球蛋白(β2m)链。人β2m由b2m基因编码。β2m的氨基酸序列阐述于seq id no:16中(表2)。mhc i类分子的α链由hla基因复合体编码。hla复合物定位于人染色体6的短臂上的6p21.3区域内且含有具有多种功能的超过220种基因。hla基因为高度变异的，具有超过20,000种hla等位基因和相关等位基因，包括超过15,000种本领域中已知的hla i类等位基因，其编码数千种hla蛋白质，包括超过10,000种hla i类蛋白质(参见例如hla.alleles.org，最后访问日期2019年2月27日)。hla复合物中存在至少三种编码mhc i类α链蛋白质的基因：hla
‑
a、hla
‑
b和hla
‑
c。此外，hla
‑
e、hla
‑
f和hla
‑
g编码与mhc i类分子缔合的蛋白质。
[0083]
表2.人β2m的氨基酸序列
[0084][0085]
术语“自体”是指任何材料源自与随后再引入所述任何材料的个体相同的个体。举例而言，自体t细胞疗法包括向受试者施用从同一受试者分离的t细胞。术语“同种异体”是指任何材料源自一个个体且接着引入相同物种的另一个体。举例而言，同种异体t细胞移植包括向受试者施用从除所述受试者外的供体获得的t细胞。
[0086]“癌症”是指大量以体内异常细胞生长不受控制为特征的各种疾病。无序细胞分裂和生长导致形成恶性肿瘤，所述恶性肿瘤侵入相邻组织且还可通过淋巴系统或血流转移至身体远程部分。“癌症”或“癌症组织”可包括肿瘤。可通过本发明的方法治疗的癌症的实例包括但不限于免疫系统的癌症，包括淋巴瘤、白血病和其他白细胞恶性肿瘤。在一些实施方案中，本发明的方法可用于减小肿瘤的肿瘤大小，所述肿瘤源自例如骨癌、肾癌、前列腺癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌、皮肤或眼内恶性黑素瘤、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、皮肤或眼内恶性黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛门区癌症、胃癌、睪丸癌、子宫癌、输卵管癌瘤、子宫内膜癌瘤、子宫颈癌瘤、阴道癌瘤、外阴癌瘤、霍奇金氏病、非霍奇金氏淋巴瘤(nhl)、原发性纵隔大b细胞淋巴瘤(pmbc)、弥漫性大b细胞淋巴瘤(dlbcl)、滤泡性淋巴瘤(fl)、转化的滤泡性淋巴瘤、脾边缘区淋巴瘤(smzl)、食管癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、慢性或急性白血病、急性骨髓性白血病(aml)、慢性骨髓性白血病、急性成淋巴细胞性白血病(all)(包括非t细胞all)、慢性淋巴细胞性白血病(cll)、儿童期实体肿瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾脏或输尿管癌、肾盂癌瘤、中枢神经系统(cns)赘瘤、原发性cns淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊柱轴肿瘤、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西氏肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、t细胞淋巴瘤、环境诱发的癌症(包括由石棉诱发的那些癌症)、其他b细胞恶性肿瘤和所述癌症的组合。特定癌症可对化学疗法或放射疗法有反应或癌症可为难治性的。难治性癌症是指不适合手术干预的癌症，并且所述癌症最初对化学疗法或放射疗法无反应或所述癌症随时间推移变得无反应。
[0087]
如本文所用，“抗肿瘤效应”是指可以以下形式存在的生物效应：肿瘤体积减小、肿瘤细胞数目减少、肿瘤细胞增殖减少、转移数目减少、总体存活或无进展存活增加、预期寿命增加或与肿瘤相关的各种生理症状改善。抗肿瘤效应还可指预防肿瘤发生，例如疫苗。
[0088]
术语“无进展存活”可缩写为pfs，其如本文所用是指从治疗日至根据经修订的恶性淋巴瘤iwg反应准则(iwg response criteria for malignant lymphoma)的疾病进展或因任何原因而死亡的日期的时间。
[0089]“疾病进展”或“进行性疾病”可缩写为pd，其如本文所用是指与特定疾病相关的一种或多种症状的恶化。举例而言，罹患癌症的受试者的疾病进展可包括一处或多处恶性病变的数目或大小增加、肿瘤转移和死亡。
[0090]“反应持续时间”可缩写为dor，其如本文所用是指受试者首次客观应答至根据经修订的恶性淋巴瘤iwg反应准则确认疾病进展或死亡的日期之间的时间段。
[0091]
术语“总体存活”可缩写为os，其定义为从治疗日至死亡日的时间。
[0092]
如本文所用，“细胞因子”是指一种细胞响应于与特异性抗原接触而释放的非抗体蛋白质，其中细胞因子与第二细胞相互作用以介导第二细胞中的应答。细胞因子可由细胞内源性表达或向受试者施用。细胞因子可由包括巨噬细胞、b细胞、t细胞和肥大细胞的免疫细胞释放以传播免疫应答。细胞因子可在受体细胞中诱导各种应答。细胞因子可包括稳态性细胞因子、趋化因子、促炎性细胞因子、效应子和急性期蛋白。举例而言，包括白细胞介素(il)7和il
‑
15的稳态性细胞因子促进免疫细胞存活和增殖，并且促炎性细胞因子可促进炎症应答。稳态性细胞因子的实例包括但不限于il
‑
2、il
‑
4、il
‑
5、il
‑
7、il
‑
10、il
‑
12p40、il
‑
12p70、il
‑
15和干扰素(ifn)γ。促炎性细胞因子的实例包括但不限于il
‑
1a、il
‑
1b、il
‑
6、il
‑
13、il
‑
17a、肿瘤坏死因子(tnf)
‑
α、tnf
‑
β、成纤维细胞生长因子(fgf)2、粒细胞巨噬细
胞集落刺激因子(gm
‑
csf)、可溶性细胞间粘附分子1(sicam
‑
1)、可溶性血管粘附分子1(svcam
‑
1)、血管内皮生长因子(vegf)、vegf
‑
c、vegf
‑
d和胎盘生长因子(plgf)。效应子的实例包括但不限于颗粒酶a、颗粒酶b、可溶性fas配体(sfasl)和穿孔素。急性期蛋白的实例包括但不限于c
‑
反应蛋白(crp)和血清淀粉样蛋白a(saa)。
[0093]“趋化因子”为一类介导细胞趋化性或定向运动的细胞因子。趋化因子的实例包括但不限于il
‑
8、il
‑
16、嗜酸性粒细胞趋化因子(eotaxin)、嗜酸性粒细胞趋化因子
‑
3、巨噬细胞来源的趋化因子(mdc或ccl22)、单核细胞趋化蛋白1(mcp
‑
1或ccl2)、mcp
‑
4、巨噬细胞炎性蛋白1α(mip
‑
1α、mip
‑
1a)、mip
‑
1β(mip
‑
1b)、γ
‑
诱导蛋白10(ip
‑
10)以及胸腺和活化调控趋化因子(tarc或ccl17)。
[0094]
本发明的分析物和细胞因子的其他实例包括但不限于趋化因子(c
‑
c基序)配体(ccl)1、ccl5、单核细胞特异性趋化因子3(mcp3或ccl7)、单核细胞趋化蛋白2(mcp
‑
2或ccl8)、ccl13、il
‑
1、il
‑
3、il
‑
9、il
‑
11、il
‑
12、il
‑
14、il
‑
17、il
‑
20、il
‑
21、粒细胞集落刺激因子(g
‑
csf)、白血病抑制因子(lif)、制瘤素m(osm)、cd154、淋巴细胞毒素(lt)β、4
‑
1bb配体(4
‑
1bbl)、增殖诱导配体(april)、cd70、cd153、cd178、糖皮质激素诱导的tnfr相关配体(gitrl)、肿瘤坏死因子超家族成员14(tnfsf14)、ox40l、tnf相关和apol相关的白细胞表达的配体1(tall
‑
1)或tnf相关凋亡诱导配体(trail)。
[0095]
药物或治疗剂的“治疗有效量”、“有效剂量”、“有效量”或“治疗有效剂量”为药物在单独或与另一治疗剂组合使用时防止受试者疾病发作或促进由疾病症状严重程度降低、疾病无症状期频率和持续时间增加或防止因疾病折磨而引起损伤或残疾证实的疾病消退的任何量。治疗剂促进疾病消退的能力可使用熟练从业者已知的多种方法来评估，诸如在临床试验期间在人受试者中、在预示在人中的功效的动物模型系统中或通过测定剂在体外测定中的活性。
[0096]
如本文所用的术语“淋巴细胞”包括自然杀伤(nk)细胞、t细胞或b细胞。nk细胞为一类代表固有免疫系统的主要组分的细胞毒性(cytotoxic/cell toxic)淋巴细胞。nk细胞排斥肿瘤和由病毒感染的细胞。其通过凋亡或程序性细胞死亡的过程工作。其被称为“自然杀伤”，因为其不需要进行活化来杀死细胞。t细胞在细胞介导的免疫性(不涉及抗体)中发挥主要作用。t细胞受体(tcr)区分t细胞与其他淋巴细胞类型。免疫系统的特化器官胸腺主要负责t细胞的成熟。存在六种类型的t细胞，即：辅助t细胞(例如cd4 细胞)、细胞毒性t细胞(也称为tc、细胞毒性t淋巴细胞、ctl、t
‑
杀伤细胞、细胞溶解性t细胞、cd8 t细胞或杀伤t细胞)、记忆t细胞((i)干细胞样记忆t
scm
细胞(如初始细胞)为cd45ro
‑
、ccr7 、cd45ra 、cd62l (l
‑
选择素)、cd27 、cd28 和il
‑
7rα ，但其也表达大量cd95、il
‑
2rβ、cxcr3和lfa
‑
1，并且显示记忆细胞的许多特有功能特征)；(ii)中心记忆t
cm
细胞表达l
‑
选择素和ccr7，其分泌il
‑
2，但不分泌ifnγ或il
‑
4，并且(iii)然而，效应记忆t
em
细胞不表达l
‑
选择素或ccr7，但产生效应子细胞因子，如ifnγ和il
‑
4)、调控t细胞(treg、抑制t细胞或cd4 cd25 调控t细胞)、自然杀伤t细胞(nkt)和γδt细胞。另一方面，b细胞在体液免疫性(涉及抗体)中发挥主要作用。b细胞产生抗体和抗原且发挥抗原呈递细胞(apc)的作用且在通过抗原相互作用活化之后变成记忆b细胞。在哺乳动物中，在衍生出b细胞名称的骨髓中形成不成熟b细胞。
[0097]
术语“遗传工程改造”或“工程改造”是指对细胞的基因组进行修饰的方法，包括但不限于缺失编码或非编码区或其一部分或插入编码区或其一部分。在一些实施方案中，所
修饰的细胞为淋巴细胞，例如t细胞或表达cd3的经修饰细胞，其可获自患者或供体。细胞可经修饰以表达并入细胞基因组中的外源性构建体，诸如本文所公开的t细胞受体(tcr)。在一些实施方案中，细胞经修饰以表达cd3。
[0098]“免疫应答”是指免疫系统的细胞(例如t淋巴细胞、b淋巴细胞、自然杀伤(nk)细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、树突细胞和嗜中性粒细胞)和由这些细胞中的任一者或肝脏产生的可溶性大分子(包括ab、细胞因子和补体)的动作，所述动作引起脊椎动物体内的侵入病原体、病原体感染的细胞或组织、癌细胞或其他异常细胞或者自体免疫或病理炎症情况下的正常人细胞或组织的选择性靶向、结合、损坏、破坏和/或消除。
[0099]
术语“免疫疗法”是指通过包括诱导、增强、抑制或以其他方式改变免疫应答的方法治疗罹患疾病或处于感染疾病或遭受疾病复发的风险中的受试者。免疫疗法的实例包括但不限于t细胞疗法。t细胞疗法可包括过继t细胞疗法、肿瘤浸润淋巴细胞(til)免疫疗法、自体细胞疗法、工程改造的自体细胞疗法(eact)和同种异体t细胞移植。
[0100]
用于本文所描述的免疫疗法中的细胞可来自本领域中已知的任何来源。举例而言，t细胞可在体外与造血干细胞群体区分开，或t细胞可获自受试者。t细胞可获自例如外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸膜渗出液、脾脏组织和肿瘤。此外，t细胞可源自本领域中可获得的一个或多个t细胞系。t细胞还可获自使用熟练技术人员已知的诸如ficoll
tm
分离和/或单采血液成分术(apheresis)的任何数目的技术从受试者收集的一单位血液。分离用于t细胞疗法的t细胞的其他方法公开于美国专利公布号2013/0287748中，所述专利公布以引用的方式整体并入本文中。免疫疗法还可包括向受试者施用经修饰的细胞，其中经修饰的细胞表达cd3和本文所公开的tcr。在一些实施方案中，经修饰的细胞不为t细胞。
[0101]
如本文所用的“患者”包括罹患癌症(例如淋巴瘤或白血病)的任何人。术语“受试者”和“患者”在本文中可互换使用。
[0102]
术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可互换使用，并且是指包含通过肽键共价键联的氨基酸残基的化合物。蛋白质或肽一定含有至少两个氨基酸，并且对可包含蛋白质或肽的序列的最大氨基酸数目没有限制。多肽包括包含通过肽键彼此连接的两个或更多个氨基酸的任何肽或蛋白质。如本文所用，所述术语是指短链，其在本领域中通常还称为例如肽、寡肽和寡聚物；与较长链，其在本领域中通常称为蛋白质，蛋白质存在许多类型。“多肽”包括例如生物活性片段、实质上同源的多肽、寡肽、同二聚体、异二聚体、多肽变体、经修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等。多肽包括天然肽、重组肽、合成肽或其组合。
[0103]
如本文所用，“刺激”是指由刺激分子与其同源配体结合诱导的主要应答，其中所述结合介导信号转导事件。“刺激分子”为t细胞上与存在于抗原呈递细胞上的同源刺激配体特异性结合的分子，例如t细胞受体(tcr)/cd3复合物。“刺激配体”为当存在于抗原呈递细胞(例如aapc、树突细胞、b细胞和类似细胞)上时可与t细胞上的刺激分子特异性结合，由此介导由t细胞引起的主要应答，包括但不限于活化、起始免疫应答、增殖和类似反应的配体。刺激配体包括但不限于负载有肽的mhc i类分子、抗cd3抗体、超激动剂抗cd28抗体和超激动剂抗cd2抗体。
[0104]
术语“处理”和“预处理”在本文中可互换使用且指示准备需要t细胞疗法的患者用于适合的情况。如本文所用的处理包括但不限于在t细胞疗法之前降低内源性淋巴细胞数
目、移除细胞因子池(cytokine sink)、增加一个或多个稳态性细胞因子或促炎性因子的血清含量、增强处理后施用的t细胞的效应功能、增强抗原呈递细胞活化和/或可获得性或其任何组合。在一个实施方案中，“处理”包括增加一种或多种细胞因子，例如白细胞介素7(il
‑
7)、白细胞介素15(il
‑
15)、白细胞介素10(il
‑
10)、白细胞介素5(il
‑
5)、γ
‑
诱导蛋白10(ip
‑
10)、白细胞介素8(il
‑
8)、单核细胞趋化蛋白1(mcp
‑
1)、胎盘生长因子(plgf)、c
‑
反应蛋白(crp)、可溶性细胞间粘附分子1(sicam
‑
1)、可溶性血管粘附分子1(svcam
‑
1)或其任何组合的血清含量。在另一实施方案中，“处理”包括增加il
‑
7、il
‑
15、ip
‑
10、mcp
‑
1、plgf、crp或其任何组合的血清含量。
[0105]
受试者的
“”
治疗(treatment/treating)是指对受试者进行的任何类型的干预或处理或向受试者施用活性剂，目的为逆转、缓解、改善、抑制、减慢或预防与疾病相关的症状、并发症或疾患或生物化学标志的发作、进展、发展、严重程度或复发。在一个实施方案中，“治疗(treatment/treating)”包括部份缓解。在另一实施方案中，“治疗(treatment/treating)”包括完全缓解。
[0106]
替代(例如“或”)的使用应理解为意指替代物中的一者、两者或其任何组合。如本文所用，不定冠词
“”
一个/种应理解为指任何所叙述或列举的组分中的“一个/种或多个/种”。
[0107]
术语“约”或“基本上包含”是指特定值或组合物的如由一般技术人员所确定在可接受误差范围内的值或组合物，其将部分取决于如何测量或测定所述值或组合物，即，测量系统的限制。举例而言，“约”或“基本上包含”可意指根据本领域中的惯例在1个或超过1个标准偏差以内。或者，“约”或“基本上包含”可意指至多10％的范围(即，
±
10％)。举例而言，约3mg可包括2.7mg与3.3mg(对于10％)之间的任何数字。此外，特定而言就生物系统或方法而言，所述术语可意指至多一个数量级或值的至多5倍。当本技术和权利要求书中提供特定值或组合物时，除非另外说明，否则“约”或“基本上包含”的含义应被假定为在所述特定值或组合物的可接受误差范围内。
[0108]
除非另外指出，否则如本文所描述，任何浓度范围、百分比范围、比率范围或整数范围应理解为包括在所叙述范围内的任何整数值和(适当时)其分数(诸如整数的十分的一和百分的一)。
[0109]
以下小节中更详细描述本发明的各种方面。
[0110]
ii.本公开的组合物
[0111]
本公开涉及特异性地结合于gp100上的表位的t细胞受体(tcr)或其抗原结合部分、编码所述tcr的核酸分子和包含所述tcr或所述核酸分子的细胞。本发明的一些方面涉及治疗有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含本文所描述的tcr的细胞。本公开的其他方面涉及一种结合于tcr的gp100的表位，和与包含gp100的表位的肽复合的hla i类分子。
[0112]
t细胞受体或tcr为存在于t细胞或t淋巴细胞表面上的分子，其负责识别作为结合于主要组织相容性复合物(mhc)分子的肽的抗原的片段。tcr与抗原肽之间的结合具有相对低的亲和力且为简并的：换言之，许多tcr识别相同抗原肽且许多抗原肽由相同tcr识别。
[0113]
tcr由两条不同的蛋白质链组成(换言之，其为异二聚体)。在人中，在95％的t细胞中，tcr由α(α)链和β(β)链(分别由tra和trb编码)组成，但在5％的t细胞中，tcr由γ和δ
(γ/δ)链(分别由trg和trd编码)组成。此比率在个体发生期间和患病状态(诸如白血病)中发生变化。其在物种间也不同。在各种物种中已定位4个基因座的直系同源物。各基因座可产生具有恒定区和可变区的多种多肽。
[0114]
当tcr与抗原肽和mhc(肽/mhc)接合时，t淋巴细胞通过信号转导活化，信号转导为由相关酶、共
‑
受体、特化衔接分子和活化或释放的转录因子介导的一系列生物化学事件。
[0115]
ii.a.核酸分子
[0116]
本公开的某些方面涉及核酸分子，所述核酸分子包含(i)第一核苷酸序列，所述第一核苷酸序列编码特异性地结合人gp100的重组tcr或其抗原结合部分(“抗gp100 tcr”)；和(ii)第二核苷酸序列，其中所述第二核苷酸序列或由所述第二核苷酸序列编码的多肽抑制内源性tcr的表达。在一些实施方案中，第二核苷酸序列为非天然存在的序列。在其他实施方案中，第二核苷酸序列为合成的。在其他实施方案中，第二核苷酸序列包含靶向编码内源性tcr的核苷酸序列的序列。在一些实施方案中，抗gp100 tcr与参考tcr交叉竞争结合于人gp100。在一些实施方案中，抗gp100 tcr与参考tcr结合人gp100的相同表位或重叠表位。
[0117]
在一些实施方案中，参考tcr包含α链和β链；其中所述α链包含互补决定区1(cdr1)、cdr2和cdr3；其中所述β链包含cdr1、cdr2和cdr3；并且其中所述参考tcr包含seq id no:7中所列的α链cdr3和seq id no:10中所列的β链cdr3。在一些实施方案中，α链cdr1、cdr2和cdr3序列存在于seq id no:1中所列的氨基酸序列中，并且参考tcr包含seq id no:2中所列的氨基酸序列中存在的β链cdr1、cdr2和cdr3序列。在一些实施方案中，参考tcr包含α链和β链，其中所述α链包含如seq id no:1中所列的氨基酸序列且所述β链包含如seq id no:2中所列的氨基酸序列。
[0118]
表3.α链和β链tcr序列
[0119]
[0120][0121]
ii.a.1.由第一核苷酸序列编码的tcr
[0122]
本公开涉及一种由本文所描述的第一核苷酸序列编码的tcr。在一些实施方案中，由第一核苷酸序列编码的抗gp100 tcr包含α链和β链，其中所述α链包含含有α链cdr1、α链cdr2和α链cdr3的可变结构域；并且其中所述β链包含含有β链cdr1、β链cdr2和β链cdr3的可变结构域。在一些实施方案中，抗gp100 tcr包含含有如seq id no:7(caegdtgrraltf)中所列的氨基酸序列的α链cdr3。在一些实施方案中，抗gp100 tcr包含含有如seq id no:10(casspgasyeqyf)中所列的氨基酸序列的β链cdr3。在一些实施方案中，α链和/或β链中的非cdr区进一步经修饰，例如一个氨基酸、两个氨基酸、三个氨基酸、四个氨基酸、五个氨基酸或六个氨基酸的取代或突变，由此α链和/或β链不为天然存在的。在一些实施方案中，取代或突变可以各种方式改进本文所描述的tcr，例如结合亲和力、结合特异性、稳定性、粘度或
其任何组合。
[0123]
在一些实施方案中，由第一核苷酸序列编码的抗gp100 tcr包含α链cdr1，其中抗gp100 tcr的α链cdr1包含如seq id no:5(dsssty)中所列的氨基酸序列。在一些实施方案中，由第一核苷酸序列编码的抗gp100 tcr包含β链cdr1，其中抗gp100 tcr的β链cdr1包含如seq id no:8(ifsnmdm)中所列的氨基酸序列。
[0124]
在一些实施方案中，由第一核苷酸序列编码的抗gp100 tcr包含α链cdr2，其中抗gp100 tcr的α链cdr2包含如seq id no:6(mghra)中所列的氨基酸序列。在一些实施方案中，由第一核苷酸序列编码的抗gp100 tcr包含β链cdr2，其中抗gp100 tcr的β链cdr2包含如seq id no:9(ysyekl)中所列的氨基酸序列。
[0125]
在一些实施方案中，由第一核苷酸序列编码的抗gp100 tcr包含与seq id no:1中所列的α链氨基酸序列的可变结构域具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的α链可变结构域。在一些实施方案中，由第一核苷酸序列编码的抗gp100tcr包含与seq id no:1中所列的α链氨基酸序列的可变结构域具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的α链可变结构域，其中抗gp100 tcr包含含有如seq id no:7中所列的氨基酸序列的α链cdr3。在一些实施方案中，由第一核苷酸序列编码的抗gp100 tcr包含seq id no:1中所列的α链氨基酸序列中存在的α链可变结构域。
[0126]
在一些实施方案中，由第一核苷酸序列编码的抗gp100 tcr包含与seq id no:2中所列的β链氨基酸序列的可变结构域具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的β链可变结构域。在一些实施方案中，由第一核苷酸序列编码的抗gp100tcr包含与seq id no:2中所列的β链氨基酸序列的可变结构域具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的β链可变结构域，其中抗gp100 tcr包含含有如seq id no:10中所列的氨基酸序列的β链cdr3。在一些实施方案中，由第一核苷酸序列编码的抗gp100 tcr包含seq id no:2中所列的氨基酸序列中存在的β链可变结构域。
[0127]
在一些实施方案中，由第一核苷酸编码的抗gp100 tcr还包含α链恒定区、β链恒定区或α链恒定区与β链恒定区两者。在一些实施方案中，由第一核苷酸序列编码的抗gp100 tcr包含与seq id no:1中所列的α链氨基酸序列的恒定区具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的α链恒定区。在一些实施方案中，由第一核苷酸序列编码的抗gp100 tcr包含与seq id no:1中所列的α链氨基酸序列的恒定区具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的α链恒定区，其中抗gp100 tcr包含含有如seq id no:7中所列的氨基酸序列的α链cdr3。在一些实施方案中，由第一核苷酸序列编码的抗gp100 tcr包含seq id no:1中所列的α链氨基酸序列中存在的α链恒定区。在一些实施方案中，由第一核苷酸编码的抗gp100 tcr还包含不同于α链的内源性(例如天然存在的)恒定区的α恒定区。在一些实施方案中，α链恒定区包含相对于seq id no:1中所列的α链氨基酸序列的恒定区的氨基酸序列包含至少1个、至少2个、至少3个、至少
4个或至少5个氨基酸取代的氨基酸序列。
[0128]
在一些实施方案中，由第一核苷酸序列编码的抗gp100 tcr包含与seq id no:2中所列的β链氨基酸序列的恒定区具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的β链恒定区。在一些实施方案中，由第一核苷酸序列编码的抗gp100 tcr包含与seq id no:2中所列的β链氨基酸序列的恒定区具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的β链恒定区，其中所述抗gp100 tcr包含含有如seq id no:10中所列的氨基酸序列的β链cdr3。在一些实施方案中，由第一核苷酸序列编码的抗gp100 tcr包含seq id no:2中所列的氨基酸序列中存在的β链恒定区。在一些实施方案中，由第一核苷酸编码的抗gp100 tcr还包含不同于β链的内源性(例如天然存在的)恒定区的β恒定区。在一些实施方案中，β链恒定区包含相对于seq id no:2中所列的β链氨基酸序列的恒定区的氨基酸序列包含至少1个、至少2个、至少3个、至少4个或至少5个氨基酸取代的氨基酸序列。
[0129]
在某些实施方案中，由第一核苷酸序列编码的抗gp100 tcr包含与seq id no:1中所列的α链氨基酸序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的α链。在一些实施方案中，由第一核苷酸序列编码的抗gp100 tcr包含与seq id no:1中所列的α链氨基酸序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的α链，其中抗gp100 tcr包含含有如seq id no:7中所列的氨基酸序列的α链cdr3。在一些实施方案中，由第一核苷酸序列编码的抗gp100 tcr包含含有seq id no:1中所列的氨基酸序列的α链。
[0130]
在某些实施方案中，由第一核苷酸序列编码的抗gp100 tcr包含与seq id no:2中所列的β链氨基酸序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的β链。在一些实施方案中，由第一核苷酸序列编码的抗gp100 tcr包含与seq id no:2中所列的β链氨基酸序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的β链，其中抗gp100 tcr包含含有如seq id no:10中所列的氨基酸序列的β链cdr3。在一些实施方案中，由第一核苷酸序列编码的抗gp100 tcr包含含有seq id no:2中所列的氨基酸序列的β链。
[0131]
在一些实施方案中，由第一核苷酸序列编码的抗gp100 tcr包含α链恒定区、β链恒定区或两者；并且其中α链恒定区、β链恒定区或两者包含相对于内源性tcr的对应氨基酸序列在靶序列内具有至少1个、至少2个、至少3个、至少4个或至少5个取代的氨基酸序列。
[0132]
ii.a.2.表位
[0133]
在一些实施方案中，由第一核苷酸序列编码的抗gp100 tcr与参考tcr结合相同表位。在一些实施方案中，抗gp100 tcr结合于gp100的包含seq id no:13(esitgslgpll)中所列的氨基酸序列的表位。在一些实施方案中，抗gp100 tcr结合于gp100的由如seq id no:13中所列的氨基酸序列组成的表位。在一些实施方案中，表位由gp100的氨基酸残基448
‑
458(seq id no:52)组成，例如“gp100
448
‑
458”。
[0134]
在某些实施方案中，表位与hla i类分子复合。人白细胞抗原(hla)系统(人中的主
要组织相容性复合物[mhc])为免疫系统的重要部分且受定位于染色体6上的基因控制。其编码经特化以将抗原肽呈递至t细胞上的t细胞受体(tcr)的细胞表面分子。(还参见overview of the immune system。)呈递抗原(ag)的mhc分子分为2个主要类别：i类mhc分子和ii类mhc分子。
[0135]
i类mhc分子以跨膜糖蛋白形式存在于所有有核细胞的表面。完整i类分子由结合于β
‑
2微球蛋白分子的α重链组成。重链由2个肽结合结构域、ig样结构域和具有胞质尾部的跨膜区组成。i类分子的重链由hla
‑
a、hla
‑
b和hla
‑
c基因座处的基因编码。表达cd8分子的t细胞与i类mhc分子反应。这些淋巴细胞常常具有细胞毒性功能，从而需要其能够识别任何感染的细胞。因为每个有核细胞均表达i类mhc分子，所以所有感染的细胞均可充当cd8 t细胞的抗原呈递细胞(cd8结合于i类重链的非多态部分)。一些i类mhc基因编码非经典mhc分子，诸如hla
‑
g(其可在保护胎儿不受母体免疫应答影响中起作用)和hla
‑
e(其将肽呈递至自然杀伤[nk]细胞上的某些受体)。
[0136]
在一些实施方案中，hla 1类分子选自hla
‑
a、hla
‑
b和hla
‑
c等位基因。在一些实施方案中，hla 1类分子选自hla
‑
e、hla
‑
f和hla
‑
g等位基因。在某些实施方案中，hla 1类分子为hla
‑
a等位基因。在某些实施方案中，hla 1类分子为hla
‑
b等位基因。在某些实施方案中，hla 1类分子为hla
‑
c等位基因。
[0137]
许多hla
‑
a、hla
‑
b和hla
‑
c等位基因为本领域中已知的，并且已知等位基因中的任一者均可用于本公开中。hla等位基因的更新列表可在hla.alleles.org/(最后访问日期2019年2月27日)获得。在一些实施方案中，hla 1类分子为选自以下的hla
‑
b等位基因：hla
‑
b*07、hla
‑
b*08、hla
‑
b*13、hla
‑
b*14、hla
‑
b*15、hla
‑
b*18、hla
‑
b*27、hla
‑
b*35、hla
‑
b*37、hla
‑
b*38、hla
‑
b*39、hla
‑
b*40、hla
‑
b*41、hla
‑
b*42、hla
‑
b*44、hla
‑
b*45、hla
‑
b*46、hla
‑
b*47、hla
‑
b*48、hla
‑
b*49、hla
‑
b*50、hla
‑
b*51、hla
‑
b*52、hla
‑
b*53、hla
‑
b*54、hla
‑
b*55、hla
‑
b*56、hla
‑
b*57、hla
‑
b*58、hla
‑
b*59、hla
‑
b*67、hla
‑
b*73、hla
‑
b*78、hla
‑
b*79、hla
‑
b*81、hla
‑
b*82和hla
‑
b*83。在某些实施方案中，hla
‑
b等位基因为hla
‑
b*40:01等位基因。在某些实施方案中，hla
‑
b等位基因为hla
‑
b*40:02等位基因。在某些实施方案中，hla
‑
b等位基因为hla
‑
b*40:03等位基因。在某些实施方案中，hla
‑
b等位基因为hla
‑
b*40:04等位基因。在某些实施方案中，hla
‑
b等位基因为hla
‑
b*40:05等位基因。在某些实施方案中，hla
‑
b等位基因为hla
‑
b*40:06等位基因。
[0138]
在某些实施方案中，hla 1类分子为选自由以下组成的组的hl a
‑
b等位基因：hla
‑
b*40:01:01、hla
‑
b*40:01:02:01、hla
‑
b*40:01:02:02、hla
‑
b*40:01:02:03、hla
‑
b*40:01:02:04、hla
‑
b*40:01:02:05、hla
‑
b*40:01:02:06、hla
‑
b*40:01:02:07、hla
‑
b*40:01:02:08、hla
‑
b*40:01:02:09、hla
‑
b*40:01:03、hla
‑
b*40:01:04、hla
‑
b*40:01:05、hla
‑
b*40:01:06、hla
‑
b*40:01:07、hla
‑
b*40:01:08、hla
‑
b*40:01:09、hla
‑
b*40:01:10、hla
‑
b*40:01:11、hla
‑
b*40:01:12、hla
‑
b*40:01:13、hla
‑
b*40:01:14、hla
‑
b*40:01:15、hla
‑
b*40:01:16、hla
‑
b*40:01:17、hla
‑
b*40:01:18、hla
‑
b*40:01:19、hla
‑
b*40:01:20、hla
‑
b*40:01:21、hla
‑
b*40:01:22、hla
‑
b*40:01:23、hla
‑
b*40:01:24、hla
‑
b*40:01:25、hla
‑
b*40:01:26、hla
‑
b*40:01:27、hla
‑
b*40:01:28、hla
‑
b*40:01:29、hla
‑
b*40:01:30、hla
‑
b*40:01:31、hla
‑
b*40:01:32、hla
‑
b*40:01:33、hla
‑
b*40:01:34、hla
‑
b*40:01:35、hla
‑
b*40:01:36、hla
‑
b*40:01:37、hla
‑
b*40:01:38、hla
‑
b*40:01:39、hla
‑
b*40:01:40、hla
‑
b*40:
01:41、hla
‑
b*40:01:42、hla
‑
b*40:01:43、hla
‑
b*40:01:44、hla
‑
b*40:01:45、hla
‑
b*40:01:46、hla
‑
b*40:01:47、hla
‑
b*40:01:48、hla
‑
b*40:01:49、hla
‑
b*40:01:50、hla
‑
b*40:01:51、hla
‑
b*40:01:52、hla
‑
b*40:01:53、hla
‑
b*40:01:54、hla
‑
b*40:01:55、hla
‑
b*40:01:56、hla
‑
b*40:01:57、hla
‑
b*40:01:58、hla
‑
b*40:01:59和hla
‑
b*40:01:60。在一些实施方案中，hla 1类分子为选自由以下组成的组的hla
‑
b等位基因：hla
‑
b*40:02:01:01、hla
‑
b*40:02:01:02、hla
‑
b*40:02:01:03、hla
‑
b*40:02:01:04、hla
‑
b*40:02:01:05、hla
‑
b*40:02:01:06、hla
‑
b*40:02:01:07、hla
‑
b*40:02:01:08、hla
‑
b*40:02:02、hla
‑
b*40:02:03、hla
‑
b*40:02:04、hla
‑
b*40:02:05、hl a
‑
b*40:02:06、hla
‑
b*40:02:07、hla
‑
b*40:02:08、hla
‑
b*40:02:09、hla
‑
b*40:02:10、hla
‑
b*40:02:11、hla
‑
b*40:02:12、hla
‑
b*40:02:13、hla
‑
b*40:02:14、hla
‑
b*40:02:15、hla
‑
b*40:02:16、hl a
‑
b*40:02:17、hla
‑
b*40:02:18、hla
‑
b*40:02:19、hla
‑
b*40:02:20、hla
‑
b*40:02:21、hla
‑
b*40:02:22、hla
‑
b*40:02:23、hla
‑
b*40:02:24、hla
‑
b*40:02:25、hla
‑
b*40:02:26、hla
‑
b*40:03:01:01、hla
‑
b*40:03:01:02、hla
‑
b*40:04:01、hla
‑
b*40:04:02、hla
‑
b*40:05:01:01、hla
‑
b*40:05:01:02、hla
‑
b*40:06:01:01、hla
‑
b*40:06:01:02、hla
‑
b*40:06:02、hla
‑
b*40:06:03、hla
‑
b*40:06:04:01、hla
‑
b*40:06:04:02、hla
‑
b*40:06:05、hla
‑
b*40:06:06、hla
‑
b*40:06:07、hla
‑
b*40:06:08、hla
‑
b*40:06:09、hla
‑
b*40:06:10、hl a
‑
b*40:06:11、hla
‑
b*40:06:12、hla
‑
b*40:06:13、hla
‑
b*40:06:14、hla
‑
b*40:06:15、hla
‑
b*40:06:16、hla
‑
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‑
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‑
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‑
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‑
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‑
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‑
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‑
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‑
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‑
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‑
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‑
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‑
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‑
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‑
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‑
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‑
b*40:
199、hla
‑
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‑
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‑
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‑
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‑
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‑
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‑
b*40:206、hla
‑
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‑
b*40:208、hla
‑
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‑
b*40:20:01:01、hla
‑
b*40:20:01:02、hla
‑
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‑
b*40:210、hla
‑
b*40:211、hla
‑
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‑
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‑
b*40:214、hla
‑
b*40:215、hla
‑
b*40:216、hla
‑
b*40:217、hla
‑
b*40:218、hla
‑
b*40:219、hla
‑
b*40:220、hla
‑
b*40:221、hla
‑
b*40:222、hla
‑
b*40:223、hla
‑
b*40:224、hla
‑
b*40:225、hla
‑
b*40:226、hla
‑
b*40:227、hla
‑
b*40:228、hla
‑
b*40:229、hla
‑
b*40:22 57、hla
‑
b*40:23、hla
‑
b*40:230、hla
‑
b*40:231、hla
‑
b*40:232、hla
‑
b*40:233、hla
‑
b*40:234、hla
‑
b*40:235、hla
‑
b*40:236、hla
‑
b*40:237、hla
‑
b*40:238、hla
‑
b*40:239、hla
‑
b*40:24、hla
‑
b*40:240、hla
‑
b*40:241、hla
‑
b*40:242、hla
‑
b*40:243、hla
‑
b*40:244、hla
‑
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‑
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‑
b*40:247、hla
‑
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‑
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‑
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‑
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‑
b*40:251、hla
‑
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‑
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‑
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‑
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‑
b*40:256、hla
‑
b*40:257、hla
‑
b*40:258、hla
‑
b*40:259、hla
‑
b*40:26、hla
‑
b*40:260、hla
‑
b*40:261、hla
‑
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‑
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‑
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‑
b*40:265、hla
‑
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‑
b*40:267、hla
‑
b*40:268、hla
‑
b*40:269、hla
‑
b*40:270、hla
‑
b*40:271、hla
‑
b*40:272、hla
‑
b*40:273、hla
‑
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‑
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‑
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‑
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‑
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‑
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‑
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‑
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‑
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‑
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‑
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‑
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‑
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‑
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‑
b*40:285、hla
‑
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‑
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‑
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‑
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‑
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‑
b*40:290、hla
‑
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‑
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‑
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‑
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‑
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‑
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‑
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‑
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‑
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‑
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‑
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‑
b*40:300、hla
‑
b*40:301、hla
‑
b*40:302、hla
‑
b*40:303、hla
‑
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‑
b*40:305、hla
‑
b*40:306、hla
‑
b*40:307、hla
‑
b*40:308、hla
‑
b*40:309、hla
‑
b*40:31、hla
‑
b*40:310、hla
‑
b*40:311、hla
‑
b*40:312、hla
‑
b*40:313、hla
‑
b*40:314、hla
‑
b*40:315、hla
‑
b*40:316、hla
‑
b*40:317、hla
‑
b*40:318、hla
‑
b*40:319、hla
‑
b*40:32、hla
‑
b*40:320、hla
‑
b*40:321、hla
‑
b*40:322、hla
‑
b*40:323、hla
‑
b*40:324、hla
‑
b*40:325、hla
‑
b*40:326、hla
‑
b*40:327、hla
‑
b*40:328、hla
‑
b*40:329、hla
‑
b*40:33、hla
‑
b*40:330、hla
‑
b*40:331、hla
‑
b*40:332、hla
‑
b*40:333、hla
‑
b*40:334、hla
‑
b*40:335、hla
‑
b*40:336、hla
‑
b*40:337 98、hla
‑
b*40:338、hla
‑
b*40:339、hla
‑
b*40:34、hla
‑
b*40:340、hla
‑
b*40:341、hla
‑
b*40:342、hla
‑
b*40:343、hla
‑
b*40:344、hla
‑
b*40:345、hla
‑
b*40:346、hla
‑
b*40:347、hla
‑
b*40:348、hla
‑
b*40:349、hla
‑
b*40:350、hla
‑
b*40:351、hla
‑
b*40:352、hla
‑
b*40:353、hla
‑
b*40:354、hla
‑
b*40:355、hla
‑
b*40:356、hla
‑
b*40:357、hla
‑
b*40:358、hla
‑
b*40:359、hla
‑
b*40:35:01、hla
‑
b*40:35:02、hla
‑
b*40:36、hla
‑
b*40:360、hla
‑
b*40:361 86、hla
‑
b*40:362、hla
‑
b*40:363、hla
‑
b*40:364、hla
‑
b*40:365、hla
‑
b*40:366、hla
‑
b*40:367、hla
‑
b*40:368、hla
‑
b*40:369、hla
‑
b*40:37、hla
‑
b*40:370、hla
‑
b*40:371、hla
‑
b*40:372、hla
‑
b*40:373、hla
‑
b*40:374、hla
‑
b*40:375、hla
‑
b*40:376、hla
‑
b*40:377、hla
‑
b*40:378、hla
‑
b*40:379、hla
‑
b*40:38、hla
‑
b*40:380、hla
‑
b*40:381、hla
‑
b*40:382、hla
‑
b*40:383、hla
‑
b*40:384、hla
‑
b*40:385、hla
‑
b*40:386、hla
‑
b*40:387、hla
‑
b*40:388、hla
‑
b*40:389、hla
‑
b*40:39、hla
‑
b*40:390、hla
‑
b*40:391、hla
‑
b*40:392、hla
‑
b*40:393、hla
‑
b*40:394、hla
‑
b*40:395、hla
‑
b*40:396、hla
‑
b*40:397、hla
‑
b*40:398、hla
‑
b*40:399 57、hla
‑
b*40:40、hla
‑
b*
40:400、hla
‑
b*40:401、hla
‑
b*40:402、hla
‑
b*40:403、hla
‑
b*40:404、hla
‑
b*40:406、hla
‑
b*40:407、hla
‑
b*40:408、hla
‑
b*40:409、hla
‑
b*40:410、hla
‑
b*40:411、hla
‑
b*40:412、hla
‑
b*40:413、hla
‑
b*40:414、hla
‑
b*40:42、hla
‑
b*40:43、hla
‑
b*40:44、hla
‑
b*40:45、hla
‑
b*40:46、hla
‑
b*40:47、hla
‑
b*40:48、hla
‑
b*40:49、hla
‑
b*40:50、hla
‑
b*40:51、hla
‑
b*40:52、hla
‑
b*40:53、hla
‑
b*40:54、hla
‑
b*40:55、hla
‑
b*40:56、hla
‑
b*40:57、hla
‑
b*40:58、hla
‑
b*40:59、hla
‑
b*40:60、hla
‑
b*40:61、hla
‑
b*40:62、hla
‑
b*40:63、hla
‑
b*40:64:01:01、hla
‑
b*40:64:01:02、hla
‑
b*40:65、hla
‑
b*40:66、hla
‑
b*40:67、hla
‑
b*40:68、hla
‑
b*40:69、hla
‑
b*40:70:01、hla
‑
b*40:70:02、hla
‑
b*40:71、hla
‑
b*40:72:01、hla
‑
b*40:72:02、hla
‑
b*40:73、hla
‑
b*40:74、hla
‑
b*40:75、hla
‑
b*40:76、hla
‑
b*40:77、hla
‑
b*40:78、hla
‑
b*40:79、hla
‑
b*40:80、hla
‑
b*40:81、hla
‑
b*40:82、hla
‑
b*40:83、hla
‑
b*40:84、hla
‑
b*40:85、hla
‑
b*40:86、hla
‑
b*40:87:01、hla
‑
b*40:87:02、hla
‑
b*40:88、hla
‑
b*40:89、hla
‑
b*40:90、hla
‑
b*40:91、hla
‑
b*40:92、hla
‑
b*40:93、hla
‑
b*40:94、hla
‑
b*40:95、hla
‑
b*40:96、hla
‑
b*40:97、hla
‑
b*40:98和hla
‑
b*40:99。
[0139]
ii.a.3第二核苷酸序列
[0140]
本文所公开的核酸分子的第二核苷酸序列可为能够抑制内源性tcr的表达的任何序列或可编码能够抑制内源性tcr的表达的任何多肽。在一些实施方案中，第二核苷酸序列为一种或多种sirna。在一些实施方案中，一种或多种sirna与编码内源性tcr的恒定区的核苷酸序列内的靶序列互补。在某些实施方案中，一种或多种sirna与编码野生型人tcr的恒定区的核苷酸序列内的靶序列互补。在一些实施方案中，一种或多种sirna与编码野生型tcr的α链的恒定区的核苷酸序列内的靶序列互补。在一些实施方案中，一种或多种sirna与编码野生型tcr的β链的恒定区的核苷酸序列内的靶序列互补。在一些实施方案中，一种或多种sirna包含(i)与编码野生型tcr的α链的恒定区的核苷酸序列内的靶序列互补的一种或多种sirna和(ii)与编码野生型tcr的β链的恒定区的核苷酸序列内的靶序列互补的一种或多种sirna。
[0141]
在一些实施方案中，一种或多种sirna包含选自由seq id no:53
‑
56组成的组的核苷酸序列(表4)。在一些实施方案中，核酸分子的第二核苷酸序列编码一种或多种sirna，其中所述一种或多种sirna与编码野生型tcr的α链的恒定区的核苷酸序列内的靶序列互补，并且其中所述一种或多种sirna包含seq id no:53和54中所列的核酸序列。
[0142]
表4.sirna序列
[0143][0144][0145]
在一些实施方案中，核酸分子的第二核苷酸序列编码一种或多种sirna，其中所述一种或多种sirna与编码野生型tcr的β链的恒定区的核苷酸序列内的靶序列互补，并且其中所述一种或多种sirna包含seq id no:55和56中所列的核酸序列。在一些实施方案中，核
酸分子的第二核苷酸序列编码一种或多种sirna，其中所述一种或多种sirna包含(i)与编码野生型tcr的α链的恒定区的核苷酸序列内的靶序列互补的一种或多种sirna，其中所述一种或多种sirna包含seq id no:53和54中所列的核酸序列；和(ii)与编码野生型tcr的β链的恒定区的核苷酸序列内的靶序列互补的一种或多种sirna，其中所述一种或多种sirna包含seq id no:55和56中所列的核酸序列。
[0146]
在一些实施方案中，核酸分子的第二核苷酸序列包含seq id no:53
‑
56。在一些实施方案中，第二核苷酸序列包含seq id no:53
‑
56，其中seq id no:53
‑
56中的一者或多者由一个或多个不编码sirna的核酸隔开。在某些实施方案中，所述一种或多种sirna选自公开于美国公布号2010/0273213a1中的sirna，所述公布以引用的方式整体并入本文中。
[0147]
在一些实施方案中，核酸分子的第二核苷酸序列编码蛋白质，其中所述蛋白质能够抑制内源性(例如野生型)tcr的表达。在一些实施方案中，第二核苷酸序列编码cas9。
[0148]
ii.a.3载体
[0149]
本发明的某些方面涉及包含本文所公开的核酸分子的载体。在一些实施方案中，载体为病毒载体。在一些实施方案中，载体为病毒粒子或病毒。在一些实施方案中，载体为哺乳动物载体。在一些实施方案中，载体为细菌载体。
[0150]
在某些实施方案中，载体为逆转录病毒载体。在一些实施方案中，载体选自由以下组成的组：腺病毒载体、慢病毒、仙台病毒、杆状病毒载体、爱泼斯坦巴尔病毒载体、乳多空病毒载体、痘苗病毒载体、单纯疱疹病毒载体和腺相关病毒(aav)载体。在特定实施方案中，载体为aav载体。在一些实施方案中，载体为慢病毒。在特定实施方案中，载体为aav载体。在一些实施方案中，载体为仙台病毒。在一些实施方案中，载体为杂合载体。可用于本发明中的杂合载体的实例可见于huang和kamihira,biotechnol.adv.31(2):208
‑
23(2103)中，所述文献以引用的方式整体并入本文中。
[0151]
ii.b.重组t细胞受体(tcr)
[0152]
本发明的某些方面涉及特异性地结合人gp100的重组t细胞受体(tcr)或其抗原结合部分(“抗gp100 tcr”)。在一些实施方案中，抗gp100 tcr由本文所公开的核酸分子编码。
[0153]
在一些实施方案中，抗gp100 tcr与参考tcr交叉竞争结合于人gp100。在一些实施方案中，抗gp100 tcr与参考tcr结合人gp100的相同表位或重叠表位。在一些实施方案中，参考tcr包含α链和β链，并且参考tcr的α链包含如seq id no:1中所列的氨基酸序列。在一些实施方案中，参考tcr的β链包含如seq id no:2中所列的氨基酸序列。
[0154]
在一些实施方案中，抗gp100 tcr包含α链和β链，其中所述α链包含恒定区，并且其中所述β链包含恒定区；其中α链恒定区包含相对于包含seq id no:1中所列的氨基酸序列的α链的恒定区具有至少1个、至少2个、至少3个、至少4个或至少5个氨基酸取代的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗gp100 tcr包含α链和β链，其中所述α链包含恒定区，并且其中所述β链包含恒定区；其中β链恒定区包含相对于包含seq id no:2中所列的氨基酸序列的β链的恒定区具有至少1个、至少2个、至少3个、至少4个或至少5个氨基酸取代的氨基酸序列。
[0155]
在一些实施方案中，抗gp100 tcr包含α链和β链，其中所述α链包含恒定区，并且其中所述β链包含恒定区；其中(i)α链恒定区包含相对于包含seq id no:1中所列的氨基酸序列的α链的恒定区具有至少1个、至少2个、至少3个、至少4个或至少5个氨基酸取代的氨基酸序列；并且(ii)β链恒定区包含相对于包含seq id no:2中所列的氨基酸序列的β链的恒定
区具有至少1个、至少2个、至少3个、至少4个或至少5个氨基酸取代的氨基酸序列。
[0156]
在一些实施方案中，抗gp100 tcr的α链包含含有α链cdr1、α链cdr2和α链cdr3的可变结构域；并且抗gp100 tcr的β链包含含有β链cdr1、β链cdr2和β链cdr3的可变结构域。在一些实施方案中，抗gp100 tcr包含含有如seq id no:7中所列的氨基酸序列的α链cdr3。在一些实施方案中，抗gp100 tcr包含含有如seq id no:10中所列的氨基酸序列的β链cdr3。
[0157]
在一些实施方案中，抗gp100 tcr的α链cdr1包含如seq id no:5中所列的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗gp100 tcr的β链cdr1包含如seq id no:8中所列的氨基酸序列。
[0158]
在一些实施方案中，抗gp100 tcr的α链cdr2包含如seq id no:6中所列的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗gp100 tcr的β链cdr2包含如seq id no:9中所列的氨基酸序列。
[0159]
在一些实施方案中，抗gp100 tcr包含与seq id no:1中所列的α链氨基酸序列的可变结构域具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的α链可变结构域。在一些实施方案中，抗gp100 tcr包含与seq id no:1中所列的α链氨基酸序列的可变结构域具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的α链可变结构域，其中抗gp100 tcr包含含有如seq id no:7中所列的氨基酸序列的α链cdr3。在一些实施方案中，抗gp100 tcr包含seq id no:1中所列的α链氨基酸序列中存在的α链可变结构域。
[0160]
在一些实施方案中，抗gp100 tcr包含与seq id no:2中所列的β链氨基酸序列的可变结构域具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的β链可变结构域。在一些实施方案中，抗gp100 tcr包含与seq id no:2中所列的β链氨基酸序列的可变结构域具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的β链可变结构域，其中抗gp100 tcr包含含有如seq id no:10中所列的氨基酸序列的β链cdr3。在一些实施方案中，抗gp100 tcr包含seq id no:2中所列的β链氨基酸序列中存在的β链可变结构域。
[0161]
在一些实施方案中，由第一核苷酸编码的抗gp100 tcr还包含α链恒定区、β链恒定区或α链恒定区与β链恒定区两者。在一些实施方案中，抗gp100 tcr包含与seq id no:1中所列的α链氨基酸序列的恒定区具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的α链恒定区。在一些实施方案中，抗gp100 tcr包含与seq id no:1中所列的α链氨基酸序列的恒定区具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的α链恒定区，其中抗gp100 tcr包含含有如seq id no:7中所列的氨基酸序列的α链cdr3。在一些实施方案中，抗gp100 tcr包含seq id no:1中所列的α链氨基酸序列中存在的α链恒定区。在一些实施方案中，由第一核苷酸编码的抗gp100 tcr还包含不同于α链的内源性(例如天然存在的)恒定区的α恒定区。在一些实施方案中，α链恒定区包含相对于seq id no:1中所列的α链氨基酸序列的恒定区的氨基酸序列含有至少1个、至少2个、至少3个、至少4个或至少5个氨基酸取代的氨基酸序列。
[0162]
在一些实施方案中，抗gp100 tcr包含与seq id no:2中所列的β链氨基酸序列的恒定区具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的β链恒定区。在一些实施方案中，抗gp100tcr包含与seq id no:2中所列的β链氨基酸序列的恒定区具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的β链恒定区，其中抗gp100 tcr包含含有如seq id no:10中所列的氨基酸序列的β链cdr3。在一些实施方案中，抗gp100 tcr包含seq id no:2中所列的β链氨基酸序列中存在的β链恒定区。在一些实施方案中，由第一核苷酸编码的抗gp100 tcr还包含不同于β链的内源性(例如天然存在的)恒定区的β恒定区。在一些实施方案中，β链恒定区包含相对于seq id no:2中所列的β链氨基酸序列的恒定区的氨基酸序列包含至少1个、至少2个、至少3个、至少4个或至少5个氨基酸取代的氨基酸序列。
[0163]
在某些实施方案中，抗gp100 tcr包含与seq id no:1中所列的α链氨基酸序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的α链。在一些实施方案中，抗gp100 tcr包含与seq id no:1中所列的α链氨基酸序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的α链，其中抗gp100 tcr包含含有如seq id no:7中所列的氨基酸序列的α链cdr3。在一些实施方案中，抗gp100 tcr包含含有seq id no:1中所列的氨基酸序列的α链。
[0164]
在某些实施方案中，抗gp100 tcr包含与seq id no:2中所列的β链氨基酸序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的β链。在一些实施方案中，抗gp100 tcr包含与seq id no:2中所列的β链氨基酸序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的β链，其中抗gp100 tcr包含含有如seq id no:10中所列的氨基酸序列的β链cdr3。在一些实施方案中，抗gp100 tcr包含含有seq id no:2中所列的氨基酸序列的β链。
[0165]
在一些实施方案中，抗gp100 tcr包含α链恒定区、β链恒定区或两者；并且其中α链恒定区、β链恒定区或两者包含相对于内源性tcr的对应氨基酸序列在靶序列内具有至少1个、至少2个、至少3个、至少4个或至少5个取代的氨基酸序列。
[0166]
ii.b.2.表位
[0167]
在一些实施方案中，抗gp100 tcr与参考tcr结合相同表位。
[0168]
在一些实施方案中，抗gp100 tcr结合于gp100的包含seq id no:13中所列的氨基酸序列的表位。在一些实施方案中，抗gp100 tcr结合于gp100的由如seq id no:13中所列的氨基酸序列组成的表位。在一些实施方案中，表位由gp100的氨基酸残基448
‑
458(seq id no:52)组成，例如“gp100
448
‑
458”。
[0169]
在某些实施方案中，表位与hla i类分子复合。在一些实施方案中，hla 1类分子选自hla
‑
a、hla
‑
b和hla
‑
c等位基因。在一些实施方案中，hla 1类分子选自hla
‑
e、hla
‑
f和hla
‑
g等位基因。在某些实施方案中，hla 1类分子为hla
‑
a等位基因。在某些实施方案中，hla 1类分子为hla
‑
b等位基因。在某些实施方案中，hla 1类分子为hla
‑
c等位基因。
[0170]
许多hla
‑
a、hla
‑
b和hla
‑
c等位基因为本领域中已知的，并且已知等位基因中的任
一者均可用于本发明中。hla等位基因的更新列表可在hla.alleles.org/(最后访问日期2019年2月27日)获得。在一些实施方案中，hla 1类分子为选自以下的hla
‑
b等位基因：hla
‑
b*07、hla
‑
b*08、hla
‑
b*13、hla
‑
b*14、hla
‑
b*15、hla
‑
b*18、hla
‑
b*27、hla
‑
b*35、hla
‑
b*37、hla
‑
b*38、hla
‑
b*39、hla
‑
b*40、hla
‑
b*41、hla
‑
b*42、hla
‑
b*44、hla
‑
b*45、hla
‑
b*46、hla
‑
b*47、hla
‑
b*48、hla
‑
b*49、hla
‑
b*50、hla
‑
b*51、hla
‑
b*52、hla
‑
b*53、hla
‑
b*54、hla
‑
b*55、hla
‑
b*56、hla
‑
b*57、hla
‑
b*58、hla
‑
b*59、hla
‑
b*67、hla
‑
b*73、hla
‑
b*78、hla
‑
b*79、hla
‑
b*81、hla
‑
b*82和hla
‑
b*83。在某些实施方案中，hla
‑
b等位基因为hla
‑
b*40:01等位基因。在某些实施方案中，hla
‑
b等位基因为hla
‑
b*40:02等位基因。在某些实施方案中，hla
‑
b等位基因为hla
‑
b*40:03等位基因。在某些实施方案中，hla
‑
b等位基因为hla
‑
b*40:04等位基因。在某些实施方案中，hla
‑
b等位基因为hla
‑
b*40:05等位基因。在某些实施方案中，hla
‑
b等位基因为hla
‑
b*40:06等位基因。
[0171]
在某些实施方案中，hla 1类分子为选自由以下组成的组的hl a
‑
b等位基因：hla
‑
b*40:01:01、hla
‑
b*40:01:02:01、hla
‑
b*40:01:02:02、hla
‑
b*40:01:02:03、hla
‑
b*40:01:02:04、hla
‑
b*40:01:02:05、hla
‑
b*40:01:02:06、hla
‑
b*40:01:02:07、hla
‑
b*40:01:02:08、hla
‑
b*40:01:02:09、hla
‑
b*40:01:03、hla
‑
b*40:01:04、hla
‑
b*40:01:05、hla
‑
b*40:01:06、hla
‑
b*40:01:07、hla
‑
b*40:01:08、hla
‑
b*40:01:09、hla
‑
b*40:01:10、hla
‑
b*40:01:11、hla
‑
b*40:01:12、hla
‑
b*40:01:13、hla
‑
b*40:01:14、hla
‑
b*40:01:15、hla
‑
b*40:01:16、hla
‑
b*40:01:17、hla
‑
b*40:01:18、hla
‑
b*40:01:19、hla
‑
b*40:01:20、hla
‑
b*40:01:21、hla
‑
b*40:01:22、hla
‑
b*40:01:23、hla
‑
b*40:01:24、hla
‑
b*40:01:25、hla
‑
b*40:01:26、hla
‑
b*40:01:27、hla
‑
b*40:01:28、hla
‑
b*40:01:29、hla
‑
b*40:01:30、hla
‑
b*40:01:31、hla
‑
b*40:01:32、hla
‑
b*40:01:33、hla
‑
b*40:01:34、hla
‑
b*40:01:35、hla
‑
b*40:01:36、hla
‑
b*40:01:37、hla
‑
b*40:01:38、hla
‑
b*40:01:39、hla
‑
b*40:01:40、hla
‑
b*40:01:41、hla
‑
b*40:01:42、hla
‑
b*40:01:43、hla
‑
b*40:01:44、hla
‑
b*40:01:45、hla
‑
b*40:01:46、hla
‑
b*40:01:47、hla
‑
b*40:01:48、hla
‑
b*40:01:49、hla
‑
b*40:01:50、hla
‑
b*40:01:51、hla
‑
b*40:01:52、hla
‑
b*40:01:53、hla
‑
b*40:01:54、hla
‑
b*40:01:55、hla
‑
b*40:01:56、hla
‑
b*40:01:57、hla
‑
b*40:01:58、hla
‑
b*40:01:59和hla
‑
b*40:01:60。在一些实施方案中，hla 1类分子为选自由以下组成的组的hla
‑
b等位基因：hla
‑
b*40:02:01:01、hla
‑
b*40:02:01:02、hla
‑
b*40:02:01:03、hla
‑
b*40:02:01:04、hla
‑
b*40:02:01:05、hl a
‑
b*40:02:01:06、hla
‑
b*40:02:01:07、hla
‑
b*40:02:01:08、hla
‑
b*40:02:02、hla
‑
b*40:02:03、hla
‑
b*40:02:04、hla
‑
b*40:02:05、hla
‑
b*40:02:06、hla
‑
b*40:02:07、hla
‑
b*40:02:08、hla
‑
b*40:02:09、hla
‑
b*40:02:10、hla
‑
b*40:02:11、hla
‑
b*40:02:12、hla
‑
b*40:02:13、hla
‑
b*40:02:14、hla
‑
b*40:02:15、hla
‑
b*40:02:16、hla
‑
b*40:02:17、hla
‑
b*40:02:18、hla
‑
b*40:02:19、hla
‑
b*40:02:20、hla
‑
b*40:02:21、hla
‑
b*40:02:22、hla
‑
b*40:02:23、hla
‑
b*40:02:24、hla
‑
b*40:02:25、hla
‑
b*40:02:26、hla
‑
b*40:03:01:01、hla
‑
b*40:03:01:02、hla
‑
b*40:04:01、hla
‑
b*40:04:02、hla
‑
b*40:05:01:01、hla
‑
b*40:05:01:02、hla
‑
b*40:06:01:01、hla
‑
b*40:06:01:02、hla
‑
b*40:06:02、hla
‑
b*40:06:03、hla
‑
b*40:06:04:01、hla
‑
b*40:06:04:02、hla
‑
b*40:06:05、hla
‑
b*40:06:06、hla
‑
b*40:06:07、hla
‑
b*40:06:08、hla
‑
b*40:06:09、hla
‑
b*40:06:10、hla
‑
b*40:06:11、hla
‑
b*40:06:12、hla
‑
b*40:06:13、hla
‑
b*40:06:14、hla
‑
b*40:06:15、hla
‑
b*40:06:16、hla
‑
b*40:06:17、hla
‑
b*
40:06:18、hla
‑
b*40:07、hla
‑
b*40:08、hla
‑
b*40:09、hla
‑
b*40:100、hla
‑
b*40:101、hla
‑
b*40:102、hla
‑
b*40:103、hla
‑
b*40:104、hla
‑
b*40:105、hla
‑
b*40:106、hla
‑
b*40:107、hla
‑
b*40:108、hla
‑
b*40:109、hla
‑
b*40:10:01:01、hla
‑
b*40:10:01:02、hl a
‑
b*40:10:02、hla
‑
b*40:110、hla
‑
b*40:111、hla
‑
b*40:112、hla
‑
b*40:113、hla
‑
b*40:114:01、hla
‑
b*40:114:02、hla
‑
b*40:115、hla
‑
b*40:116、hla
‑
b*40:117、hla
‑
b*40:118、hla
‑
b*40:119、hla
‑
b*40:11:01、hla
‑
b*40:11:02、hla
‑
b*40:12、hla
‑
b*40:120、hla
‑
b*40:121、hla
‑
b*40:122、hla
‑
b*40:123、hla
‑
b*40:124:01、hla
‑
b*40:124:02、hla
‑
b*40:125:01、hla
‑
b*40:125:02、hla
‑
b*40:126、hla
‑
b*40:127、hla
‑
b*40:128、hla
‑
b*40:129、hla
‑
b*40:13、hla
‑
b*40:130:01、hla
‑
b*40:130:02、hla
‑
b*40:131、hla
‑
b*40:132、hla
‑
b*40:133、hla
‑
b*40:134、hla
‑
b*40:135、hla
‑
b*40:136、hla
‑
b*40:137、hla
‑
b*40:138、hla
‑
b*40:139、hla
‑
b*40:140、hla
‑
b*40:141、hla
‑
b*40:142、hla
‑
b*40:143、hla
‑
b*40:144、hla
‑
b*40:145、hla
‑
b*40:146、hla
‑
b*40:147、hla
‑
b*40:148、hla
‑
b*40:149、hla
‑
b*40:14:01、hla
‑
b*40:14:02、hla
‑
b*40:14:03、hla
‑
b*40:15、hla
‑
b*40:150、hla
‑
b*40:151、hla
‑
b*40:152、hla
‑
b*40:153、hla
‑
b*40:154、hla
‑
b*40:155:01、hla
‑
b*40:155:02、hla
‑
b*40:156、hla
‑
b*40:157、hla
‑
b*40:158、hla
‑
b*40:159、hla
‑
b*40:16、hla
‑
b*40:160:01、hla
‑
b*40:160:02、hla
‑
b*40:161、hla
‑
b*40:162、hla
‑
b*40:163、hla
‑
b*40:164、hla
‑
b*40:165、hla
‑
b*40:166、hla
‑
b*40:167、hla
‑
b*40:168、hla
‑
b*40:169、hla
‑
b*40:170、hla
‑
b*40:171、hla
‑
b*40:172、hla
‑
b*40:173、hla
‑
b*40:174、hla
‑
b*40:175、hla
‑
b*40:176、hla
‑
b*40:177、hla
‑
b*40:178、hla
‑
b*40:179、hla
‑
b*40:18、hla
‑
b*40:180、hla
‑
b*40:181、hla
‑
b*40:182、hla
‑
b*40:183、hla
‑
b*40:184、hla
‑
b*40:185、hla
‑
b*40:186:01、hla
‑
b*40:186:02、hla
‑
b*40:187、hla
‑
b*40:188、hla
‑
b*40:189、hla
‑
b*40:19、hla
‑
b*40:190、hla
‑
b*40:191、hla
‑
b*40:192、hla
‑
b*40:193、hla
‑
b*40:194、hla
‑
b*40:195、hla
‑
b*40:196、hla
‑
b*40:197、hla
‑
b*40:198、hla
‑
b*40:199、hla
‑
b*40:200、hla
‑
b*40:201、hla
‑
b*40:202、hla
‑
b*40:203、hla
‑
b*40:204、hla
‑
b*40:205、hla
‑
b*40:206、hla
‑
b*40:207、hla
‑
b*40:208、hla
‑
b*40:209、hla
‑
b*40:20:01:01、hla
‑
b*40:20:01:02、hla
‑
b*40:21、hla
‑
b*40:210、hla
‑
b*40:211、hla
‑
b*40:212、hla
‑
b*40:213、hla
‑
b*40:214、hla
‑
b*40:215、hla
‑
b*40:216、hla
‑
b*40:217、hla
‑
b*40:218、hla
‑
b*40:219、hla
‑
b*40:220、hla
‑
b*40:221、hla
‑
b*40:222、hla
‑
b*40:223、hla
‑
b*40:224、hla
‑
b*40:225、hla
‑
b*40:226、hla
‑
b*40:227、hla
‑
b*40:228、hla
‑
b*40:229、hla
‑
b*40:22 57、hla
‑
b*40:23、hla
‑
b*40:230、hla
‑
b*40:231、hla
‑
b*40:232、hla
‑
b*40:233、hla
‑
b*40:234、hla
‑
b*40:235、hla
‑
b*40:236、hla
‑
b*40:237、hla
‑
b*40:238、hla
‑
b*40:239、hla
‑
b*40:24、hla
‑
b*40:240、hla
‑
b*40:241、hla
‑
b*40:242、hla
‑
b*40:243、hla
‑
b*40:244、hla
‑
b*40:245、hla
‑
b*40:246、hla
‑
b*40:247、hla
‑
b*40:248、hla
‑
b*40:249、hla
‑
b*40:25、hla
‑
b*40:250、hla
‑
b*40:251、hla
‑
b*40:252、hla
‑
b*40:253、hla
‑
b*40:254、hla
‑
b*40:255、hla
‑
b*40:256、hla
‑
b*40:257、hla
‑
b*40:258、hla
‑
b*40:259、hla
‑
b*40:26、hla
‑
b*40:260、hla
‑
b*40:261、hla
‑
b*40:262、hla
‑
b*40:263、hla
‑
b*40:264、hla
‑
b*40:265、hla
‑
b*40:266、hla
‑
b*40:267、hla
‑
b*40:268、hla
‑
b*40:269、hla
‑
b*40:270、hla
‑
b*40:271、hla
‑
b*40:272、hla
‑
b*40:273、hla
‑
b*40:274、hla
‑
b*40:275、hla
‑
b*40:276、hla
‑
b*40:277、hla
‑
b*40:278、hla
‑
b*40:279、hla
‑
b*40:27:01、hla
‑
b*40:27:02、hla
‑
b*40:28、hla
‑
b*40:280、hla
‑
b*40:281、hla
‑
b*40:282、hla
‑
b*40:283、hla
‑
b*40:284、hla
‑
b*40:285、hla
‑
b*
40:286、hla
‑
b*40:287、hla
‑
b*40:288、hla
‑
b*40:289、hla
‑
b*40:29、hla
‑
b*40:290、hla
‑
b*40:291、hla
‑
b*40:292、hla
‑
b*40:293、hla
‑
b*40:294、hla
‑
b*40:295、hla
‑
b*40:296、hla
‑
b*40:297、hla
‑
b*40:298:01、hla
‑
b*40:298:02、hla
‑
b*40:299、hla
‑
b*40:30、hla
‑
b*40:300、hla
‑
b*40:301、hla
‑
b*40:302、hla
‑
b*40:303、hla
‑
b*40:304、hla
‑
b*40:305、hla
‑
b*40:306、hla
‑
b*40:307、hla
‑
b*40:308、hla
‑
b*40:309、hla
‑
b*40:31、hla
‑
b*40:310、hla
‑
b*40:311、hla
‑
b*40:312、hla
‑
b*40:313、hla
‑
b*40:314、hla
‑
b*40:315、hla
‑
b*40:316、hla
‑
b*40:317、hla
‑
b*40:318、hla
‑
b*40:319、hla
‑
b*40:32、hla
‑
b*40:320、hla
‑
b*40:321、hla
‑
b*40:322、hla
‑
b*40:323、hla
‑
b*40:324、hla
‑
b*40:325、hla
‑
b*40:326、hla
‑
b*40:327、hla
‑
b*40:328、hla
‑
b*40:329、hla
‑
b*40:33、hla
‑
b*40:330、hla
‑
b*40:331、hla
‑
b*40:332、hla
‑
b*40:333、hla
‑
b*40:334、hla
‑
b*40:335、hla
‑
b*40:336、hla
‑
b*40:337 98、hla
‑
b*40:338、hla
‑
b*40:339、hla
‑
b*40:34、hla
‑
b*40:340、hla
‑
b*40:341、hla
‑
b*40:342、hla
‑
b*40:343、hla
‑
b*40:344、hla
‑
b*40:345、hla
‑
b*40:346、hla
‑
b*40:347、hla
‑
b*40:348、hla
‑
b*40:349、hla
‑
b*40:350、hla
‑
b*40:351、hla
‑
b*40:352、hla
‑
b*40:353、hla
‑
b*40:354、hla
‑
b*40:355、hla
‑
b*40:356、hla
‑
b*40:357、hla
‑
b*40:358、hla
‑
b*40:359、hla
‑
b*40:35:01、hla
‑
b*40:35:02、hla
‑
b*40:36、hla
‑
b*40:360、hla
‑
b*40:361 86、hla
‑
b*40:362、hla
‑
b*40:363、hla
‑
b*40:364、hla
‑
b*40:365、hla
‑
b*40:366、hla
‑
b*40:367、hla
‑
b*40:368、hla
‑
b*40:369、hla
‑
b*40:37、hla
‑
b*40:370、hla
‑
b*40:371、hla
‑
b*40:372、hla
‑
b*40:373、hla
‑
b*40:374、hla
‑
b*40:375、hla
‑
b*40:376、hla
‑
b*40:377、hla
‑
b*40:378、hla
‑
b*40:379、hla
‑
b*40:38、hla
‑
b*40:380、hla
‑
b*40:381、hla
‑
b*40:382、hla
‑
b*40:383、hla
‑
b*40:384、hla
‑
b*40:385、hla
‑
b*40:386、hla
‑
b*40:387、hla
‑
b*40:388、hla
‑
b*40:389、hla
‑
b*40:39、hla
‑
b*40:390、hla
‑
b*40:391、hla
‑
b*40:392、hla
‑
b*40:393、hla
‑
b*40:394、hla
‑
b*40:395、hla
‑
b*40:396、hla
‑
b*40:397、hla
‑
b*40:398、hla
‑
b*40:399 57、hla
‑
b*40:40、hla
‑
b*40:400、hla
‑
b*40:401、hla
‑
b*40:402、hla
‑
b*40:403、hla
‑
b*40:404、hla
‑
b*40:406、hla
‑
b*40:407、hla
‑
b*40:408、hla
‑
b*40:409、hla
‑
b*40:410、hla
‑
b*40:411、hla
‑
b*40:412、hla
‑
b*40:413、hla
‑
b*40:414、hla
‑
b*40:42、hla
‑
b*40:43、hla
‑
b*40:44、hla
‑
b*40:45、hla
‑
b*40:46、hla
‑
b*40:47、hla
‑
b*40:48、hla
‑
b*40:49、hla
‑
b*40:50、hla
‑
b*40:51、hla
‑
b*40:52、hla
‑
b*40:53、hla
‑
b*40:54、hla
‑
b*40:55、hla
‑
b*40:56、hla
‑
b*40:57、hla
‑
b*40:58、hla
‑
b*40:59、hla
‑
b*40:60、hla
‑
b*40:61、hla
‑
b*40:62、hla
‑
b*40:63、hla
‑
b*40:64:01:01、hla
‑
b*40:64:01:02、hla
‑
b*40:65、hla
‑
b*40:66、hla
‑
b*40:67、hla
‑
b*40:68、hla
‑
b*40:69、hla
‑
b*40:70:01、hla
‑
b*40:70:02、hla
‑
b*40:71、hla
‑
b*40:72:01、hla
‑
b*40:72:02、hla
‑
b*40:73、hla
‑
b*40:74、hla
‑
b*40:75、hla
‑
b*40:76、hla
‑
b*40:77、hla
‑
b*40:78、hla
‑
b*40:79、hla
‑
b*40:80、hla
‑
b*40:81、hla
‑
b*40:82、hla
‑
b*40:83、hla
‑
b*40:84、hla
‑
b*40:85、hla
‑
b*40:86、hla
‑
b*40:87:01、hla
‑
b*40:87:02、hla
‑
b*40:88、hla
‑
b*40:89、hla
‑
b*40:90、hla
‑
b*40:91、hla
‑
b*40:92、hla
‑
b*40:93、hla
‑
b*40:94、hla
‑
b*40:95、hla
‑
b*40:96、hla
‑
b*40:97、hla
‑
b*40:98和hla
‑
b*40:99。
[0172]
ii.b.3.双特异性t细胞受体(tcr)
[0173]
本公开的某些方面涉及一种包含第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域的双特异性tcr，其中所述第一抗原结合结构域包含本文所公开的tcr或其抗原结合部分。在一些实施方案中，第一抗原结合结构域包含单链可变片段(“scfv”)。
[0174]
在一些实施方案中，第二抗原结合结构域特异性地结合于t细胞表面上表达的蛋白质。t细胞表面上表达的任何蛋白质均可由本文所公开的双特异性抗体靶向。在某些实施方案中，t细胞表面上表达的蛋白质不由其他细胞表达。在一些实施方案中，t细胞表面上表达的蛋白质在一种或多种其他人免疫细胞的表面上表达。在一些实施方案中，t细胞表面上表达的蛋白质在一种或多种其他人免疫细胞的表面上表达，但其不在人非免疫细胞的表面上表达。在一些实施方案中，第二抗原结合结构域特异性地结合于t细胞表面上表达的选自以下的蛋白质：cd3、cd2、cd5、cd6、cd8、cd11a(lfa
‑
1α)、cd43、cd45和cd53。在某些实施方案中，第二抗原结合结构域特异性地结合于cd3。在一些实施方案中，第二抗原结合结构域包含scfv。
[0175]
在一些实施方案中，第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域通过共价键连接或缔合。在一些实施方案中，第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域通过肽键连接。
[0176]
ii.c.表达tcr的细胞
[0177]
本公开的某些方面涉及包含本文所公开的核酸分子、本文所公开的载体、本文所公开的重组tcr、本文所公开的双特异性tcr或其任何组合的细胞。任何细胞均可用于本公开中。
[0178]
在某些实施方案中，细胞表达cd3。cd3表达可为天然存在的，例如cd3从由细胞内源性表达的核酸序列表达。举例而言，t细胞和自然杀伤(nk)细胞天然地表达cd3。因此，在一些实施方案中，细胞为t细胞或自然杀伤细胞。在某些实施方案中，细胞为选自自然杀伤t(nkt)细胞和先天淋巴样细胞(ilc)的t细胞。
[0179]
在一些实施方案中，t细胞分离自人受试者。在一些实施方案中，人受试者为将最终接受t细胞疗法的同一受试者。在其他实施方案中，受试者为供体受试者，其中供体受试者不为将接受t细胞疗法的同一受试者。
[0180]
在一些实施方案中，细胞为不天然地表达cd3的细胞，其中细胞已经修饰以表达cd3。在一些实施方案中，细胞包含编码cd3的转基因，其中所述转基因由细胞表达。在一些实施方案中，细胞包含编码活化细胞的内源性cd3表达的蛋白质的转基因。在一些实施方案中，细胞包含编码抑制细胞中的cd3表达抑制剂的蛋白质或sirna的转基因。在一些实施方案中，转基因并入细胞的基因组。在一些实施方案中，转基因未并入细胞的基因组中。
[0181]
在一些实施方案中，经修饰以表达cd3的细胞分离自人受试者。在一些实施方案中，人受试者为将最终接受细胞疗法的同一受试者。在其他实施方案中，所述为供体受试者，其中供体受试者不为将接受细胞疗法的同一受试者。
[0182]
ii.d.hla i类分子
[0183]
本公开的某些方面涉及一种与肽复合的hla i类分子，其中所述肽包含seq id no:13中所列的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述肽由seq id no:13中所列的氨基酸序列组成。
[0184]
在一些实施方案中，hla i类分子为hla
‑
a、hla
‑
b或hla
‑
c。在一些实施方案中，hla i类分子为hla
‑
e、hla
‑
f或hla
‑
g。在一些实施方案中，hla 1类分子为选自以下的hla
‑
b等位基因：hla
‑
b*07、hla
‑
b*08、hla
‑
b*13、hla
‑
b*14、hla
‑
b*15、hla
‑
b*18、hla
‑
b*27、hla
‑
b*35、hla
‑
b*37、hla
‑
b*38、hla
‑
b*39、hla
‑
b*40、hla
‑
b*41、hla
‑
b*42、hla
‑
b*44、hla
‑
b*45、hla
‑
b*46、hla
‑
b*47、hla
‑
b*48、hla
‑
b*49、hla
‑
b*50、hla
‑
b*51、hla
‑
b*52、hla
‑
b*53、hla
‑
b*54、
hla
‑
b*55、hla
‑
b*56、hla
‑
b*57、hla
‑
b*58、hla
‑
b*59、hla
‑
b*67、hla
‑
b*73、hla
‑
b*78、hla
‑
b*79、hla
‑
b*81、hla
‑
b*82和hla
‑
b*83。在某些实施方案中，hla
‑
b等位基因为hla
‑
b*40:01等位基因。在某些实施方案中，hla
‑
b等位基因为hla
‑
b*40:02等位基因。在某些实施方案中，hla
‑
b等位基因为hla
‑
b*40:03等位基因。在某些实施方案中，hla
‑
b等位基因为hla
‑
b*40:04等位基因。在某些实施方案中，hla
‑
b等位基因为hla
‑
b*40:05等位基因。在某些实施方案中，hla
‑
b等位基因为hla
‑
b*40:06等位基因。在一些实施方案中，hla等位基因为本文所公开的任何hla等位基因，例如同上。
[0185]
在一些实施方案中，hla i类分子包含α链和β2m。在一些实施方案中，α链包含α1结构域、α2结构域、α3结构域。在一些实施方案中，β2m包含与seq id no:16中所列的氨基酸序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，α链的序列选自在hla.alleles.org(最后访问日期2019年2月27日)可获得的hla蛋白质序列中的任一者。
[0186]
在一些实施方案中，hla i类分子为单体。在一些实施方案中，hla i类分子为二聚体。在一些实施方案中，hla i类分子为多聚体。在一些实施方案中，hla i类分子为三聚体。在一些实施方案中，hla i类分子为四聚体。在一些实施方案中，hla i类分子为五聚体。
[0187]
本公开的某些方面涉及包含本文所公开的任何hla i类分子的抗原呈递细胞(apc)。在某些实施方案中，apc表达apc表面上的hla i类分子。在某些实施方案中，apc包含超过一个本文所公开的hla i类分子。
[0188]
ii.d.疫苗
[0189]
本公开的某些方面涉及一种癌症疫苗，所述癌症疫苗包含含有如seq id no:13中所列的氨基酸序列的肽。在一些实施方案中，癌症疫苗包含由seq id no:13中所列的氨基酸序列组成的肽。在一些实施方案中，疫苗还包含一种或多种赋形剂。在一些实施方案中，疫苗还包含一种或多种其他肽。在一些实施方案中，所述一种或多种其他肽包含一个或多个其他表位。
[0190]
iii.本公开的方法
[0191]
本公开的某些方面涉及治疗有需要的受试者的癌症的方法。本公开的其他方面涉及对靶向抗原的细胞进行工程改造的方法。本公开的其他方面涉及富集获自人受试者的靶t细胞群体的方法。
[0192]
iii.a.治疗癌症的方法
[0193]
本公开的某些方面涉及治疗有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用本文所公开的核酸分子、本文所公开的重组tcr、本文所公开的双特异性tcr、本文所公开的表位或本文所公开的hla i类分子或者包含以上中的任一者的载体或细胞。
[0194]
在一些实施方案中，癌症选自黑素瘤、骨癌、肾癌、前列腺癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌、皮肤或眼内恶性黑素瘤、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛门区癌、胃癌、睪丸癌、子宫癌、输卵管癌瘤、子宫内膜癌瘤、子宫颈癌瘤、阴道癌瘤、外阴癌瘤、霍奇金氏病、非霍奇金氏淋巴瘤(nhl)、原发性纵隔大b细胞淋巴瘤(pmbc)、弥漫性大b细胞淋巴瘤(dlbcl)、滤泡性淋巴瘤(fl)、转化的滤泡性淋巴瘤、脾边缘区淋巴瘤(smzl)、食管癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、慢性或
急性白血病、急性骨髓性白血病(aml)、慢性骨髓性白血病、急性成淋巴细胞性白血病(all)(包括非t细胞all)、慢性淋巴细胞性白血病(cll)、儿童期实体肿瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾脏或输尿管癌、肾盂癌瘤、中枢神经系统(cns)赘瘤、原发性cns淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊柱轴肿瘤、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西氏肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、t细胞淋巴瘤、环境诱发的癌症(包括由石棉诱发的那些癌症)、其他b细胞恶性肿瘤和所述癌症的组合。在一些实施方案中，癌症为黑素瘤。
[0195]
在一些实施方案中，癌症为复发的。在一些实施方案中，癌症为难治性的。在一些实施方案中，癌症为晚期的。在一些实施方案中，癌症为转移性的。
[0196]
在一些实施方案中，本文所公开的方法治疗受试者的癌症。在一些实施方案中，本文所公开的方法降低一种或多种癌症症状的严重程度。在一些实施方案中，本文所公开的方法减小源自癌症的肿瘤的大小或数目。在一些实施方案中，相对于未提供本文所公开的方法的受试者，本文所公开的方法增加受试者的总体存活。在一些实施方案中，相对于未提供本文所公开的方法的受试者，本文所公开的方法增加受试者的无进展存活。在一些实施方案中，本文所公开的方法在受试者中引起部分应答。在一些实施方案中，本文所公开的方法在受试者中引起完全应答。
[0197]
在一些实施方案中，本文所公开的方法包括治疗有需要的受试者的癌症，包括向所述受试者施用本文所描述的细胞，其中所述细胞包含本文所公开的核酸分子、本文所公开的载体、本文所公开的重组tcr和/或本文所公开的双特异性抗体。在一些实施方案中，细胞为t细胞。在一些实施方案中，细胞为经修饰以表达cd3的细胞。
[0198]
在一些实施方案中，细胞(例如t细胞)获自受试者。在一些实施方案中，细胞(例如t细胞)获自除所述受试者外的供体。
[0199]
在一些实施方案中，受试者在施用细胞之前经预处理。预处理可包含有助于t细胞功能和/或存活的任何物质。在一些实施方案中，预处理包括向所述受试者施用化学疗法、细胞因子、蛋白质、小分子或其任何组合。在一些实施方案中，预处理包括施用白细胞介素。在一些实施方案中，预处理包括施用il
‑
2、il
‑
4、il
‑
7、il
‑
9、il
‑
15、il
‑
21或其任何组合。在一些实施方案中，预处理包括施用环磷酰胺、氟达拉滨或两者。在一些实施方案中，预处理包括施用维生素c、akt抑制剂、atra(vesanoid，维甲酸)、雷帕霉素或其任何组合。
[0200]
iii.b.对靶向抗原的细胞进行工程改造的方法
[0201]
本公开的某些方面涉及对靶向抗原的细胞进行工程改造的方法。在一些实施方案中，抗原为gp100抗原。在一些实施方案中，所述方法包括用本文所公开的核酸分子或本文所公开的载体转导细胞。细胞可为本文所描述的任何细胞。在一些实施方案中，细胞为本文所描述的t细胞。在一些实施方案中，细胞为如本文所描述经修饰以表达cd3的细胞。在一些实施方案中，细胞(例如t细胞)获自需要t细胞疗法的受试者。在一些实施方案中，细胞获自除需要t细胞疗法的受试者外的供体。在一些实施方案中，细胞为t细胞或自然杀伤细胞。
[0202]
iii.c.富集靶t细胞群体的方法
[0203]
本公开的某些方面涉及富集获自人受试者的靶t细胞群体的方法。在一些实施方案中，所述方法包括使t细胞与本文所公开的hla i类分子接触。在一些实施方案中，所述方法包括使t细胞与本文所公开的apc接触。在一些实施方案中，在接触之后，相对于接触之前能够结合hla i类分子的t细胞数目，经富集的t细胞群体包含较高数目的能够结合hla i类
分子的t细胞。
[0204]
在一些实施方案中，所述方法包括使t细胞在体外与肽接触，其中所述肽包含seq id no:13中所列的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述方法包括使t细胞在体外与肽接触，其中所述肽由seq id no:13中所列的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，在接触之后，相对于接触之前能够结合hla i类分子的t细胞数目，经富集的t细胞群体包含较高数目的能够结合hla i类分子的t细胞。
[0205]
本公开的一些方面涉及一种选择能够靶向肿瘤细胞的t细胞的方法。在一些实施方案中，所述方法包括使经分离t细胞的群体在体外与肽接触，其中所述肽由如seq id no:13中所列的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，t细胞获自人受试者。
[0206]
获自人受试者的t细胞可为本文所公开的任何t细胞。在一些实施方案中，获自人受试者的t细胞为肿瘤浸润淋巴细胞(til)。
[0207]
在一些实施方案中，所述方法还包括向人受试者施用经富集的t细胞。在一些实施方案中，如本文所描述，受试者在接受t细胞之前经预处理。
[0208]
本文所描述的各种方面、实施方案和选择全部可以任何和所有变化型式组合。
[0209]
本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请以引用的方式并入本文中，所达到的程度如同特定地且个别地指示每一个别出版物、专利或专利申请以引用的方式并入一般。
[0210]
在已总体上描述了本发明的情况下，可通过参考本文所提供的实施例获得进一步理解。这些实施例仅用于说明的目的且不旨在具有限制性。
[0211]
实施例
[0212]
实施例1
[0213]
从转移性黑素瘤患者分离til，接着在体外进行多克隆扩增，并且针对hla
‑
b*40:01等位基因检查其gp100抗原特异性。已将使用肽/hla(phla)多聚体的基于结构的分析与功能分析的组合用于测量ag
‑
特异性t细胞应答。
[0214]
由于phla多聚体产生需要使用具有已知确切序列的肽，所以使用基于phla多聚体的策略针对新表位肽进行高通量筛选为不直接或实际的。除使用phla多聚体的基于结构的分析外，还可应用功能分析来测定t细胞的抗原特异性。使用人工抗原呈递细胞(apc)进行功能分析，所述人工抗原呈递细胞可处理和加工较长的肽且作为刺激细胞经由i类分子呈递表位肽。使用用于涵盖gp100的全蛋白的重叠肽(表5)对b*40:01
‑
人工apc进行脉冲处理且在细胞因子elispot测定中用作刺激剂。在用使用gp100来源的重叠肽脉冲处理的b*40:01
‑
人工apc进行一次受控刺激之后，在ifn
‑
γelispot分析中，b*40:01

黑素瘤til显示对具有共同拥有的序列
446
stesitgslgplldg
460
的两个相邻肽的阳性应答(图1)。使用一系列突变体缺失肽，确定了由b*40:01分子呈递的最低需求肽表位
448
esitgslgpll
458
。鉴定了hla
‑
b*40:01/gp100
448
‑
458
t细胞，所述t细胞占多克隆扩增的til中的cd8

t细胞的0.11％(图2)。在用b*40:01
‑
人工apc进行一次受控肽特异性刺激之后，b*40:01/gp100
448
‑
458
t细胞的频率增加至1.8％，排除低染色百分比表示假阳性的可能性(图2)。根据elispot分析，多聚体阳性t细胞以hla限制性肽特异性方式分泌可检测的ifn
‑
γ(图3)。
[0215]
表5.gp100重叠肽。
[0216]
[0217][0218]
收集多聚体阳性抗肿瘤t细胞且对其tcr基因进行分子克隆(图4，seq id no:1和2)。通过tcr重构t细胞的多聚体染色和elispot测定来验证经克隆tcr的抗原特异性和功能反应性。当基于原代t细胞重构时，b*40:01gp100
448
‑
458
tcr转导的t细胞在同源多聚体情况下成功染色(图5)且与由表面b*40:01分子呈递的gp100
448
‑
458
肽强烈反应(图6)。重要的是，这些细胞能够识别天然表达gp100基因的b*40:01匹配且未经肽脉冲处理的肿瘤细胞(图7)。缺乏b*40:01和gp100的内源性表达的sk
‑
mel
‑
37黑素瘤细胞仅在b*40:01和gp100基因(但非单一基因中的任一者)经转导时变得对b*40:01/gp100
448
‑
458
tcr转导的t细胞具有反应性(图7
‑
9)。这些结果清楚地证实b*40:01/gp100
448
‑
458
tcr转导的t细胞充分热衷于识别肿瘤细胞且经克隆的b*40:01/gp100
448
‑
458
tcr为肿瘤反应性的。
[0219]
gp100为有前景且在双特异性t细胞衔接器(bite)疗法中充分研究的共同拥有的抗原之一，并且在患有转移性葡萄膜黑素瘤的患者中使用imcgp100进行靶向gp100的临床试验，imcgp100为包含融合至scfv抗cd3的识别gp100抗原的可溶性tcr的双特异性生物剂，从而在hla
‑
a*02:01分子的情况下重定向表达gp100的黑素瘤细胞的t细胞溶解。新克隆的肿瘤反应性b*40:01限制性gp100 tcr基因的使用可将靶向gp100的bite疗法的适用性加宽至hla
‑
a*02:01阳性癌症患者以外。
[0220]
方法
[0221]
细胞样品
[0222]
在机构审查委员会批准之后从健康供体获得外周血样品。经由密度梯度离心(ficoll
‑
paque plus；ge healthcare)获得单核细胞。k562为具有缺陷型hla表达的红白血病细胞系。t2是hla
‑
a*02:01

t细胞白血病/b
‑
lcl杂合细胞系。jurkat 76为缺乏tcr和cd8表达的t细胞白血病细胞系。使sk
‑
mel
‑
28和a375细胞系在补充有10％fbs和50μg/ml庆大霉素(invitrogen)的dmem中生长。将k562、t2和jurkat 76细胞系在补充有10％fbs和50μg/ml庆大霉素的rpmi1640中培养。使分离自转移性黑素瘤患者的til在体外生长。
[0223]
肽
[0224]
将合成肽在dmso中溶解至50μg/ml。所用的肽为用于涵盖gp100的全蛋白(表1)的20聚体重叠肽以及b*40:01限制性gp100
448
‑
458
(esitgslgpll；seq id no:13)、gp100
449
‑
458
(sitgslgpll；seq id no:194)、ny
‑
eso
‑1125
‑
133
(eftvsgnil；seq id no:195)和hiv nef
92
‑
100
(kekgglegl；seq id no:63)肽。使用gp100
449
‑
458
、ny
‑
eso
‑1125
‑
133
和hiv nef
92
‑
100
肽作为阴性对照。
[0225]
基因
[0226]
使hla
‑
b*40:01基因经由内部核糖体进入位点与截短型式的人神经生长因子受体(δngfr)融合。使用抗ngfr单克隆抗体(mab)分离δngfr转导的细胞。使用smarter race cdna扩增试剂盒(takara bio)通过cdna末端5
’‑
快速扩增(race)pcr对tcr基因进行克隆。将5
’‑
race pcr产物克隆至逆转录病毒载体中且测序。将所有基因克隆至pmx逆转录病毒载体中且使用基于293gpg细胞的逆转录病毒系统转导。
[0227]
转染子
[0228]
如先前所报告用个别tcrα和tcrβ基因转导jurkat 76/cd8细胞
42
‑
44
。使用cd3微珠粒(miltenyi biotec)将jurkat 76/cd8来源的tcr转染子纯化(>95％纯度)。先前已报告基于k562的人工apc单独地将各种hla i类基因表达为单一hla等位基因与cd80和cd83结合(butler和hirano,immunol.rev.257:191
‑
209(2014)；hirano等人,clin.cancer res.12:2967
‑
75(2006))。使用pg13来源的逆转录病毒上清液将tcr基因转导至人原代t细胞中。使用transit293(mirus bio)将tcr基因转染至293gpg细胞系中。用全长gp100基因逆转录病毒转导gp100
‑
sk
‑
mel
‑
37细胞以产生sk
‑
mel
‑
37/gp100。在用抗gp100 mab(克隆7e3；lifespan biosciences)染色之后通过流式细胞术评估经转导的gp100的表达。用hla
‑
b*40:01逆转录病毒转导hla
‑
b*40:01
‑
sk
‑
mel
‑
37细胞以产生sk
‑
mel
‑
37/b*40:01细胞。用如上文所描述的δngfr基因标记hla
‑
b*40:01基因，并且将δngfr

细胞纯化(>95％纯度)且用于后续实验中。逆转录病毒转导单独的δngfr基因作为对照。
[0229]
流式细胞术和细胞分选
[0230]
将细胞表面分子用pc5缀合的抗cd8 mab(克隆b9.11；beckman coulter)、fitc缀合的抗ngfr(克隆me20.4；biolegend)和apc/cy7缀合的抗cd3(克隆ucht1；biolegend)染色。用活/死可固定水性死细胞染色试剂盒(live/dead fixable aqua dead cell stain kit，life technologies)辩别死细胞。对于细胞内染色，将细胞固定且通过使用cytofix/cytoperm试剂盒(bd biosciences)透化。用流式细胞术(bd biosciences)分析经染色的细胞，并且使用flowjo(tree star)进行数据分析。使用facs aria ii(bd bioscience)进行细胞分选。
[0231]
细胞因子elispot分析
[0232]
进行ifn
‑
γelispot测定。将pvdf板(millipore,bedford,ma)用捕获mab(1
‑
d1k；mabtech,mariemont,oh)包被，并且在存在或不存在肽的情况下将t细胞与每孔2x 104个靶细胞一起在37℃下孵育20
‑
24小时。随后将板洗涤且与生物素缀合的检测mab(7
‑
b6
‑
1；mabtech)一起孵育。接着添加hrp缀合的sa(jackson immunoresearch)，并且使ifn
‑
γ斑点显影。通过用冷自来水充分冲洗使反应停止。扫描elispot板且使用immunospot读板仪和immunospot 5.0版软件(cellular technology limited,shaker heights,oh)计数。
[0233]
cd8

til以hla限制性肽特异性方式扩增
[0234]
使用cd8

t细胞分离试剂盒(miltenyi biotec)通过负磁性选择将cd8

til纯化。用10μg/ml gp100肽将b*40:01
‑
人工apc脉冲处理6小时。接着将人工apc在200gy下照射，洗涤且以20:1的效应子与靶标(e:t)比率添加至til中。从第二天开始，每三天一次将10iu/ml il
‑
2(novartis)、10ng/ml il
‑
15(peprotech)和30ng/ml il
‑
21(peprotech)添加至培养物中。
[0235]
用经克隆的tcr转导的原代cd8

t细胞的扩增
[0236]
使用全t细胞分离试剂盒(miltenyi biotec)通过负磁性选择将cd3

t细胞纯化。以20:1的e:t比率用经200gy照射的人工apc/mokt3刺激经纯化的t细胞。从第二天开始，经由连续3天在32℃下在1,000g下离心1小时用经克隆的tcr基因逆转录病毒转导经活化的t细胞。在第二天，将100iu/ml il
‑
2和10ng/ml il
‑
15添加至tcr转导的t细胞中。每2
‑
3天补充一次培养基。
[0237]
基于人细胞的phla多聚体的产生
[0238]
将亲和力成熟的hla i类基因工程改造以带有在α2结构域的位置115的代替gln(q)残基的glu(e)残基和替代hla i类α3结构域的小鼠k
b
基因来源的α3结构域。通过使亲和力成熟的hla i类基因的细胞外结构域依次与gly
‑
ser(gs)柔性接头和6x his标签融合，产生了可溶性hla类别i
q115e
‑
k
b
基因。使用基于293gpg细胞的逆转录病毒系统用各种可溶性hla类别i
q115e
‑
k
b
基因以及β2m基因个别地转导hek293t细胞。使异位表达可溶性亲和力成熟的类别i
q115e
‑
k
b
的稳定hek293t细胞生长直至汇合，并且接着更换培养基。四十八小时后，收获条件培养基且即刻使用或冷冻直至使用。将由hek293t转染子产生的含有可溶性hla类别i
q115e
‑
k
b
的上清液与100
‑
1000μg/ml的目标i类限制性肽在37℃下混合过夜用于体外肽交换。以2:1摩尔比使用缀合至诸如藻红素(pe)的荧光染料的抗his mab(克隆ad1.1.10；abcam)将负载有肽的可溶性单聚类别i
q115e
‑
k
b
二聚化，在室温下持续2小时或在4℃下过夜。分别使用抗全i类mab(克隆w6/32，内部)和抗his标签生物素化mab(克隆ad1.1.10，r&dsystems)作为捕获和检测ab通过特异性elisa测量功能性可溶性hla类别i
q115e
‑
k
b
分子的浓度。
[0239]
phla多聚体染色
[0240]
在存在50nm达沙替尼(dasatinib)(lc laboratories)的情况下，将t细胞(1x 105)在37℃下孵育30分钟。接着将细胞洗涤且与5
‑
10μg/ml的多聚体一起在室温下孵育30分钟，并且在4℃下添加r
‑
藻红素缀合的affinipure fab片段山羊抗小鼠igg1(jackson immunoresearch laboratories)持续15分钟。接着，将细胞洗涤三次且在4℃下与抗cd8mab共染色15分钟。最后使用活/死可固定死细胞染色试剂盒辩别死细胞。
[0241]
统计分析
[0242]
使用graphpad prism 5.0e进行统计分析。为确定两个组的给定变量是否显著不同，使用韦尔奇氏t检验(welch’s t test)(双侧)进行分析。p值<0.05被视为显著的。