用于检测高级别鳞状上皮内病变的引物组合物的制作方法

1.本发明涉及用于检测高级别鳞状上皮内病变(hsil)和/或用于对人乳头瘤病毒(hpv)进行分型的引物组合物、试剂盒和方法。


背景技术：

2.人乳头瘤病毒(hpv)感染与宫颈癌(女性中最常见的癌症之一)和其它癌症的发展相关，所述其它癌症如肛门癌(linc等人，human papillomavirus types from infection to cancer in the anus，according to sex and hiv status：a systematic review and meta
‑
analysis.lancet infect dis，2018，18：198
‑
206)、以及头颈癌(chaturvedi ak等人，human papillomavirus and rising oropharyngeal cancer incidence in the united states.j clin oncol offj am soc clin oncol，2011，29：4294
‑
301)。hpv是负责所有宫颈癌的超过99％的致病因子(walboomers jm等人，human papillomavirus is a necessary cause of invasive cervical cancer worldwide.j pathol，1999，189：12
‑
9)。hpv是通常通过性接触传播的小的、无包膜的dna病毒，其感染基底细胞并在鳞状上皮细胞的核中复制。hpv包括特征在于其致癌潜力的多于200种基因型，其中高致癌性hpv类型(高风险hpv)具有驱动细胞增殖的独特能力(schiffman m等人，s.carcinogenic human papillomavirus infection.nat rev dis primer，2016，2：16086)。
3.乳头瘤病毒的基因组组构分成功能性早期和晚期区域。主要衍生自关于hpv16的认识的hpv感染模型，是在宫颈上皮中的基底细胞感染之后，早期hpv基因(e6、e7、e1、e2、e4和e5)表达，并且病毒dna从病毒dna的游离形式复制。随着细胞分裂，在上皮的上层，病毒基因组进一步复制，并且晚期基因(l1和l2)和e4表达。病毒脱落然后进一步启动新的感染(woodman cbj等人，the natural history of cervical hpv infection：unresolved issues.nat rev cancer，2007，7：11
‑
22)。
4.在宫颈癌的发展过程中的hpv感染与从生产性感染(其在大多数情况下将被免疫系统清除)向非生产性持续性和转化性感染(在少数情况下)的转变相关，所述非生产性持续性和转化性感染的特征在于e6和e7 mrna的高水平、以及e2和晚期基因例如l1的低表达(doorbar j等人，the biology and life
‑
cycle of human papillomaviruses.vaccine，2012，30 suppl 5：f55
‑
70，shulzhenko n等人m
é
nage
ꢀà
trois：an evolutionary interplay between human papillomavirus，a tumor，and a woman.trends microbiol，2014，22：345
‑
53)。高风险hpv感染可能导致低级别病变，具有高生产性感染和高速率的自发性消退。相比之下，高风险持续性hpv感染负责高级别病变，真正的癌前病变。
5.宫颈癌筛查允许在宫颈癌的发展之前癌前病变的检测和治疗。筛查基于不同的算法，一些允许hpv的检测，并且其它鉴定异常细胞。尽管高风险hpv在宫颈癌中的作用，但癌症或癌前病变的筛查测试在许多国家中仍然主要基于巴氏(pap)细胞学测试，并不包括分子病毒学测试(schiffman m等人2016)。这在很大程度上是由于当前分子测试的低阳性预测值(ppv)。事实上，由于大多数当前分子诊断方法依赖hpv基因组(dna)的检测，并未解决
病毒表达(rna)的模式，因此它们仍然是从宫颈的低级别鳞状上皮内病变(lsil)进化到高级别鳞状上皮内病变(hsil)的弱预测因子(tornesello ml等人，viral and cellular biomarkers in the diagnosis of cervical intraepithelial neoplasiaand cancer.biomed res int，2013，2013：519619)。另外，高风险hpv的dna鉴定并未完全预测癌症，因为仅持续多年的高风险hpv与癌症发展的风险增加相关(schiffman m等人2016)。因此，hpv dna测试作为筛查测定的使用当前在全世界不断增加，并且显示了对于hsil检测的高灵敏度(ogilvie gs等人effect of screening with primary cervical hpv testing vs cytology testing on high
‑
grade cervical intraepithelial neoplasia at 48 months：the hpv focal randomized clinical trial.jama，2018，320：43
‑
52)，但低ppv(cuzick j等人comparing the performance of six human papillomavirus tests in a screening population.br j cancer，2013，108：908
‑
13)。
6.hpv rna测试且特别是高风险hpv的e6和e7 mrna的表达已被提议作为更好的癌症发展的分子标记物，但e6和e7也在hpv瞬时感染期间表达，因此仍然难以定义与高级别病变和癌症的持续和进化相关的表达闽值。不存在与用于检测宫颈癌前病变的hpv dna测试和细胞学相比，hpv rna测试具有更好的诊断准确度的一致意见(virtanen e等人，performance of mrna
‑
and dna
‑
based high
‑
risk human papillomavirus assays in detection of high
‑
grade cervical lesions.acta obstet gynecol scand，2017，96：61
‑
8，cook da等人，aptima hpv assay versus hybrid2 hpv test for primary cervical cancer screening in the hpv focal trial.j clin virol off publ pan am soc clin virol，2017，87：23
‑
9，ge y等人，aptima human papillomavirus e6/e7 mrna test results strongly associated with risk for high
‑
grade cervical lesions in follow
‑
up biopsies.j low genit tract dis，2018，22：195
‑
200)。因此，需要新一代的分子诊断测试，其不仅可以检测hpv感染，而且具有准确地预测癌前阶段的能力，以提供更好且更节省成本的医疗益处(de thurah l等人，concordant testing results between various human papillomavirus assays in primary cervical cancer screening：systematic review.clin microbiol infect off publ eur soc clin microbiol infect dis，2018，24：29
‑
36，hawkes d等人，not all hpv nucleic acid tests are equal：only those calibrated to detect high grade lesions matter for cervical screening.clin microbiol infect off publ eur soc clin microbiol infect dis，2018，24：436
‑
7，de thurah l等人，not all hpv nucleic acid tests are equal：only those calibrated to detect high grade lesiohs matter for cervical screening：response to“concordant testing results between various human papillomavirus assays in primary cervical cancer screening：systematic review”published 27 may，2017.clin microbiol infect off publ eur soc clin microbiol infect dis，2018，24：438
‑
9)。


技术实现要素：

7.现在，利用下一代测序(ngs)技术，本发明人已开发了加上ngs分析的靶向病毒剪接点的多重扩增系统，其允许在一次反应中描述13种高风险hpv(hpv16、18、31、33、35、39、
45、51、52、56、58、59、66)加上3种假定的高风险hpv(hpv68、73、82)的转录物种类中的精细平衡。特别地，这种分子方法使得能够对hpv转录物的早期群体相对于晚期群体获取快照，并且基于反映病毒的生物学的读数组合定义模型，然后可以将其与病变的进化相关联。最终目标是替代在阴道镜检查前处于转化感染的风险中的女性分诊的传统方法。
8.基于对55个患者进行的研究，从在室温下保存的宫颈涂片开始，本发明人已显示了，本发明的方法可以用作高级别细胞学的标记物，具有令人鼓舞的作为分诊测试的诊断性能。
9.因此，本发明的一个主题是用于检测高级别鳞状上皮内病变(hsil)的引物组合物，其包含第一引物集合，称为剪接点引物集合，所述集合包含：
10.‑
具有选自seq id no：1
‑
2至seq id no：27
‑
28的核酸序列的hpv16特异性引物对的第一子集的至少2对引物；
11.和
12.‑
具有选自seq id no：29
‑
30至seq id no：63
‑
64的核酸序列的hpv18特异性引物对的第二子集的至少2对引物；
13.和
14.‑
具有选自seq id no：65
‑
66至seq id no：91
‑
92的核酸序列的hpv31特异性引物对的第三子集的至少2对引物；
15.和
16.‑
具有选自seq id no：93
‑
94至seq id no：117
‑
118的核酸序列的hpv33特异性引物对的第四子集的至少2对引物；
17.和
18.‑
具有选自seq id no：119
‑
120至seq id no：145
‑
146的核酸序列的hpv35特异性引物对的第五子集的至少2对引物；
19.和
20.‑
具有选自seq id no：147
‑
148至seq id no：165
‑
166的核酸序列的hpv39特异性引物对的第六子集的至少2对引物；
21.和
22.‑
具有选自seq id no：167
‑
168至seq id no：193
‑
194的核酸序列的hpv45特异性引物对的第七子集的至少2对引物；
23.和
24.‑
具有选自seq id no：195
‑
196至seq id no：213
‑
214的核酸序列的hpv51特异性引物对的第八子集的至少2对引物；
25.和
26.‑
具有选自seq id no：215
‑
216至seq id no：245
‑
246的核酸序列的hpv52特异性引物对的第九子集的至少2对引物；
27.和
28.‑
具有选自seq id no：247
‑
248至seq id no：277
‑
278的核酸序列的hpv56特异性引物对的第十子集的至少2对引物；
29.和
30.‑
具有选自seq id no：279
‑
280至seq id no：303
‑
304的核酸序列的hpv58特异性引物对的第十一子集的至少2对引物；
31.和
32.‑
具有选自seq id no：305
‑
306至seq id no：331
‑
332的核酸序列的hpv59特异性引物对的第十二子集的至少2对引物；
33.和
34.‑
具有选自seq id no：333
‑
334至seq id no：361
‑
362的核酸序列的hpv66特异性引物对的第十三子集的至少2对引物。
35.本发明的目的是显著地降低在多重系统中使用的引物数目。这种引物数目的降低可以通过降低所靶向的剪接点的数目和使用冗余核酸序列(redundant nucleic sequences)来完成。
36.因此，剪接点引物集合的引物的362种核酸序列是冗余的，并且实际上代表了165种独特的核酸序列。
37.本发明还涉及用于检测hsil的引物组合物，其包含引物对的第一集合，称为剪接点引物集合，所述集合包含：
38.‑
hpv16特异性引物对的第一子集的至少2对引物，所述hpv16特异性引物对能够产生具有选自seq id no：1501至seq id no：1514的核酸序列的扩增子；
39.和
40.‑
hpv18特异性引物对的第二子集的至少2对引物，所述hpv18特异性引物对能够产生具有选自seq id no：1515至seq id no：1532的核酸序列的扩增子；
41.和
42.‑
hpv31特异性引物对的第三子集的至少2对引物，所述hpv31特异性引物对能够产生具有选自seq id no：1533至seq id no：1546的核酸序列的扩增子；
43.和
44.‑
hpv33特异性引物对的第四子集的至少2对引物，所述hpv33特异性引物对能够产生具有选自seq id no：1547至seq id no：1559的核酸序列的扩增子；
45.和
46.‑
hpv35特异性引物对的第五子集的至少2对引物，所述hpv35特异性引物对能够产生具有选自seq id no：1560至seq id no：1573的核酸序列的扩增子；
47.和
48.‑
hpv39特异性引物对的第六子集的至少2对引物，所述hpv39特异性引物对能够产生具有选自seq id no：1574至seq id no：1583的核酸序列的扩增子；
49.和
50.‑
hpv45特异性引物对的第七子集的至少2对引物，所述hpv45特异性引物对能够产生具有选自seq id no：1584至seq id no：1597的核酸序列的扩增子；
51.和
52.‑
hpv51特异性引物对的第八子集的至少2对引物，所述hpv51特异性引物对能够产生具有选自seq id no：1598至seq id no：1607的核酸序列的扩增子；
53.和
54.‑
hpv52特异性引物对的第九子集的至少2对引物，所述hpv52特异性引物对能够产生具有选自seq id no：1608至seq id no：1623的核酸序列的扩增子；
55.和
56.‑
hpv56特异性引物对的第十子集的至少2对引物，所述hpv56特异性引物对能够产生具有选自seq id no：1624至seq id no：1639的核酸序列的扩增子；
57.和
58.‑
hpv58特异性引物对的第十一子集的至少2对引物，所述hpv58特异性引物对能够产生具有选自seq id no：1640至seq id no：1652的核酸序列的扩增子；
59.和
60.‑
hpv59特异性引物对的第十二子集的至少2对引物，所述hpv59特异性引物对能够产生具有选自seq id no：1653至seq id no：1666的核酸序列的扩增子；
61.和
62.‑
hpv66特异性引物对的第十三子集的至少2对引物，所述hpv66特异性引物对能够产生具有选自seq id no：1667至seq id no：1681的核酸序列的扩增子。
具体实施方式
63.定义
64.高风险hpv在本文中也称为hr
‑
hpv，指下述类型的hpv：hpv16、hpv18、hpv31、hpv33、hpv35、hpv39、hpv45、hpv51、hpv52、hpv56、hpv58、hpv59和hpv66。
65.本文中，假定的高风险hpv指下述类型的hpv：hpv68、hpv73和hpv82。
66.hsil指高级别鳞状上皮内病变。hsil可能是宫颈、肛门生殖器、头颈部hsil。优选地，hsil是宫颈hsil。
67.lsil指低级别鳞状上皮内病变。lsil可能是宫颈、肛门生殖器、头颈部lsil。优选地，lsil是宫颈lsil。
68.剪接点引物(splice junctions)集合在本文中指靶向高风险和任选地假定的高风险hpv剪接事件的引物集合，所述剪接事件涉及一对剪接供体(sd)和剪接受体(sa)位点。
69.非剪接点引物(unsplice junctions)集合在本文中指在不存在任何剪接事件的情况下，靶向跨越剪接供体或剪接受体位点的高风险和任选地假定的高风险hpv基因组区域的引物集合。在此上下文中，术语“接点(junction)”指外显子
‑
内含子界面(即在剪接事件的情况下，在其中将发现供体或受体位点的位置)。
70.基因组引物集合在本文中指靶向远离任何剪接供体或剪接受体位点的高风险和任选地假定的高风险hpv基因组区域的引物集合。
71.融合引物集合在本文中指靶向高风险和任选地假定的高风险hpv融合转录物的引物集合。
72.人引物集合在本文中指靶向人序列的引物集合。
73.hpv rna seq在本文中指与下一代测序分析偶联的多重扩增系统。
74.表述“选自由seq id no：x
‑
x 1至seq id no：x n
‑
x n 1组成的组的核酸序列”意指“选自由seq id no：x
‑
x 1、seq id no：x 2
‑
x 3、seq id no：x 4
‑
x 5....和seq id no：x n
‑
x n 1组成的组的核酸序列”。例如，选自由seq id no：1
‑
2至seq id no：5
‑
6组成的组的
核酸序列意指选自由seq id no：1
‑
2(引物对seq id no：1和seq id no：2)、seq id no：3
‑
4(引物对seq id no：3和seq id no：4)、以及seq id no：5
‑
6(引物对seq id no：5和seq id no：6)组成的组的核酸序列。
75.表述“选自由seq id no：x至seq id no：x n的组成的组核酸序列”意指“选自由seq id no：x，seq id no：x 1，seq id no：x 2...和seq id no：x n的组成的组核酸序列”。例如，选自由seq id no：1至seq id no：6组成的组的核酸序列意指选自由seq id no：1、seq id no：2、seq id no：3、seq id no：4、seq id no：5和seq id no：6组成的组的核酸序列。
76.如本文提及的生物样品包括但不限于哺乳动物体液，尤其是口腔液或刮片，生殖器刮片，特别是宫颈刮片。
77.由本发明包括的引物和扩增子并不限于下文描述的引物和扩增子中定义的序列。引物和扩增子可以包含与下文定义的引物和扩增子具有至少95％同一性的引物。引物还可以包含在5
′
端处的额外碱基。另外，引物应当理解为包含下文特征的引物的至少12、15、20或25个连续碱基的较短序列。在一些实施例中，应当理解，本发明还考虑了具有本文描述的引物的序列并且被直接或间接标记的通用探针。根据pcr扩增步骤的所需特异性和/或使用标准参数(例如核酸大小和gc含量、严格杂交条件和温度反应)的检测步骤的特异性，探针和引物可以从1延伸或转变(swifted)到15个碱基。例如，当需要获得关于一系列同源靶的广泛阳性结果时，使用低严格条件，而仅当特异性靶核酸存在于样品中时，高严格条件是优选的，以获得阳性结果。
78.如本文使用的，术语“严格杂交条件”指在其下引物或探针仅与精确互补的靶杂交的条件。杂交条件影响杂交体的稳定性，例如温度、盐浓度、ph、甲酰胺浓度等等。将这些条件优化，以使特异性结合达到最大，并且使引物或探针与其靶核酸序列的非特异性结合降到最低。严格条件是序列依赖性的，并且在不同情况下将是不同的。更长的序列在更高的温度下特异性杂交。一般地，严格条件选择为比特异性序列在限定的离子强度和ph下的热解链点(tm)低约5℃。tm是在其下50％的互补靶序列与完全匹配的探针或引物杂交的温度(在限定的离子强度和ph下)。通常，严格条件是这样的条件，其中盐浓度在ph 7.0至8.3下小于约1.0m na ，通常为约0.01至1.0m na 浓度(或其它盐)，并且温度对于短探针或引物(例如10至50个核苷酸)为至少约30℃且对于长探针或引物(例如大于50个核苷酸)为至少约60℃。还可以通过添加去稳定剂例如甲酰胺来实现严格条件。示例性的低严格条件包括在37℃下用20
‑
30％甲酰胺、1m nacl、1％sds的缓冲溶液的杂交，以及在40℃下在2*ssc中的洗涤。示例性的高严格条件包括在40
‑
50％甲酰胺、1m nacl、1％sds中在37℃下的杂交，以及在0.1*ssc中在60℃下的洗涤。与指定核酸有关的特定杂交条件的确定是常规的并且是本领域众所周知的，例如，如j.sambrook和d.w.russell，molecular cloning：a laboratory manual，cold spring harbor laboratory press；第3版，2001；以及f.m.ausubel，编辑，short protocols in molecular biology，current protocols；第5版，2002中描述的。
79.此外，为了改善与偶联的寡核苷酸的杂交，寡核苷酸含有“臂”和“间隔区”的碱基序列可能是有利的。实际上，臂的使用使得能够在与支持物的选定距离处结合引物，致使其与dna相互作用的条件得到改善。臂有利地由包含1至18个且优选6或12个(ch2)基团的线性碳链、以及允许与柱结合的胺组成。臂与寡核苷酸的磷酸酯或由不干扰杂交的碱基组成的
“
间隔区”相连。因此，“间隔区”可以包含嘌呤碱基。例如，“间隔区”可以包括序列gagg。臂有利地由包含6或12个碳原子的线性碳链组成。
80.为了实现本发明，可以使用不同类型的支持物。这些可以是散装或在柱中预包装的功能化的层析支持物，功能化的塑料表面或者磁性或以其它形式的功能化的乳胶珠。优选使用层析支持物。例如，能够使用的层析支持物是例如琼脂糖、丙烯酰胺或葡聚糖及其衍生物(如sephadex、sepharose、superose等)，聚合物如聚(苯乙烯/二乙烯基苯)，或者接枝或未接枝的二氧化硅。层析柱可以在扩散或灌注模式下操作。
81.如本文使用的，术语“测序”以广义使用，并且指技术人员已知的任何技术，包括但不限于桑格双脱氧终止测序、全基因组测序、杂交测序、焦磷酸测序、毛细管电泳、循环测序、单碱基延伸测序、固相测序、高通量测序、大规模平行标记测序(mpss)、可逆染料终止子测序、双端测序、近期测序(near
‑
term sequencing)、核酸外切酶测序、连接测序、短读测序、单分子测序、合成测序、实时测序、反向终止子测序、纳米孔测序、454测序、solexa genome analyzer测序、solid测序、ms
‑
pet测序、质谱法及其组合。在具体实施例中，本发明的方法和试剂盒适于在abi prism(r)377 dna sequencer，abi prism(r)310、3100、3100
‑
avant、3730或3730x1 genetic analyzer，abi prism(r)3700 dna analyzer，或applied biosystems solid(tm)system(全部来自applied biosystems)，genome sequencer 20 system(roche applied science)上运行。
82.对于本文所述的所有技术，虽然所述引物可以在溶液中使用，但在另一个实施例中，所述引物与固体支持物相连。
83.为了允许其与支持物的共价偶联，引物一般是功能化的。因此，它可以在5
′
或3
′
位置处通过硫醇、胺或羧基端基进行修饰。特别地，硫醇、胺或羧基的添加使得能够例如将寡核苷酸与支持物偶联，所述支持物荷有二硫化物、马来酰亚胺、胺、羧基、酯、环氧化物、溴化氰或醛官能团。这些偶联通过在引物和支持物之间建立二硫化物、硫醚、酯、酰胺或胺连接而形成。可以使用本领域技术人员已知的任何其它方法，例如双功能偶联剂。
84.此外，为了改善与偶联的寡核苷酸的杂交，寡核苷酸含有“臂”和“间隔区”的碱基序列可能是有利的。实际上，臂的使用使得能够在与支持物的选定距离处结合引物，致使其与dna相互作用的条件得到改善。臂有利地由包含1至18个且优选6或12个(ch2)基团的线性碳链、以及允许与柱结合的胺组成。臂与寡核苷酸的磷酸酯或由不干扰杂交的碱基组成的“间隔区”相连。因此，“间隔区”可以包含嘌呤碱基。例如，“间隔区”可以包括序列gagg。臂有利地由包含6或12个碳原子的线性碳链组成。
85.为了实现本发明，可以使用不同类型的支持物。这些可以是散装或在柱中预包装的功能化的层析支持物，功能化的塑料表面或者磁性或以其它形式的功能化的乳胶珠。优选使用层析支持物。例如，能够使用的层析支持物是例如琼脂糖、丙烯酰胺或葡聚糖及其衍生物(如sephadex、sepharose、superose等)，聚合物如聚(苯乙烯/二乙烯基苯)，或者接枝或未接枝的二氧化硅。层析柱可以在扩散或灌注模式下操作。
86.用于检测高级别鳞状上皮内病变的引物组合物
87.本发明涉及用于检测hsil的引物组合物，其包含第一引物集合，称为剪接点引物集合，所述集合包含：
88.‑
hpv16特异性引物对的第一子集的至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至
少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13或至少14对引物，或者2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14对引物，所述hpv16特异性引物对具有选自由以下项的组成的组核酸序列：seq id no：1
‑
2、seq id no：3
‑
4、seq id no：5
‑
6、seq id no：7
‑
8、seq id no：9
‑
10、seq id no：11
‑
12、seq id no：13
‑
14、seq id no：15
‑
16、seq id no：17
‑
18、seq id no：19
‑
20、seq id no：21
‑
22、seq id no：23
‑
24、seq id no：25
‑
26和seq id no：27
‑
28；
89.和
90.‑
hpv18特异性引物对的第二子集的至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17或至少18对引物，或者2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18对引物，所述hpv18特异性引物对具有选自由以下项组成的组的核酸序列：seq id no：29
‑
30、seq id no：31
‑
32、seq id no：33
‑
34、seq id no：35
‑
36、seq id no：37
‑
38、seq id no：39
‑
40、seq id no：41
‑
42、seq id no：43
‑
44、seq id no：45
‑
46、seq id no：47
‑
48、seq id no：49
‑
50、seq id no：51
‑
52、seq id no：53
‑
54、seq id no：55
‑
56、seq id no：57
‑
58、seq id no：59
‑
60、seq id no：61
‑
62和seq id no：63
‑
64；
91.和
92.‑
hpv31特异性引物对的第三子集的至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13或至少14对引物，或者2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14对引物，所述hpv31特异性引物对具有选自由以下项组成的组的核酸序列：seq id no：65
‑
66、seq id no：67
‑
68、seq id no：69
‑
70、seq id no：71
‑
72、seq id no：73
‑
74、seq id no：75
‑
76、seq id no：77
‑
78、seq id no：79
‑
80、seq id no：81
‑
82、seq id no：83
‑
84、seq id no：85
‑
86、seq id no：87
‑
88、seq id no：89
‑
90和seq id no：91
‑
92；
93.和
94.‑
hpv33特异性引物对的第四子集的至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12或至少13对引物，或者2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13对引物，所述hpv33特异性引物对具有选自由以下项组成的组的核酸序列：seq id no：93
‑
94、seq id no：95
‑
96、seq id no：97
‑
98、seq id no：99
‑
100、seq id no：101
‑
102、seq id no：103
‑
104、seq id no：105
‑
106、seq id no：107
‑
108、seq id no：109
‑
110、seq id no：111
‑
112、seq id no：113
‑
114、seq id no：115
‑
116和seq id no：117
‑
118；
95.和
96.‑
hpv35特异性引物对的第五子集的至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13或至少14对引物，或者2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14对引物，所述hpv35特异性引物对具有选自由以下项组成的组的核酸序列：seq id no：119
‑
120、seq id no：121
‑
122、seq id no：123
‑
124、seq id no：125
‑
126、seq id no：127
‑
128、seq id no：129
‑
130、seq id no：131
‑
132、seq id no：133
‑
134、seq id no：135
‑
136、seq id no：137
‑
138、seq id no：139
‑
140、seq id no：141
‑
142、seq id no：143
‑
144和seq id no：145
‑
146；
97.和
98.‑
hpv39特异性引物对的第六子集的至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9或至少10对引物，或者2、3、4、5、6、7、8、9或10对引物，所述hpv39特异性引物对具
有选自由以下项组成的组的核酸序列：seq id no：147
‑
148、seq id no：149
‑
150、seq id no：151
‑
152、seq id no：153
‑
154、seq id no：155
‑
156、seq id no：157
‑
158、seq id no：159
‑
160、seq id no：161
‑
162、seq id no：163
‑
164和seq id no：165
‑
166；
99.和
100.‑
hpv45特异性引物对的第七子集的至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13或至少14对引物，或者2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14对引物，所述hpv45特异性引物对具有选自由以下项组成的组的核酸序列：seq id no：167
‑
168、seq id no：169
‑
170、seq id no：171
‑
172、seq id no：173
‑
174、seq id no：175
‑
176、seq id no：177
‑
178、seq id no：179
‑
180、seq id no：181
‑
182、seq id no：183
‑
184、seq id no：185
‑
186、seq id no：187
‑
188、seq id no：189
‑
190、seq id no：191
‑
192和seq id no：193
‑
194；
101.和
102.‑
hpv51特异性引物对的第八子集的至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9或至少10对引物，或者2、3、4、5、6、7、8、9或10对引物，所述hpv51特异性引物对具有选自由以下项组成的组的核酸序列：seq id no：195
‑
196、seq id no：197
‑
198、seq id no：199
‑
200；seq id no：201
‑
202、seq id no：203
‑
204、seq id no：205
‑
206、seq id no：207
‑
208、seq id no：209
‑
210、seq id no：211
‑
212和seq id no：213
‑
214；
103.和
104.‑
hpv52特异性引物对的第九子集的至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15或至少16对引物，或者2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16对引物，所述hpv52特异性引物对具有选自由以下项组成的组的核酸序列：seq id no：215
‑
216、seq id no：217
‑
218、seq id no：219
‑
220、seq id no：221
‑
222、seq id no：223
‑
224、seq id no：225
‑
226、seq id no：227
‑
228、seq id no：229
‑
230、seq id no：231
‑
232、seq id no：233
‑
234、seq id no：235
‑
236、seq id no：237
‑
238、seq id no：239
‑
240seq id no：241
‑
242、seq id no：243
‑
244和seq id no：245
‑
246；
105.和
106.‑
hpv56特异性引物对的第十子集的至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15或至少16对引物，或者2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16对引物，所述hpv56特异性引物对具有选自由以下项组成的组的核酸序列：seq id no：247
‑
248、seq id no：249
‑
250、seq id no：251
‑
252、seq id no：253
‑
254、seq id no：255
‑
256、seq id no：257
‑
258、seq id no：259
‑
260、seq id no：261
‑
262、seq id no：263
‑
264、seq id no：265
‑
266、seq id no：267
‑
268、seq id no：269
‑
270、seq id no：271
‑
272、seq id no：273
‑
274、seq id no：275
‑
276和seq id no：277
‑
278；
107.和
108.‑
hpv58特异性引物对的第十一子集的至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12或至少13对引物，或者2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13对引物，所述hpv58特异性引物对具有选自由以下项组成的组的核酸序列：seq id no：279
‑
280、seq id no：281
‑
282、seq id no：283
‑
284、seq id no：285
‑
286、seq id no：287
‑
288、seq id no：289
‑
290、seq id no：291
‑
292、seq id no：293
‑
294、seq id no：295
‑
296、
seq id no：297
‑
298、seq id no：299
‑
300、seq id no：301
‑
302和seq id no：303
‑
304；
109.和
110.‑
hpv59特异性引物对的第十二子集的至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13或至少14对引物，或者2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14对引物，所述hpv59特异性引物对具有选自由以下项组成的组的核酸序列：seq id no：305
‑
306、seq id no：307
‑
308、seq id no：309
‑
310、seq id no：311
‑
312、seq id no：313
‑
314、seq id no：315
‑
316、seq id no：317
‑
318、seq id no：319
‑
320、seq id no：321
‑
322、seq id no：323
‑
324、seq id no：325
‑
326、seq id no：327
‑
328、seq id no：329
‑
330和seq id no：331
‑
332；
111.和
112.‑
hpv66特异性引物对的第十三子集的至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14或至少15对引物，或者2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15对引物，所述hpv66特异性引物对具有选自由以下项组成的组的核酸序列：seq id no：333
‑
334、seq id no：335
‑
336、seq id no：337
‑
338、seq id no：339
‑
340、seq id no：341
‑
342、seq id no：343
‑
344、seq id no：345
‑
346、seq id no：347
‑
348、seq id no：349
‑
350、seq id no：351
‑
352、seq id no：353
‑
354、seq id no：355
‑
356、seq id no：357
‑
358、seq id no：359
‑
360和seq id no：361
‑
362。
113.剪接点引物集合可以进一步包含：
114.‑
hpv68特异性引物对的第十四子集的至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9或至少10对引物，或者2、3、4、5、6、7、8、9或10对引物，所述hpv68特异性引物对具有选自由以下项组成的组的核酸序列：seq id no：363
‑
364、seq id no：365
‑
366、seq id no：367
‑
368、seq id no：369
‑
370、seq id no：371
‑
372、seq id no：373
‑
374、seq id no：375
‑
376、seq id no：377
‑
378、seq id no：379
‑
380和seq id no：381
‑
382；
115.和/或
116.‑
hpv73特异性引物对的第十五子集的至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12或至少13对引物，或者2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13对引物，所述hpv73特异性引物对具有选自由以下项组成的组的核酸序列：seq id no：383
‑
384、seq id no：385
‑
386、seq id no：387
‑
388、seq id no：389
‑
390seq id no：391
‑
392、seq id no：393
‑
394、seq id no：395
‑
396、seq id no：397
‑
398、seq id no：399
‑
400、seq id no：401
‑
402、seq id no：403
‑
404、seq id no：405
‑
406和seq id no：407
‑
408；
117.和/或
118.‑
hpv82特异性引物对的第十六子集的至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10或至少11对引物，或者2、3、4、5、6、7、8、9、10或11对引物，所述hpv82特异性引物对具有选自由以下项组成的组的核酸序列：seq id no：409
‑
410、seq id no：411
‑
412、seq id no：413
‑
414、seq id no：415
‑
416、seq id no：417
‑
418、seq id no：419
‑
420、seq id no：421
‑
422、seq id no：423
‑
424、seq id no：425
‑
426、seq id no：427
‑
428和seq id no：429
‑
430。
119.这些另外的引物对子集对应于假定的高风险hpv：hpv68、hpv73和hpv82。
120.用于检测hsil的引物组合物可以包含剪接点集合，其包含如上文定义的剪接点引
物集合的引物对的第一子集至第十三子集各自的至少10对引物、以及任选地如上文定义的剪接点引物集合的引物对的第十四子集和/或第十五子集和/或第十六子集的至少10对引物。
121.用于检测hsil的引物组合物可以包含剪接点集合，其包含如上文定义的剪接点引物集合的引物对的第一子集至第十三子集各自的2、3、4、5、6、7、8、9或更优选10对引物、以及任选地如上文定义的剪接点引物集合的引物对的第十四子集和/或第十五子集和/或第十六子集的2、3、4、5、6、7、8、9或更优选10对引物。
122.用于检测hsil的引物组合物可以包含剪接点集合，其由如上文定义的剪接点引物集合的引物对的第一子集至第十三子集各自的2、3、4、5、6、7、8、9或更优选10对引物组成、以及任选地由如上文定义的剪接点引物集合的引物对的第十四子集和/或第十五子集和/或第十六子集的2、3、4、5、6、7、8、9或更优选10对引物组成。
123.在一个实施例中，根据本发明的用于检测hsil的引物组合物包含具有以下核酸序列的引物对：seq id no：1
‑
2至seq id no：361
‑
362、以及任选地seq id no：363
‑
364至seq id no：381
‑
382和/或seq id no：383
‑
384至seq id no：385
‑
386和/或seq id no：387
‑
388至seq id no：429
‑
430。
124.在一个优选的实施例中，根据本发明的用于检测hsil的引物组合物包含具有核酸序列seq id no：1
‑
2至seq id no：429
‑
430的引物对。
125.在一个实施例中，用于检测hsil的引物组合物由具有以下核酸序列的引物对组成：seq id no：1
‑
2至seq id no：361
‑
362、以及任选地seq id no：363
‑
364至seq id no：381
‑
382和/或seq id no：383
‑
384至seq id no：385
‑
386和/或seq id no：387
‑
388至seq id no：429
‑
430。
126.在一个优选的实施例中，根据本发明的用于检测hsil的引物组合物由具有核酸序列seq id no：1
‑
2至seq id no：429
‑
430的引物对组成。
127.本发明的剪接点引物集合可以由如上文定义的构成其的引物对的核酸序列，或通过如下文定义的由构成其的引物对产生的扩增子的核酸序列进行限定。
128.如上文定义的构成剪接点引物集合的引物对对应于如下文定义的通过构成剪接点引物集合的引物对产生的扩增子。在表2abis中给出了引物对与其对应的扩增子之间的对应关系。
129.本发明还涉及用于检测hsil的引物组合物，其包含引物对的第一集合，称为剪接点引物集合，所述集合包含：
130.‑
hpv16特异性引物对的第一子集的至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13或至少14对引物，或者2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14对引物，所述hpv16特异性引物对能够产生具有选自由以下项组成的组的核酸序列的扩增子：seq id no：1501、seq id no：1502、seq id no：1503、seq id no：1504、seq id no：1505、seq id no：1506、seq id no：1507、seq id no：1508、seq id no：1509、seq id no：1510、seq id no：1511、seq id no：1512、seq id no：1513和seq id no：1514；
131.和
132.‑
hpv18特异性引物对的第二子集的至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17或至少18对引
物，或者2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18对引物，所述hpv18特异性引物对能够产生具有选自由以下项组成的组的核酸序列的扩增子：seq id no：1515、seq id no：1516、seq id no：1517、seq id no：1518、seq id no：1519、seq id no：1520、seq id no：1521、seq id no：1522、seq id no：1523、seq id no：1524、seq id no：1525、seq id no：1526、seq id no：1527、seq id no：1528、seq id no：1529、seq id no：1530、seq id no：1531和seq id no：1532；
133.和
134.‑
hpv31特异性引物对的第三子集的至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13或至少14对引物，或者2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14对引物，所述hpv31特异性引物对能够产生具有选自由以下项组成的组的核酸序列的扩增子：seq id no：1533、seq id no：1534、seq id no：1535、seq id no：1536、seq id no：1537、seq id no：1538、seq id no：1539、seq id no：1540、seq id no：1541、seq id no：1542、seq id no：1543、seq id no：1544、seq id no：154和seq id no：1546；
135.和
136.‑
hpv33特异性引物对的第四子集的至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12或至少13对引物，或者2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13对引物，所述hpv33特异性引物对能够产生具有选自由以下项组成的组的核酸序列的扩增子：seq id no：1547、seq id no：1548、seq id no：1549、seq id no：1550、seq id no：1551、seq id no：1552、seq id no：1553、seq id no：1554、seq id no：1555、seq id no：1556、seq id no：1557、seq id no：1558和seq id no：1559；
137.和
138.‑
hpv35特异性引物对的第五子集的至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13或至少14对引物，或者2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14对引物，所述hpv35特异性引物对能够产生具有选自由以下项组成的组的核酸序列的扩增子：seq id no：1560、seq id no：1561、seq id no：1562、seq id no：1563、seq id no：1564、seq id no：1565、seq id no：1566、seq id no：1567、seq id no：1568、seq id no：1569、seq id no：1570、seq id no：1571、seq id no：1572和seq id no：1573；
139.和
140.‑
hpv39特异性引物对的第六子集的至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9或至少10对引物，或者2、3、4、5、6、7、8、9或10对引物，所述hpv39特异性引物对能够产生具有选自由以下项组成的组的核酸序列的扩增子：seq id no：1574、seq id no：1575、seq id no：1576、seq id no：1577、seq id no：1578、seq id no：1579、seq id no：1580、seq id no：1581、seq id no：1582和seq id no：1583；
141.和
142.‑
hpv45特异性引物对的第七子集的至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13或至少14对引物，或者2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14对引物，所述hpv45特异性引物对能够产生具有选自由以下项组成的组的核酸序列的扩增子：seq id no：1584、seq id no：1585、seq id no：1586、seq id no：1587、seq id no：1588、seq id no：1589、seq id no：1590、seq id no：1591、seq id no：1592、
seq id no：1593、seq id no：1594、seq id no：1595、seq id no：1596和seq id no：1597；
143.和
144.‑
hpv51特异性引物对的第八子集的至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9或至少10对引物，或者2、3、4、5、6、7、8、9或10对引物，所述hpv51特异性引物对能够产生具有选自由以下项组成的组的核酸序列的扩增子：seq id no：1598、seq id no：1599、seq id no：1600、seq id no：1601、seq id no：1602、seq id no：1603、seq id no：1604、seq id no：1605、seq id no：1606和seq id no：1607；
145.和
146.‑
hpv52特异性引物对的第九子集的至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15或至少16对引物，或者2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16对引物，所述hpv52特异性引物对能够产生具有选自由以下项组成的组的核酸序列的扩增子：seq id no：1608、seq id no：1609、seq id no：1610、seq id no：1611、seq id no：1612、seq id no：1613、seq id no：1614、seq id no：1615、seq id no：1616、seq id no：1617、seq id no：1618、seq id no：1619、seq id no：1620、seq id no：1621、seq id no：1622和seq id no：1623；
147.和
148.‑
hpv56特异性引物对的第十子集的至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15或至少16对引物，或者2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16对引物，所述hpv56特异性引物对能够产生具有选自由以下项组成的组的核酸序列的扩增子：seq id no：1624、seq id no：1625、seq id no：1626、seq id no：1627、seq id no：1628、seq id no：1629、seq id no：1630、seq id no：1631、seq id no：1632、seq id no：1633、seq id no：1634、seq id no：1635、seq id no：1636、seq id no：1637、seq id no：1638和seq id no：1639；
149.和
150.‑
hpv58特异性引物对的第十一子集的至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12或至少13对引物，或者2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13对引物，所述hpv58特异性引物对能够产生具有选自由以下项组成的组的核酸序列的扩增子：seq id no：1640、seq id no：1641、seq id no：1642、seq id no：1643、seq id no：1644、seq id no：1645、seq id no：1646、seq id no：1647、seq id no：1648、seq id no：1649、seq id no：1650、seq id no：1651和seq id no：1652；
151.和
152.‑
hpv59特异性引物对的第十二子集的至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13或至少14对引物，或者2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14对引物，所述hpv59特异性引物对能够产生具有选自由以下项组成的组的核酸序列的扩增子：seq id no：1653、seq id no：1654、seq id no：1655、seq id no：1656、seq id no：1657、seq id no：1658、seq id no：1659、seq id no：1660、seq id no：1661、seq id no：1662、seq id no：1663、seq id no：1664、seq id no：1665和seq id no：1666；
153.和
154.‑
hpv66特异性引物对的第十三子集的至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、
至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14或至少15对引物，或者2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15对引物，所述hpv66特异性引物对能够产生具有选自由以下项组成的组的核酸序列的扩增子：seq id no：1667、seq id no：1668、seq id no：1669、seq id no：1670、seq id no：1671、seq id no：1672、seq id no：1673、seq id no：1674、seq id no：1675、seq id no：1676、seq id no：1677、seq id no：1678、seq id no：1679、seq id no：1680和seq id no：1681。
155.剪接点引物集合可以进一步包含：
156.‑
hpv68特异性引物对的第十四子集的至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9或至少10对引物，或者2、3、4、5、6、7、8、9或10对引物，所述hpv68特异性引物对能够产生具有选自由以下项组成的组的核酸序列的扩增子：seq id no：1682、seq id no：1683、seq id no：1684、seq id no：1685、seq id no：1686、seq id no：1687、seq id no：1688、seq id no：1689、seq id no：1690和seq id no：1691；
157.和/或
158.‑
hpv73特异性引物对的第十五子集的至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12或至少13、至少14、至少15、至少16、至少17或至少18对引物，或者2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18对引物，所述hpv73特异性引物对能够产生具有选自由以下项组成的组的核酸序列的扩增子：seq id no：1692、seq id no：1693、seq id no：1694、seq id no：1695、seq id no：1696、seq id no：1697、seq id no：1698、seq id no：1699、seq id no：1700、seq id no：1701、seq id no：1702、seq id no：1703和seq id no：1704；
159.和/或
160.‑
hpv82特异性引物对的第十六子集的至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10或至少11，或者2、3、4、5、6、7、8、9、10或11对引物对引物，所述hpv82特异性引物对能够产生具有选自由以下项组成的组的核酸序列的扩增子：seq id no：1705、seq id no：1706、seq id no：1707、seq id no：1708、seq id no：1709、seq id no：1710、seq id no：1711、seq id no：1712、seq id no：1713、seq id no：1714和seq id no：1715。
161.用于检测hsil的引物组合物可以包含剪接点引物集合，其包含如上文定义的剪接点引物集合的引物对的第一子集至第十三子集各自的至少10对引物、以及任选地如上文定义的剪接点引物集合的引物对的第十四子集和/或第十五子集和/或第十六子集的至少10对引物。
162.用于检测hsil的引物组合物可以包含剪接点引物集合，其包含如上文定义的剪接点引物集合的引物对的第一子集至第十三子集各自的2、3、4、5、6、7、8、9或更优选10对引物、以及任选地如上文定义的剪接点引物集合的引物对的第十四子集和/或第十五子集和/或第十六子集的2、3、4、5、6、7、8、9或更优选10对引物。
163.用于检测hsil的引物组合物可以包含剪接点引物集合，其由如上文定义的剪接点引物集合的引物对的第一子集至第十三子集各自的2、3、4、5、6、7、8、9或更优选10对引物组成、以及任选地由如上文定义的剪接点引物集合的引物对的第十四子集和/或第十五子集和/或第十六子集的2、3、4、5、6、7、8、9或更优选10对引物组成。
164.在一个实施例中，根据本发明的用于检测hsil的引物组合物包含剪接点引物集
合，其包含能够产生具有以下核酸序列的扩增子的引物对：seq id no：1501至seq id no：1681、以及任选地seq id no：1682至seq id no：1691和/或seq id no：1692至seq id no：1704和/或seq id no：1705至seq id no：1715。
165.在一个优选的实施例中，根据本发明的用于检测hsil的引物组合物包含剪接点引物集合，其包含能够产生具有核酸序列seq id no：1501至seq id no：1715的扩增子的引物对。
166.在一个实施例中，引物组合物由剪接点引物集合组成，所述剪接点引物集合由具有以下核酸序列的引物对组成：seq id no：1501至seq id no：1681，以及任选地seq id no：1682至seq id no：1691和/或seq id no：1692至seq id no：1704和/或seq id no：1705至seq id no：1715。
167.在一个优选的实施例中，根据本发明的用于检测hsil的引物组合物由剪接点引物集合组成，所述剪接点引物集合由能够产生具有核酸序列seq id no：1501至seq id no：1715的扩增子的引物对组成。
168.在一个实施例中，用于检测hsil的引物组合物不包含选自非剪接点引物集合、基因组引物集合和融合引物集合的另外的引物集合。特别地，用于检测hsil的引物组合物可以不包含非剪接点引物集合、基因组引物集合和融合引物集合。
169.在一个实施例中，用于检测hsil的引物组合物包含人引物集合。人引物集合的引物靶向人序列。
170.人引物集合可以用作内部对照。
171.人引物集合可以包含具有选自由以下项组成的组的核酸序列的至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29或至少30对引物，或者1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、2l、22、23、24、25、26、27、28、29或30对引物：seq id no：1441
‑
1442、seq id no：1443
‑
1444、seq id no：1445
‑
1446、seq id no：1447
‑
1448、seq id no：1449
‑
1450、seq id no：1451
‑
1452、seq id no：1453
‑
1454、seq id no：1455
‑
1456、seq id no：1457
‑
1458、seq id no：1459
‑
1460、seq id no：1461
‑
1462、seq id no：1463
‑
1464、seq id no：1465
‑
1466、seq id no：1467
‑
1468、seq id no：1469
‑
1470、seq id no：1471
‑
1472、seq id no：1473
‑
1474、seq id no：1475
‑
1476、seq id no：1477
‑
1478、seq id no：1479
‑
1480、seq id no：1481
‑
1482、seq id no：1483
‑
1484、seq id no：1485
‑
1486、seq id no：1487
‑
1488、seq id no：1489
‑
1490、seq id no：1491
‑
1492、seq id no：1493
‑
1494、seq id no：1495
‑
1496、seq id no：1497
‑
1498和seq id no：1499
‑
1500。
172.在一个优选实施例中，人引物集合包含seq id no：1441
‑
1442至seq id no：1499
‑
1500。
173.在一个更优选的实施例中，人引物集合由seq id no：1441
‑
1442至seq id no：1499
‑
1500组成。
174.人引物集合可以包含具有选自由seq id no：2221至seq id no：2250组成的组的核酸序列的至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少
23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29或至少30对引物，或者2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30对引物。
175.在一个优选的实施例中，人引物集合包括能够产生具有核酸序列seq id no：2221至seq id no：2250的扩增子的引物对。
176.在一个更优选的实施例中，人引物集合由能够产生具有核酸序列seq id no：2221至seq id no：2250的扩增子的引物对组成。
177.在一个实施例中，用于检测hsil的引物组合物还可以包含融合引物集合。融合引物集合的引物靶向高风险和任选地假定的高风险hpv融合转录物。
178.融合引物集合的引物可以包含：
179.‑
hpv16特异性引物对的第一子集的至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17或至少18对引物，或者1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18对引物，所述hpv16特异性引物对具有选自由seq id no：865
‑
866至seq id no：899
‑
900组成的组的核酸序列；
180.‑
hpv18特异性引物对的第二子集的至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17或至少18对引物，或者1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18对引物，所述hpv18特异性引物对具有选自由seq id no：901
‑
902至seq id no：935
‑
936组成的组的核酸序列；
181.‑
hpv31特异性引物对的第三子集的至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17或至少18对引物，或者1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18对引物，所述hpv31特异性引物对具有选自由seq id no：937
‑
938至seq id no：971
‑
972组成的组的核酸序列；
182.‑
hpv33特异性引物对的第四子集的至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17或至少18对引物，或者1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18对引物，所述hpv33特异性引物对具有选自由seq id no：973
‑
974至seq id no：1007
‑
1008组成的组的核酸序列；
183.‑
hpv35特异性引物对的第五子集的至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17或至少18对引物，或者1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18对引物，所述hpv35特异性引物对具有选自由seq id no：1009
‑
1010至seq id no：1043
‑
1044组成的组的核酸序列；
184.‑
hpv39特异性引物对的第六子集的至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17或至少18对引物，或者1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18对引物，所述hpv39特异性引物对具有选自由seq id no：1045
‑
1046至seq id no：1079
‑
1080组成的组的核酸序列；
185.‑
hpv45特异性引物对的第七子集的至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、优选至少17、更优选18对引物，或者1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18对引物，所述hpv45特异性引物对具有选自由seq id no：1081
‑
1082至seq id no：1115
‑
1116组成的组的
核酸序列。
186.‑
hpv51特异性引物对的第八子集的至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17或至少18对引物，或者1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18对引物，所述hpv51特异性引物对具有选自由seq id no：1117
‑
1118至seq id no：1151
‑
1152组成的组的核酸序列；
187.‑
hpv52特异性引物对的第九子集的至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17或至少18对引物，或者1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18对引物，所述hpv52特异性引物对具有选自seq id no：1153
‑
1154至seq id no：1187
‑
1188组成的组的核酸序列；
188.‑
hpv56特异性引物对的第十子集的至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17或至少18对引物，或者1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18对引物，所述hpv56特异性引物对具有选自由seq id no：1189
‑
1190至seq id no：1223
‑
1224组成的组的核酸序列；
189.‑
hpv58特异性引物对的第十一子集的至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17或至少18对引物，或者1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18对引物，所述hpv58特异性引物对具有选自seq id no：1225
‑
1226至seq id no：1259
‑
1260组成的组的核酸序列；
190.‑
hpv59特异性引物对的第十二子集的至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17或至少18对引物，或者1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18对引物，所述hpv59特异性引物对具有选自由seq id no：1261
‑
1262至seq id no：1295
‑
1296组成的组的核酸序列；
191.‑
hpv66特异性引物对的第十三子集的至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17或至少18对引物，或者1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18对引物，所述hpv66特异性引物对具有选自由seq id no：1297
‑
1298至seq id no：1331
‑
1332组成的组的核酸序列。
192.融合引物集合可以进一步包含：
193.‑
hpv68特异性引物对的第十四子集的至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17或至少18对引物，或者1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18对引物，所述hpv68特异性引物对具有选自由seq id no：1333
‑
1334至seq id no：1367
‑
1368组成的组的核酸序列；
194.‑
hpv73特异性引物对的第十五子集的至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17或至少18对引物，或者1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18对引物，所述hpv73
特异性引物对具有选自由seq id no：1369
‑
1370至seq id no：1403
‑
1404组成的组的核酸序列；
195.‑
hpv82特异性引物对的第十六子集的至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17或至少18对引物，或者1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18对引物，所述hpv82特异性引物对具有选自由seq id no：1405
‑
1406至seq id no：1439
‑
1440组成的组的核酸序列。
196.在一个实施例中，融合引物集合包含具有以下核酸序列的引物对：seq id no：865
‑
866至seq id no：1331
‑
1332，以及任选地seq id no：1333
‑
1334至seq id no：1367
‑
1368和/或seq id no：1369
‑
1370至seq id no：1403
‑
1404和/或seq id no：1405
‑
1406至seq id no：1439
‑
1440。
197.在一个优选的实施例中，融合引物集合包含具有核酸序列seq id no：865
‑
866至seq id no：1439
‑
1440的引物对。
198.在一个实施例中，融合引物集合由具有以下核酸序列的引物对组成：seq id no：865
‑
866至seq id no：1331
‑
1332，以及任选地seq id no：1333
‑
1334至seq id no：1367
‑
1368和/或seq id no：1369
‑
1370至seq id no：1403
‑
1404和/或seq id no：1405
‑
1406至seq id no：1439
‑
1440。
199.在一个优选的实施例中，融合引物集合由具有核酸序列seq id no：865
‑
866至seq id no：1439
‑
1440的引物对组成。
200.融合引物集合的引物可以包含：
201.‑
hpv16特异性引物对的第一子集的至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17或至少18对引物，或者1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18对引物，所述hpv16特异性引物对能够产生具有选自由seq id no：1933至seq id no：1950组成的组的核酸序列的扩增子；
202.‑
hpv18特异性引物对的第二子集的至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17或至少18对引物，或者1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18对引物，所述hpv18特异性引物对能够产生具有选自由seq id no：1951至seq id no：1968组成的组的核酸序列的扩增子；
203.‑
hpv31特异性引物对的第三子集的至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17或至少18对引物，或者1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18对引物，所述hpv31特异性引物对能够产生具有选自由seq id no：1969至seq id no：1986组成的组的核酸序列的扩增子；
204.‑
hpv33特异性引物对的第四子集的至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17或至少18对引物，或者1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18对引物，所述hpv33特异性引物对能够产生具有选自由seq id no：1987至seq id no：2004组成的组的核酸序列
的扩增子；
205.‑
hpv35特异性引物对的第五子集的至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17或至少18对引物，或者1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18对引物，所述hpv35特异性引物对能够产生具有选自由seq id no：2005至seq id no：2022组成的组的核酸序列的扩增子；
206.‑
hpv39特异性引物对的第六子集的至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17或至少18对引物，或者1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18对引物，所述hpv39特异性引物对能够产生具有选自由seq id no：2023至seq id no：2040组成的组的核酸序列的扩增子；
207.‑
hpv45特异性引物对的第七子集的至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17或至少18对引物，或者1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18对引物，所述hpv45特异性引物对选自由seq id no：2041至seq id no：2058组成的组，
208.‑
hpv51特异性引物对的第八子集的至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17或至少18对引物，或者1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18对引物，所述hpv51特异性引物对能够产生具有选自seq id no：2059至seq id no：2076组成的组的核酸序列的扩增子，
209.‑
hpv52特异性引物对的第九子集的至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17或至少18对引物，或者1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18对引物，所述hpv52特异性引物对能够产生具有选自由seq id no：2077至seq id no：2094组成的组的核酸序列的扩增子，
210.‑
hpv56特异性引物对的第十子集的至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17或至少18对引物，或者1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18对引物，所述hpv56特异性引物对能够产生具有选自由seq id no：2095至seq id no：2112组成的组的核酸序列的扩增子，
211.‑
hpv58特异性引物对的第十一子集的至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17或至少18对引物，或者1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18对引物，所述hpv58特异性引物对能够产生具有选自由seq id no：2113至seq id no：2130组成的组的核酸序列的扩增子，
212.‑
hpv59特异性引物对的第十二子集的至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17或至少18对引物，或者1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18对引物，所述hpv59特异性引物对能够产生具有选自由seq id no：2131至seq id no：2148组成的组的核酸序
列的扩增子，
213.‑
hpv66特异性引物对的第十三子集的至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17或至少18对引物，或者1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18对引物，所述hpv66特异性引物对能够产生具有选自由seq id no：2149至seq id no：2166组成的组的核酸序列的扩增子。
214.融合集合还可以包含：
215.‑
hpv68特异性引物对的第十四子集的至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17或至少18对引物，或者1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18对引物，所述hpv68特异性引物对能够产生具有选自由seq id no：2167至seq id no：2184组成的组的核酸序列的扩增子，和/或
216.‑
hpv73特异性引物对的第十五子集的至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17或至少18对引物，或者1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18对引物，所述hpv73特异性引物对能够产生具有选自由seq id no：2185至seq id no：2202组成的组的核酸序列的扩增子，和/或
217.‑
hpv82特异性引物对的第十六子集的至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17或至少18对引物，或者1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18对引物，所述hpv82特异性引物对能够产生具有选自由seq id no：2203至seq id no：2220组成的组的核酸序列的扩增子。
218.在一个实施例中，融合引物集合包含具有以下核酸序列的引物对：seq id no：1933至seq id no：2166，以及任选地seq id no：2167至seq id no：2184和/或seq id no：2185至seq id no：2202和/或seq id no：2203至seq id no：2220。
219.在一个优选的实施例中，融合引物集合包含能够产生具有核酸序列seq id no：1869至seq id no：2220的扩增子的引物对。
220.在一个实施例中，融合引物集合由能够产生具有以下核酸序列的扩增子的引物对组成：seq id no：1933至seq id no：2166，以及任选地seq id no：2167至seq id no：2184和/或seq id no：2185至seq id no：2202和/或seq id no：2203至seq id no：2220。
221.在一个优选的实施例中，融合引物集合由能够产生具有核酸序列seq id no：1869至seq id no：2220的扩增子的引物对组成。
222.本发明还涉及用于检测hsil的试剂盒，其包含本发明的用于检测hsil的引物组合物以及任选地用于cdna扩增的试剂。可用于该目的的试剂是本领域众所周知的，并且包括dna聚合酶、用于酶的缓冲液、去污剂、增强剂。本发明的试剂盒还可以包含用于逆转录和/或用于测序的试剂。在本发明的试剂盒的一些优选实施例中，引物以及任选的试剂呈冻干形式以允许环境贮存。试剂盒的组分一起包装到适合于核酸扩增的各种容器的任一种内，所述容器例如板、载玻片、孔、盘、珠、颗粒、杯、链、芯片、条及其它。试剂盒任选地包括用于执行本发明的方法的至少一个具体实施例的说明书。在一些有利的实施例中，试剂盒包含
微孔板或微管，优选以干燥的形式，即，其中板或微管的孔包含至少含有引物的干燥组合物，并且优选进一步包含用于逆转录、cdna扩增或测序的所有试剂。
223.本发明还涉及本发明的用于检测hsil的引物组合物或本发明的用于检测hsil的试剂盒的用途。
224.用于检测生物样品中的hsil的体外方法
225.本发明还涉及用于检测生物样品中的hsil的体外方法，其包括以下步骤：
226.‑
(a)从生物样品中提取rna，
227.‑
(b)将rna逆转录，以便生成cdna，
228.‑
(c)用本发明的引物组合物扩增步骤(b)生成的cdna，以便产生扩增子，
229.‑
(d)对步骤(c)产生的每个扩增子的表达水平进行定量，
230.‑
(e)基于步骤(d)定量的扩增子的表达水平，确定生物样品是否包含hsil。
231.优选地，对每个扩增子的表达水平进行定量的步骤(d)通过测序进行。
232.对每个扩增子的表达水平进行定量的步骤(d)可以包括以下步骤：
233.‑
(d1)对扩增子进行测序，以便生成读数(reads)，
234.‑
(d2)将读数与相应扩增子的序列比对，
235.‑
(d3)对于每个扩增子，定量对应于所述扩增子的序列的读数。
236.对每个扩增子的表达水平进行定量可以使用扩增子的部分消化(digestion)来进行。如此，对每个扩增子的表达水平进行定量的步骤(d)可以包括以下步骤：
237.‑
(d1)使扩增子部分消化，以便生成片段，
238.‑
(d2)对在步骤(d1)处产生的片段进行测序，以便生成读数，
239.‑
(d3)将读数与相应扩增子的序列比对，
240.‑
(d4)对于每个扩增子，定量对应于所述扩增子的序列的读数。
241.在一个优选的实施例中，确定生物样品是否包含hsil的步骤包括以下步骤：基于步骤(d)中定量的所述hpv类型特异性的扩增子的表达水平，确定生物样品是否包含对应于本文定义的一种hpv类型的hsil。在该实施例中，对于每种hpv类型进行确定生物样品是否包含hsil的步骤。因此，对于每种hpv类型，分析对应于该hpv类型的扩增子的表达水平，并且确定生物样品是否包含对应于该hpv类型的hsil。如果确定生物样品包含对应于至少一种hpv类型的hsil，则将生物样品分类为包含hsil。
242.优选地，确定生物样品是否包含hsil的步骤通过使用逻辑回归分析来进行，其中变量取决于定量的扩增子表达水平。
243.因此，确定生物样品是否包含hsil的步骤可以包括：
244.‑
对于选自由hpv16、hpv18、hpv31、hpv33、hpv35、hpv39、hpv45、hpv51、hpv52、hpv56、hpv58、hpv59和hpv66以及任选地hpv68和/或hpv73和/或hpv82组成的组的每种类型的hpv，使用下式计算生物样品包含hpv
j
类型的hsil的概率p
hpvj
的步骤，其中j＝16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68、73和/或82：
[0245][0246]
其中：
[0247]
β
o
是截距(intercept)，
[0248]
β
i
是对应于给定剪接点的系数，称为剪接点i，
[0249]
x
ij
是取决于对应于hpv
j
的剪接点i的扩增子的定量表达水平的变量，
[0250]
其中如果一个p
hpvj
高于0.5，则它指示生物样品中hpv
j
hsil的存在。
[0251]
在一个优选的实施例中，对应于剪接点i＝1的扩增子分别为：
[0252]
对应于剪接点i＝1的扩增子分别为关于hpv16的seq id no：1501、关于hpv18的seq id no：1515、关于hpv31的seq id no：1533、关于hpv33的seq id no：1547、关于hpv35的seq id no：1560、关于hpv39的seq id no：1574、关于hpv45的seq id no：1584、关于hpv51的seq id no：1598、关于hpv52的seq id no：1608、关于hpv56的seq id no：1624、关于hpv58的seq id no：1640、关于hpv59的seq id no：1653、关于hpv66的seq id no：1667、关于hpv68的seq id no：1682、关于hpv73的seq id no：1692和关于hpv82的seq id no：1705，
[0253]
对应于剪接点i＝2的扩增子分别为关于hpv16的seq id no：1502、关于hpv18的seq id no：1516、关于hpv31的seq id no：1534、关于hpv33的seq id no：1548、关于hpv35的seq id no：1561、关于hpv39不存在、关于hpv45的seq id no：1585、关于hpv51不存在、关于hpv52的seq id no：1609、关于hpv56的seq id no：1625、关于hpv58的seq id no：1641、关于hpv59的seq id no：1654、关于hpv66的seq id no：1668、关于hpv68不存在、关于hpv73不存在和关于hpv82不存在，
[0254]
对应于剪接点i＝3的扩增子分别为关于hpv16的seq id no：1503、关于hpv18的seq id no：1517、关于hpv31的seq id no：1535、关于hpv33的seq id no：1549、关于hpv35的seq id no：1562、关于hpv39不存在、关于hpv45不存在、关于hpv51的seq id no：1599、关于hpv52的seq id no：1610、关于hpv56的seq id no：1626、关于hpv58的seq id no：1642、关于hpv59不存在、关于hpv66的seq id no：1669、关于hpv68的seq id no：1683、关于hpv73的seq id no：1693和关于hpv82的seq id no：1706，
[0255]
对应于剪接点i＝4的扩增子分别为关于hpv16的seq id no：1504、关于hpv18的seq id no：1518、关于hpv31的seq id no：1536、关于hpv33的seq id no：1550、关于hpv35的seq id no：1563、关于hpv39的seq id no：1576、关于hpv45的seq id no：1587、关于hpv51的seq id no：1600、关于hpv52的seq id no：1611、关于hpv56的seq id no：1627、关于hpv58的seq id no：1643、关于hpv59的idno：1656、关于hpv66的seq id no：1671、关于hpv68的seq id no：1684、关于hpv7的seq id no：1694和关于hpv82的seq id no：1707，
[0256]
对应于剪接点i＝5的扩增子分别为关于hpv16的seq id no：1505、关于hpv18的seq id no：1519、关于hpv31的seq id no：1537、关于hpv33的seq id no：1551、关于hpv35的seq id no：1564、关于hpv39不存在、关于hpv45的seq id no：1588、关于hpv51不存在、关于hpv52的seq id no：1612、关于hpv56的seq id no：1628、关于hpv58的seq id no：1644、关于hpv59的seq id no：1657、关于hpv66的seq id no：1672、关于hpv68不存在、关于hpv73不存在和关于hpv82不存在，
[0257]
对应于剪接点i＝6的扩增子分别为关于hpv16的seq id no：1506、关于hpv18的seq id no：1520、关于hpv31的seq id no：1538、关于hpv33的seq id no：1552、关于hpv35的seq id no：1565、关于hpv39不存在、关于hpv45不存在、关于hpv51的seq id no：1601、关
于hpv52的seq id no：1613、关于hpv56的seq id no：1629、关于hpv58的seq id no：1645、关于hpv59不存在、关于hpv66不存在、关于hpv68的seq id no：1686、关于hpv73的seq id no：1695和关于hpv82的seq id no：1708，
[0258]
对应于剪接点i＝7的扩增子分别为关于hpv16的seq id no：1507、关于hpv18的seq id no：1521、关于hpv31的seq id no：1539、关于hpv33的seq id no：1553、关于hpv35的seq id no：1566、关于hpv39的seq id no：1578、关于hpv45的seq id no：1590、关于hpv51的seq id no：1602、关于hpv52的seq id no：1614、关于hpv56的seq id no：1630、关于hpv58的seq id no：1646、关于hpv59不存在、关于hpv66的seq id no：1674、关于hpv68的seq id no：1685、关于hpv73的seq id no：1696和关于hpv82的seq id no：1709，
[0259]
对应于剪接点i＝8的扩增子分别为关于hpv16的seq id no：1508、关于hpv18不存在、关于hpv31的seq id no：1540、关于hpv33的seq id no：1554、关于hpv35不存在、关于hpv39不存在、关于hpv45不存在、关于hpv51不存在、关于hpv52的seq id no：1615、关于hpv56的seq id no：1631、关于hpv58的seq id no：1647、关于hpv59不存在、关于hpv66的seq id no：1675、关于hpv68不存在、关于hpv73的seq id no：1697和关于hpv82的seq id no：1710，
[0260]
对应于剪接点i＝9的扩增子分别为关于hpv16的seq id no：1509、关于hpv18的seq id no：1522、关于hpv31的seq id no：1541、关于hpv33不存在、关于hpv35不存在、关于hpv39的seq id no：1579、关于hpv45的seq id no：1591、关于hpv51的seq id no：1603、关于hpv52的seq id no：1616、关于hpv56的seq id no：1632、关于hpv58不存在、关于hpv59的seq id no：1659、关于hpv66的seq id no：1676、关于hpv68的seq id no：1687、关于hpv73的seq id no：1698和关于hpv82的seq id no：1711，
[0261]
对应于剪接点i＝10的扩增子分别为关于hpv16不存在、关于hpv18的seq id no：1523、关于hpv31不存在、关于hpv33不存在、关于hpv35不存在、关于hpv39不存在、关于hpv45不存在、关于hpv51不存在、关于hpv52不存在、关于hpv56不存在、关于hpv58不存在、关于hpv59不存在、关于hpv66不存在、关于hpv68不存在、关于hpv73不存在和关于hpv82不存在，
[0262]
对应于剪接点i＝11的扩增子分别为关于hpv16的seq id no：1510、关于hpv18的seq id no：1524、关于hpv31的seq id no：1542、关于hpv33的seq id no：1555、关于hpv35的seq id no：1567、关于hpv39的seq id no：1580、关于hpv45的seq id no：1592、关于hpv51的seq id no：1604、关于hpv52的seq id no：1617、关于hpv56的seq id no：1633、关于hpv58的seq id no：1648、关于hpv59的seq id no：1660、关于hpv66的seq id no：1677、关于hpv68的seq id no：1688、关于hpv73的seq id no：1699和关于hpv82的seq id no：1712，
[0263]
对应于剪接点i＝12的扩增子分别为关于hpv16不存在、关于hpv18的seq id no：1525、关于hpv31不存在、关于hpv33不存在、关于hpv35的seq id no：1568、关于hpv39不存在、关于hpv45不存在、关于hpv51不存在、关于hpv52的seq id no：1618、关于hpv56的seq id no：1634、关于hpv58不存在、关于hpv59的seq id no：1661、关于hpv66不存在、关于hpv68不存在、关于hpv73的seq id no：1700、关于hpv82不存在，
[0264]
对应于剪接点i＝13的扩增子分别为关于hpv16不存在、关于hpv18的seq id no：
1526、关于hpv31不存在、关于hpv33不存在、关于hpv35不存在、关于hpv39不存在、关于hpv45的seq id no：1593、关于hpv51不存在、关于hpv52不存在、关于hpv56不存在、关于hpv58不存在、关于hpv59不存在、关于hpv66不存在、关于hpv68不存在、关于hpv73不存在和关于hpv82不存在，
[0265]
对应于剪接点i＝14的扩增子分别为关于hpv16不存在、关于hpv18的seq id no：1527、关于hpv31不存在、关于hpv33不存在、关于hpv35不存在、关于hpv39不存在、关于hpv45不存在、关于hpv51不存在、关于hpv52不存在、关于hpv56不存在、关于hpv58不存在、关于hpv59不存在、关于hpv66不存在、关于hpv68不存在、关于hpv73不存在和关于hpv82不存在，
[0266]
对应于剪接点i＝15的扩增子分别为关于hpv16的seq id no：1511、关于hpv18的seq id no：1528、关于hpv31的seq id no：1543、关于hpv33的seq id no：1556、关于hpv35的seq id no：1569、关于hpv39的seq id no：1581、关于hpv45的seq id no：1594、关于hpv51的seq id no：1605、关于hpv52的seq id no：1619、关于hpv56的seq id no：1635、关于hpv58的seq id no：1649、关于hpv59的seq id no：1662、关于hpv66的seq id no：1678、关于hpv68的seq id no：1689、关于hpv73的seq id no：1701和关于hpv82的seq id no：1713，
[0267]
对应于剪接点i＝16的扩增子分别为关于hpv16的seq id no：1512、关于hpv18的seq id no：1529、关于hpv31的seq id no：1544、关于hpv33的seq id no：1557、关于hpv35的seq id no：1570、关于hpv39不存在、关于hpv45的seq id no：1595、关于hpv51不存在、关于hpv52的seq id no：1620、关于hpv56的seq id no：1636、关于hpv58的seq id no：1650、关于hpv59的seq id no：1663、关于hpv66的seq id no：1679、关于hpv68不存在、关于hpv73不存在和关于hpv82不存在，
[0268]
对应于剪接点i＝17的扩增子分别为关于hpv16的seq id no：1513、关于hpv18不存在、关于hpv31的seq id no：1545、关于hpv33的seq id no：1558、关于hpv35的seq id no：1571、关于hpv39不存在、关于hpv45不存在、关于hpv51的seq id no：1606、关于hpv52的seq id no：1621、关于hpv56的seq id no：1637、关于hpv58的seq id no：1651、关于hpv59不存在、关于hpv66不存在、关于hpv68的seq id no：1690、关于hpv73的seq id no：1702和关于hpv82的seqid no：1714.
[0269]
对应于剪接点i＝18的扩增子分别为关于hpv16的seq id no：1514、关于hpv18的seq id no：1531、关于hpv31的seq id no：1546、关于hpv33的seq id no：1559、关于hpv35的seq id no：1572、关于hpv39的seq id no：1583、关于hpv45的seq id no：1597、关于hpv51的seq id no：1607、关于hpv52的seq id no：1622、关于hpv56的seq id no：1638、关于hpv58的seq id no：1652、关于hpv59的seq id no：1665、关于hpv66的seq id no：1681、关于hpv68的seq id no：1691、关于hpv73的seq id no：1703和关于hpv82的seq id no：1715，
[0270]
对应于剪接点i＝19的扩增子分别为关于hpv16不存在、关于hpv18的seq id no：1532、关于hpv31不存在、关于hpv33不存在、关于hpv35的seq id no：1573、关于hpv39不存在、关于hpv45不存在、关于hpv51不存在、关于hpv52的seq id no：1623、关于hpv56的seq id no：1639、关于hpv58不存在、关于hpv59的seq id no：1666、关于hpv66不存在、关于
hpv68不存在、关于hpv73的seq id no：1704和关于hpv82不存在，
[0271]
对应于剪接点i＝20的扩增子分别为关于hpv16不存在、关于hpv18不存在、关于hpv31不存在、关于hpv33不存在、关于hpv35不存在、关于hpv39的seq id no：1577、关于hpv45不存在、关于hpv51不存在、关于hpv52不存在、关于hpv56不存在、关于hpv58不存在、关于hpv59的seq id no：1658、关于hpv66不存在、关于hpv68不存在、关于hpv73不存在和关于hpv82不存在，
[0272]
对应于剪接点i＝21的扩增子分别为关于hpv16不存在、关于hpv18不存在、关于hpv31不存在、关于hpv33不存在、关于hpv35不存在、关于hpv39的seq id no：1582、关于hpv45不存在、关于hpv51不存在、关于hpv52不存在、关于hpv56不存在、关于hpv58不存在、关于hpv59的seq id no：1664、关于hpv66不存在、关于hpv68不存在、关于hpv73不存在和关于hpv82不存在，
[0273]
对应于剪接点i＝22的扩增子分别为关于hpv16不存在、关于hpv18不存在、关于hpv31不存在、关于hpv33不存在、关于hpv35不存在、关于hpv39的seq id no：1575、关于hpv45不存在、关于hpv51不存在、关于hpv52不存在、关于hpv56不存在、关于hpv58不存在、关于hpv59的seq idno：1655、关于hpv66不存在、关于hpv68不存在、关于hpv73不存在和关于hpv82不存在，
[0274]
对应于剪接点i＝23的扩增子分别为关于hpv16不存在、关于hpv18不存在、关于hpv31不存在、关于hpv33不存在、关于hpv35不存在、关于hpv39不存在、关于hpv45的seq id no：1586、关于hpv51不存在、关于hpv52不存在、关于hpv56不存在、关于hpv58不存在、关于hpv59不存在、关于hpv66的seq id no：1670、关于hpv68不存在、关于hpv73不存在和关于hpv82不存在，
[0275]
对应于剪接点i＝24的扩增子分别为关于hpv16不存在、关于hpv18不存在、关于hpv31不存在、关于hpv33不存在、关于hpv35不存在、关于hpv39不存在、关于hpv45的seq id no：1589、关于hpv51不存在、关于hpv52不存在、关于hpv56不存在、关于hpv58不存在、关于hpv59不存在、关于hpv66的seq id no：1673、关于hpv68不存在、关于hpv73不存在和关于hpv82不存在，
[0276]
对应于剪接点i＝25的扩增子分别为关于hpv16不存在、关于hpv18的seq id no：1530、关于hpv31不存在、关于hpv33不存在、关于hpv35不存在、关于hpv39不存在、关于hpv45的seq id no：1596、关于hpv51不存在、关于hpv52不存在、关于hpv56不存在、关于hpv58不存在、关于hpv59不存在、关于hpv66的seq id no：1680、关于hpv68不存在、关于hpv73不存在和关于hpv82不存在。
[0277]
用于检测hsil的体外方法可以包括用包含30
‑
60重量％甲醇和40
‑
70重量％水的溶液，例如preservcyt处理生物样品的步骤。
[0278]
用于hpv分型的引物组合物
[0279]
本发明涉及用于对hpv进行分型的引物组合物，其选自以下：
[0280]
‑
如上文定义的剪接点引物对集合的第一子集至第十三子集，以及任选地第十四子集和/或第十五子集和/或第十六子集各自的至少一对引物，
[0281]
‑
第二引物集合，称为非剪接点引物集合，
[0282]
‑
第三引物集合，称为基因组引物集合，和
[0283]
‑
第四引物集合，称为融合引物集合。
[0284]
本发明涉及用于对hpv进行分型的引物组合物，其包含选自以下的引物集合：如上文定义的剪接点引物集合、称为非剪接点引物集合的第二引物集合、称为基因组引物集合的第三引物集合、以及称为融合引物集合的第四引物集合。
[0285]
本发明还涉及用于对hpv进行分型的引物组合物，其包含如上文定义的剪接点引物集合以及额外的选自由以下项组成的组的引物集合：称为非剪接点引物集合的第二引物集合、称为基因组引物集合的第三引物集合、以及称为融合引物集合的第四引物集合。
[0286]
根据本发明的用于对hpv进行分型的引物的方法和组合物提供了与当前用于hpv分型的黄金标准测试一样良好的结果。
[0287]
此外，本发明的引物的方法和组合物用单一分子测试替代了细胞学(巴氏涂片)和hpv分子筛查的当前组合，所述单一分子测试用于在阴道镜检查前检测高风险或假定的高风险hpv、以及处于转化感染的风险中的女性分诊两者。特别地，剪接点引物集合既可以用于检测hsil病变叉可以用于对hpv进行分型。
[0288]
优选地，本发明的用于对hpv进行分型的引物组合物包含如上文定义的剪接点引物集合、非剪接点引物集合、基因组引物集合和融合引物集合。
[0289]
非剪接点集合、基因组引物集合和融合引物集合各自可以包含每个高风险hpv特异性的引物对子集，以及任选地每个假定的高风险hpv特异性的引物子集。
[0290]
本发明的用于对hpv进行分型的引物组合物还可以包含另外的第五引物集合，称为人引物集合。人引物集合如上文定义的。
[0291]
在不存在任何剪接事件的情况下，非剪接点引物集合的引物靶向跨越剪接供体或剪接受体位点的高风险和任选地假定的高风险hpv基因组区域。
[0292]
非剪接点引物集合可以包含：
[0293]
‑
hpv16特异性引物对的第一子集的至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10或至少11对引物，或者1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11对引物，所述hpv16特异性引物对具有选自由seq id no：431
‑
432至seq id no：451
‑
452组成的组的核酸序列；
[0294]
‑
hpv18特异性引物对的第二子集的至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11或至少12对引物，或者1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12对引物，所述hpv18特异性引物对具有选自由seq id no：453
‑
454至seq id no：475
‑
476组成的组的核酸序列：
[0295]
‑
hpv31特异性引物对的第三子集的至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9或至少10对引物，或者1、2、3、4、5、6、7、8、9或10对引物，所述hpv31特异性引物对具有选自由seq id no：477
‑
478至seq id no：497
‑
498组成的组的核酸序列；
[0296]
‑
hpv33特异性引物对的第四子集的至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8或至少9对引物，或者1、2、3、4、5、6、7、8或9对引物，所述hpv33特异性引物对具有选自由seq id no：499
‑
500至seq id no：515
‑
516组成的组的核酸序列；
[0297]
‑
hpv35特异性引物对的第五子集的至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9或至少10对引物，或者1、2、3、4、5、6、7、8、9或10对引物，所述hpv35特异性引物对具有选自由seq id no：517
‑
518至seq id no：535
‑
536组成的组的核酸序列；
[0298]
‑
hpv39特异性引物对的第六子集的至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7或至少8对引物，或者1、2、3、4、5、6、7或8对引物，所述hpv39特异性引物对具有选自由seq id no：537
‑
538至seq id no：551
‑
552组成的组的核酸序列；
[0299]
‑
hpv45特异性引物对的第七子集的至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9或至少10对引物，或者1、2、3、4、5、6、7、8、9或10对引物，所述hpv45特异性引物对具有选自由seq id no：553
‑
554至seq id no：571
‑
572组成的组的核酸序列；
[0300]
‑
hpv51特异性引物对的第八子集的至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8或至少9对引物，或者1、2、3、4、5、6、7、8或9对引物，所述hpv51特异性引物对具有选自由seq id no：573
‑
574至seq id no：589
‑
590组成的组的核酸序列；
[0301]
‑
hpv52特异性引物对的第九子集的至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10或至少11对引物，或者1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11对引物，所述hpv52特异性引物对具有选自由seq id no：591
‑
592至seq id no：611
‑
612组成的组的核酸序列；
[0302]
‑
hpv56特异性引物对的第十子集的至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9或至少10对引物，或者1、2、3、4、5、6、7、8、9或10对引物，所述hpv56特异性引物对具有选自由seq id no：613
‑
614组成的组至seq id no：631
‑
632的核酸序列；
[0303]
‑
hpv58特异性引物对的第十一子集的至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7或至少8对引物，或者1、2、3、4、5、6、7或8对引物，所述hpv58特异性引物对具有选自由seq id no：633
‑
634至seq id no：647
‑
648组成的组的核酸序列；
[0304]
‑
hpv59特异性引物对的第十二子集的至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7或至少8对引物，或者1、2、3、4、5、6、7或8对引物，所述hpv59特异性引物对具有选自由seq id no：649
‑
650至seq id no：663
‑
664组成的组的核酸序列；
[0305]
‑
hpv66特异性引物对的第十三子集的至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7或至少8对引物，或者1、2、3、4、5、6、7或8对引物，所述hpv66特异性引物对具有选自由seq id no：665
‑
666至seq id no：679
‑
680组成的组的核酸序列。
[0306]
非剪接点引物集合可以进一步包含：
[0307]
‑
hpv68特异性引物对的第十四子集的至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8或至少9对引物，或者1、2、3、4、5、6、7、8或9对引物，所述hpv68特异性引物对具有选自由seq id no：681
‑
682至seq id no：697
‑
698组成的组的核酸序列；和/或
[0308]
‑
hpv73特异性引物对的第十五子集的至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9或至少10对引物，或者1、2、3、4、5、6、7、8、9或10对引物，所述hpv73特异性引物对具有选自由seq id no：699
‑
700至seq id no：717
‑
718组成的组的核酸序列；和/或
[0309]
‑
hpv82特异性引物对的第十六子集的至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8或至少9对引物，或者1、2、3、4、5、6、7、8或9对引物，所述hpv82特异性引物对具有选自由seq id no：719
‑
720至seq id no：735
‑
736组成的组的核酸序列。
[0310]
在一个实施例中，非剪接点引物集合包含具有以下核酸序列的引物对：seq id no：431
‑
432至seq id no：679
‑
680，以及任选地seq id no：681
‑
682至seq id no：697
‑
698和/或seq id no：699
‑
700至seq id no：717
‑
718和/或seq id no：719
‑
720至seq id no：
735
‑
736。
[0311]
在一个优选的实施例中，非剪接点引物集合包含具有核酸序列seq id no：431
‑
432至seq id no：735
‑
736的引物对。
[0312]
在一个实施例中，非剪接点引物集合由具有以下核酸序列的引物对组成：seq id no：431
‑
432至seq id no：679
‑
680，以及任选地seq id no：681
‑
682至seq id no：697
‑
698和/或seq id no：699
‑
700至seq id no：717
‑
718和/或seq id no：719
‑
720至seq id no：735
‑
736。
[0313]
在一个优选的实施例中，非剪接点引物集合由具有核酸序列seq id no：431
‑
432至seq id no：735
‑
736的引物对组成。
[0314]
非剪接点引物集合可以包含：
[0315]
‑
hpv16特异性引物对的第一子集的至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10或至少11对引物，或者1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11对引物，所述hpv16特异性引物对能够产生具有选自由seq id no：1716至seq id no：1726组成的组的核酸序列的扩增子；
[0316]
‑
hpv18特异性引物对的第二子集的至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11或至少12对引物，或者1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12对引物，所述hpv18特异性引物对能够产生具有选自由seq id no：1727至seq id no：1738组成的组的核酸序列的扩增子；
[0317]
‑
hpv31特异性引物对的第三子集的至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11或至少12对引物，或者1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12对引物，所述hpv31特异性引物对能够产生具有选自由seq id no：1739至seq id no：1749组成的组的核酸序列的扩增子；
[0318]
‑
hpv33特异性引物对的第四子集的至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8或至少9对引物，或者1、2、3、4、5、6、7、8或9对引物，所述hpv33特异性引物对能够产生具有选自由seq id no：1750至seq id no：1758组成的组的核酸序列的扩增子；
[0319]
‑
hpv35特异性引物对的第五子集的至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9或至少10对引物，或者1、2、3、4、5、6、7、8、9或10对引物，所述hpv35特异性引物对能够产生具有选自由seq id no：1759至seq id no：1768组成的组的核酸序列的扩增子；
[0320]
‑
hpv39特异性引物对的第六子集的至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7或至少8对引物，或者1、2、3、4、5、6、7或8对引物，所述hpv39特异性引物对能够产生具有选自由seq id no：1769至seq id no：1776组成的组的核酸序列的扩增子；
[0321]
‑
hpv45特异性引物对的第七子集的至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9或至少10对引物，或者1、2、3、4、5、6、7、8、9或10对引物，所述hpv45特异性引物对能够产生具有选自由seq id no：1777至seq id no：1786组成的组的核酸序列的扩增子；
[0322]
‑
hpv51特异性引物对的第八子集的至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8或至少9对引物，或者1、2、3、4、5、6、7、8或9对引物，所述hpv51特异性引物对能够产生具有选自由seq id no：1787至seq id no：1795组成的组的核酸序列的扩增子；
[0323]
‑
hpv52特异性引物对的第九子集的至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10或至少11对引物，或者1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11对引物，所述hpv52特异性引物对能够产生具有选自由seq id no：1796至seq id no：1806组成的组的核酸序列的扩增子；
[0324]
‑
hpv56特异性引物对的第十子集的至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9或至少10对引物，或者1、2、3、4、5、6、7、8、9或10对引物，所述hpv56特异性引物对能够产生具有选自由seq id no：1807至seq id no：1816组成的组的核酸序列的扩增子；
[0325]
‑
hpv58特异性引物对的第十一子集的至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7或至少8对引物，或者1、2、3、4、5、6、7或8对引物，所述hpv58特异性引物对能够产生具有选自由seq id no：1817至seq id no：1824组成的组的核酸序列的扩增子；
[0326]
‑
hpv59特异性引物对的第十二子集的至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7或至少8对引物，或者1、2、3、4、5、6、7或8对引物，所述hpv59特异性引物对能够产生具有选自由seq id no：1825至seq id no：1832组成的组的核酸序列的扩增子；
[0327]
‑
hpv66特异性引物对的第十三子集的至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6或至少7对引物，或者1、2、3、4、5、6或7对引物，所述hpv66特异性引物对能够产生具有选自由seq id no：1833至seq id no：1840组成的组的核酸序列的扩增子。
[0328]
非剪接点引物集合可以进一步包含：
[0329]
‑
hpv68特异性引物对的第十四子集的至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8或至少9对引物，或者1、2、3、4、5、6、7、8或9对引物，所述hpv68特异性引物对能够产生具有选自由seq id no：1841至seq id no：1849组成的组的核酸序列的扩增子；
[0330]
‑
hpv73特异性引物对的第十五子集的至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9或至少10对引物，或者1、2、3、4、5、6、7、8、9或10对引物，所述hpv73特异性引物对能够产生具有选自由seq id no：1850至seq id no：1859组成的组的核酸序列的扩增子；
[0331]
‑
hpv82特异性引物对的第十六子集的至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8或至少9对引物，或者1、2、3、4、5、6、7、8或9对引物，所述hpv82特异性引物对能够产生具有选自由seq id no：1860至seq id no：1868组成的组的核酸序列的扩增子。
[0332]
在一个实施例中，非剪接点引物集合包含能够产生具有以下核酸序列的扩增子的引物对：seq id no：1716至seq id no：1840，以及任选地seq id no：1841至seq id no：1849和/或seq id no：1850至seq id no：1859和/或seq id no：1860至seq id no：1868。
[0333]
在一个优选的实施例中，非剪接点引物集合包含能够产生具有以下核酸序列的扩增子的引物对：seq id no：1716至seq id no：1726至seq id no：1860至seq id no：1868。
[0334]
在一个实施例中，非剪接点引物集合由能够产生具有以下核酸序列的扩增子的引物对组成：seq id no：1716至seq id no：1840，以及任选地seq id no：1841至seq id no：1849和/或seq id no：1850至seq id no：1859和/或seq id no：1860至seq id no：1868。
[0335]
在一个优选的实施例中，非剪接点引物集合由具有核酸序列seq id no：1716至seq id no：1726至seq id no：1868的引物对组成。
[0336]
基因组引物集合的引物靶向远离任何剪接供体或剪接受体位点的高风险和任选
地假定的高风险hpv基因组区域，
[0337]
基因组引物集合可以包含：
[0338]
‑
hpv16特异性引物对的第一子集的至少1、至少2、至少3或至少4对引物，或者1、2、3或4对引物，所述hpv16特异性引物对具有选自由以下项组成的组的核酸序列：seq id no：737
‑
738、seq id no：739
‑
740、seq id no：741
‑
742和seq id no：743
‑
744；
[0339]
‑
hpv18特异性引物对的第二子集的至少1、至少2、至少3或至少4对引物，或者1、2、3或4对引物，所述hpv18特异性引物对具有选自由以下项组成的组的核酸序列：seq id no：745
‑
746、seq id no：747
‑
748、seq id no：749
‑
750和seq id no：751
‑
752；
[0340]
‑
hpv31特异性引物对的第三子集的至少1、至少2、至少3或至少4对引物，或者1、2、3或4对引物，所述hpv31特异性引物对具有选自由以下项组成的组的核酸序列：seq id no：753
‑
754、seq id no：755
‑
756、seq id no：757
‑
758和seq id no：759
‑
760；
[0341]
‑
hpv33特异性引物对的第四子集的至少1、至少2、至少3或至少4对引物，或者1、2、3或4对引物，所述hpv33特异性引物对具有选自由以下项组成的组的核酸序列：seq id no：761
‑
762、seq id no：763
‑
764、seq id no：765
‑
766和seq id no：767
‑
768；
[0342]
‑
hpv35特异性引物对的第五子集的至少1、至少2、至少3或至少4对引物，或者1、2、3或4对引物，所述hpv35特异性引物对具有选自由以下项组成的组的核酸序列：seq id no：769
‑
770、seq id no：771
‑
772、seq id no：773
‑
774和seq id no：775
‑
776；
[0343]
‑
hpv39特异性引物对的第六子集的至少1、至少2、至少3或至少4对引物，或者1、2、3或4对引物，所述hpv39特异性引物对具有选自由以下项组成的组的核酸序列：seq id no：777
‑
778、seq id no：779
‑
780、seq id no：781
‑
782和seq id no：783
‑
784；
[0344]
‑
hpv45特异性引物对的第七子集的至少1、至少2、至少3或至少4对引物，或者1、2、3或4对引物，所述hpv45特异性引物对具有选自由以下项组成的组的核酸序列：seq id no：785
‑
786、seq id no：787
‑
788、seq id no：789
‑
790和seq id no：791
‑
792；
[0345]
‑
hpv51特异性引物对的第八子集的至少1、至少2、至少3或至少4对引物，或者1、2、3或4对引物，所述hpv51特异性引物对具有选自由以下项组成的组的核酸序列：seq id no：793
‑
794、seq id no：795
‑
796、seq id no：797
‑
798和seq id no：799
‑
800；
[0346]
‑
hpv52特异性引物对的第九子集的至少1、至少2、至少3或至少4对引物，或者1、2、3或4对引物，所述hpv52特异性引物对具有选自由以下项组成的组的核酸序列：seq id no：801
‑
802、seq id no：803
‑
804、seq id no：805
‑
806和seq id no：807
‑
808；
[0347]
‑
hpv56特异性引物对的第十子集的至少1、至少2、至少3或至少4对引物，或者1、2、3或4对引物，所述hpv56特异性引物对具有选自由以下项组成的组的核酸序列：seq id no：809
‑
810、seq id no：811
‑
812、seq id no：813
‑
814和seq id no：815
‑
816；
[0348]
‑
hpv58特异性引物对的第十一子集的至少1、至少2、至少3或至少4对引物，或者1、2、3或4对引物，所述hpv58特异性引物对具有选自由以下项组成的组的核酸序列：seq id no：817
‑
818、seq id no：819
‑
820、seq id no：821
‑
822和seq id no：823
‑
824；
[0349]
‑
hpv59特异性引物对的第十二子集的至少1、至少2、至少3或至少4对引物，或者1、2、3或4对引物，所述hpv59特异性引物对具有选自由以下项组成的组的核酸序列：seq id no：825
‑
826、seq id no：827
‑
828、seq id no：829
‑
830和seq id no：831
‑
832；
[0350]
‑
hpv66特异性引物对的第十三子集的至少1、至少2、至少3或至少4对引物，或者1、
2、3或4对引物，所述hpv66特异性引物对具有选自由以下项组成的组的核酸序列：seq id no：833
‑
834、seq id no：835
‑
836、seq id no：837
‑
838和seq id no：839
‑
840。
[0351]
基因组引物集合可以进一步包含：
[0352]
‑
hpv68特异性引物对的第十四子集的至少1、至少2、至少3或至少4对引物，或者1、2、3或4对引物，所述hpv68特异性引物对具有选自由以下项组成的组的核酸序列：seq id no：841
‑
842、seq id no：843
‑
844、seq id no：845
‑
846和seq id no：847
‑
848；
[0353]
‑
hpv73特异性引物对的第十五子集的至少1、至少2、至少3或至少4对引物，或者1、2、3或4对引物，所述hpv73特异性引物对具有选自由以下项组成的组的核酸序列：seq id no：849
‑
850、seq id no：851
‑
852、seq id no：853
‑
854和seq id no：855
‑
856；
[0354]
‑
hpv82特异性引物对的第十六子集的至少1、至少2、至少3或至少4对引物，或者1、2、3或4对引物，所述hpv82特异性引物对具有选自由以下项组成的组的核酸序列：seq id no：857
‑
858、seq id no：859
‑
860、seq id no：861
‑
862和seq id no：863
‑
864。
[0355]
在一个实施例中，基因组引物集合包含具有以下核酸序列的引物对：seq id no：737
‑
738至seq id no：839
‑
840，以及任选地seq id no：841
‑
842至seq id no：847
‑
848和/或seq id no：849
‑
850至seq id no：853
‑
854和seq id no：855
‑
856和/或seq id no：857
‑
858至seq id no：863
‑
864。在一个优选的实施例中，基因组引物集合包含具有核酸序列seq id no：737
‑
738至seq id no：863
‑
864的引物对。
[0356]
在一个实施例中，基因组引物集合由具有以下核酸序列的引物对组成：seq id no：737
‑
738至seq id no：839
‑
840，以及任选地seq id no：841
‑
842至seq id no：847
‑
848和/或seq id no：849
‑
850至seq id no：853
‑
854和seq id no：855
‑
856和/或seq id no：857
‑
858至seq id no：863
‑
864。在一个优选的实施例中，基因组引物集合由具有核酸序列seq id no：737
‑
738至seq id no：863
‑
864的引物对组成。
[0357]
基因组引物集合可以包含：
[0358]
‑
hpv16特异性引物对的第一子集的至少1、至少2、至少3或至少4对引物，或者1、2、3或4对引物，所述hpv16特异性引物对能够产生具有选自由seq id no：1869至seq id no：1872组成的组的核酸序列的扩增子；
[0359]
‑
hpv18特异性引物对的第二子集的至少1、至少2、至少3或至少4对引物，或者1、2、3或4对引物，所述hpv18特异性引物对能够产生具有选自由seq id no：1873至seq id no：1876组成的组的核酸序列的扩增子；
[0360]
‑
hpv31特异性引物对的第三子集的至少1、至少2、至少3或至少4对引物，或者1、2、3或4对引物，所述hpv31特异性引物对能够产生具有选自由seq id no：1877至seq id no：1880组成的组的核酸序列的扩增子；
[0361]
‑
hpv33特异性引物对的第四子集的至少1、至少2、至少3或至少4对引物，或者1、2、3或4对引物，所述hpv33特异性引物对能够产生具有选自由seq id no：1881至seq id no：1884组成的组的核酸序列的扩增子；
[0362]
‑
hpv35特异性引物对的第五子集的至少1、至少2、至少3或至少4对引物，或者1、2、3或4对引物，所述hpv35特异性引物对能够产生具有选自由seq id no：1885至seq id no：1888组成的组的核酸序列的扩增子；
[0363]
‑
hpv39特异性引物对的第六子集的至少1、至少2、至少3或至少4对引物，或者1、2、
3或4对引物，所述hpv39特异性引物对能够产生具有选自由seq id no：1889至seq id no：1892组成的组的核酸序列的扩增子；
[0364]
‑
hpv45特异性引物对的第七子集的至少1、至少2、至少3或至少4对引物，或者1、2、3或4对引物，所述hpv45特异性引物对能够产生具有选自由seq id no：1893至seq id no：1896组成的组的核酸序列的扩增子；
[0365]
‑
hpv51特异性引物对的第八子集的至少1、至少2、至少3或至少4对引物，或者1、2、3或4对引物，所述hpv51特异性引物对能够产生具有选自由seq id no：1897至seq id no：1900组成的组的核酸序列的扩增子；
[0366]
‑
hpv52特异性引物对的第九子集的至少1、至少2、至少3或至少4对引物，或者1、2、3或4对引物，所述hpv52特异性引物对能够产生具有选自由seq id no：1901至seq id no：1904组成的组的核酸序列的扩增子；
[0367]
‑
hpv56特异性引物对的第十子集的至少1、至少2、至少3或至少4对引物，或者1、2、3或4对引物，所述hpv56特异性引物对能够产生具有选自由seq id no：1905至seq id no：1908组成的组的核酸序列的扩增子；
[0368]
‑
hpv58特异性引物对的第十一子集的至少1、至少2、至少3或至少4对引物，或者1、2、3或4对引物，所述hpv58特异性引物对能够产生具有选自由seq id no：1909至seq id no：1912组成的组的核酸序列的扩增子；
[0369]
‑
hpv59特异性引物对的第十二子集的至少1、至少2、至少3或至少4对引物，或者1、2、3或4对引物，所述hpv59特异性引物对能够产生具有选自由seq id no：1913至seq id no：1916组成的组的核酸序列的扩增子；
[0370]
‑
hpv66特异性引物对的第十三子集的至少1、至少2、至少3或至少4对引物，或者1、2、3或4对引物，所述hpv66特异性引物对能够产生具有选自由seq id no：1917至seq id no：1920组成的组的核酸序列的扩增子。
[0371]
基因组引物集合可以进一步包含：
[0372]
‑
hpv68特异性引物对的第十四子集的至少1、至少2、至少3或至少4对引物，或者1、2、3或4对引物，所述hpv68特异性引物对能够产生具有选自由seq id no：1921至seq id no：1924组成的组的核酸序列的扩增子；和/或
[0373]
‑
hpv73特异性引物对的第十五子集的至少1、至少2、至少3或至少4对引物，或者1、2、3或4对引物，所述hpv73特异性引物对能够产生具有选自由seq id no：1925至seq id no：1928组成的组的核酸序列的扩增子；和/或
[0374]
‑
hpv82特异性引物对的第十六子集的至少1、至少2、至少3或至少4对引物，或者1、2、3或4对引物，所述hpv82特异性引物对能够产生具有选自由seq id no：1929至seq id no：1932组成的组的核酸序列的扩增子。
[0375]
在一个实施例中，基因组引物集合包含能够产生具有以下核酸序列的扩增子的引物对：seq id no：1869至seq id no：1920，以及任选地seq id no：1921至seq id no：1924和/或seq id no：1925至seq id no：1928和/或seq id no：1929至seq id no：1932。
[0376]
在一个优选的实施例中，基因组引物集合包含能够产生具有核酸序列seq id no：1869至seq id no：1932的扩增子的引物对。
[0377]
在一个实施例中，基因组引物集合由能够产生具有以下核酸序列的扩增子的引物
对组成：seq id no：1869至seq id no：1833至1840，以及任选地seq id no：1921至seq id no：1924和/或seq id no：1925至seq id no：1928和/或seq id no：1929至seq id no：1932。
[0378]
在一个优选的实施例中，基因组引物集合由具有核酸序列seq id no：1869至seq id no：1932的引物对组成。
[0379]
融合引物集合的引物靶向高风险和任选地假定的高风险hpv融合转录物。
[0380]
融合引物集合的引物可以包含：
[0381]
‑
hpv16特异性引物对的第一子集的至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17或至少18对引物，或者1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18对引物，所述hpv16特异性引物对具有选自由seq id no：865
‑
866至seq id no：899
‑
900组成的组的核酸序列；
[0382]
‑
hpv18特异性引物对的第二子集的至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17或至少18对引物，或者1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18对引物，所述hpv18特异性引物对具有选自由seq id no：901
‑
902至seq id no：935
‑
936组成的组的核酸序列；
[0383]
‑
hpv31特异性引物对的第三子集的至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17或至少18对引物，或者1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18对引物，所述hpv31特异性引物对具有选自由seq id no：937
‑
938至seq id no：971
‑
972组成的组的核酸序列；
[0384]
‑
hpv33特异性引物对的第四子集的至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17或至少18对引物，或者1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18对引物，所述hpv33特异性引物对具有选自由seq id no：973
‑
974至seq id no：1007
‑
1008组成的组的核酸序列；
[0385]
‑
hpv35特异性引物对的第五子集的至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17或至少18对引物，或者1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18对引物，所述hpv35特异性引物对具有选自由seq id no：1009
‑
1010至seq id no：1043
‑
1044组成的组的核酸序列；
[0386]
‑
hpv39特异性引物对的第六子集的至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17或至少18对引物，或者1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18对引物，所述hpv39特异性引物对具有选自由seq id no：1045
‑
1046至seq id no：1079
‑
1080组成的组的核酸序列；
[0387]
‑
hpv45特异性引物对的第七子集的至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、优选至少17、更优选18对引物，或者1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18对引物，所述hpv45特异性引物对具有选自由seq id no：1081
‑
1082至seq id no：1115
‑
1116组成的组的核酸序列。
[0388]
‑
hpv51特异性引物对的第八子集的至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至
少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17或至少18对引物，或者1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18对引物，所述hpv51特异性引物对具有选自由seq id no：1117
‑
1118至seq id no：1151
‑
1152组成的组的核酸序列；
[0389]
‑
hpv52特异性引物对的第九子集的至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17或至少18对引物，或者1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18对引物，所述hpv52特异性引物对具有选自由seq id no：1153
‑
1154至seq id no：1187
‑
1188组成的组的核酸序列；
[0390]
‑
hpv56特异性引物对的第十子集的至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17或至少18对引物，或者1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18对引物，所述hpv56特异性引物对具有选自由seq id no：1189
‑
1190至seq id no：1223
‑
1224组成的组的核酸序列；
[0391]
‑
hpv58特异性引物对的第十一子集的至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17或至少18对引物，或者1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18对引物，所述hpv58特异性引物对具有选自由seq id no：1225
‑
1226至seq id no：1259
‑
1260组成的组的核酸序列；
[0392]
‑
hpv59特异性引物对的第十二子集的至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17或至少18对引物，或者1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18对引物，所述hpv59特异性引物对具有选自由seq id no：1261
‑
1262至seq id no：1295
‑
1296组成的组的核酸序列；
[0393]
‑
hpv66特异性引物对的第十三子集的至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17或至少18对引物，或者1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18对引物，所述hpv66特异性引物对具有选自由seq id no：1297
‑
1298至seq id no：1331
‑
1332组成的组的核酸序列。
[0394]
融合引物集合可以进一步包含：
[0395]
‑
hpv68特异性引物对的第十四子集的至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17或至少18对引物，或者1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18对引物，所述hpv68特异性引物对具有选自由seq id no：1333
‑
1334至seq id no：1367
‑
1368组成的组的核酸序列；
[0396]
‑
hpv73特异性引物对的第十五子集的至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17或至少18对引物，或者1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18对引物，所述hpv73特异性引物对具有选自由seq id no：1369
‑
1370至seq id no：1403
‑
1404组成的组的核酸
序列；
[0397]
‑
hpv82特异性引物对的第十六子集的至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17或至少18对引物，或者1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18对引物，所述hpv82特异性引物对具有选自由seq id no：1405
‑
1406至seq id no：1439
‑
1440组成的组的核酸序列。
[0398]
在一个实施例中，融合引物集合包含具有以下核酸序列的引物对：seq id no：865
‑
866至seq id no：1331
‑
1332，以及任选地seq id no：1333
‑
1334至seq id no：1367
‑
1368和/或seq id no：1369
‑
1370至seq id no：1403
‑
1404和/或seq id no：1405
‑
1406至seq id no：1439
‑
1440。
[0399]
在一个优选的实施例中，融合引物集合包含具有核酸序列seq id no：865
‑
866至seq id no：1439
‑
1440的引物对。
[0400]
在一个实施例中，融合引物集合由具有以下核酸序列的引物对组成：seq id no：865
‑
866至seq id no：1331
‑
1332，以及任选地seq id no：1333
‑
1334至seq id no：1367
‑
1368和/或seq id no：1369
‑
1370至seq id no：1403
‑
1404和/或seq id no：1405
‑
1406至seq id no：1439
‑
1440。
[0401]
在一个优选的实施例中，融合引物集合由具有核酸序列seq id no：865
‑
866至seq id no：1439
‑
1440的引物对组成。
[0402]
融合引物集合的引物可以包含：
[0403]
‑
hpv16特异性引物对的第一子集的至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17或至少18对引物，或者1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18对引物，所述hpv16特异性引物对能够产生具有选自由seq id no：1933至seq id no：1950组成的组的核酸序列的扩增子；
[0404]
‑
hpv18特异性引物对的第二子集的至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17或至少18对引物，或者1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18对引物，所述hpv18特异性引物对能够产生具有选自由seq id no：1951至seq id no：1968组成的组的核酸序列的扩增子；
[0405]
‑
hpv31特异性引物对的第三子集的至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17或至少18对引物，或者1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18对引物，所述hpv31特异性引物对能够产生具有选自由seq id no：1969至seq id no：1986组成的组的核酸序列的扩增子；
[0406]
‑
hpv33特异性引物对的第四子集的至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17或至少18对引物，或者1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18对引物，所述hpv33特异性引物对能够产生具有选自由seq id no：1987至seq id no：2004组成的组的核酸序列的扩增子；
[0407]
‑
hpv35特异性引物对的第五子集的至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17或至少18对引物，或者1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18对引物，所述hpv35特异性引物对能够产生具有选自由seq id no：2005至seq id no：2022组成的组的核酸序列的扩增子；
[0408]
‑
hpv39特异性引物对的第六子集的至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17或至少18对引物，或者1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18对引物，所述hpv39特异性引物对能够产生具有选自由seq id no：2023至seq id no：2040组成的组的核酸序列的扩增子；
[0409]
‑
hpv45特异性引物对的第七子集的至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17或至少18对引物，或者1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18对引物，所述hpv45特异性引物对选自由seq id no：2041至seq id no：2058组成的组，
[0410]
‑
hpv51特异性引物对的第八子集的至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17或至少18对引物，或者1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18对引物，所述hpv51特异性引物对能够产生具有选自由seq id no：2059至seq id no：2076组成的组的核酸序列的扩增子，
[0411]
‑
hpv52特异性引物对的第九子集的至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17或至少18对引物，或者1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18对引物，所述hpv52特异性引物对能够产生具有选自由seq id no：2077至seq id no：2094组成的组的核酸序列的扩增子，
[0412]
‑
hpv56特异性引物对的第十子集的至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17或至少18对引物，或者1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18对引物，所述hpv56特异性引物对能够产生具有选自由seq id no：2095至seq id no：2112组成的组的核酸序列的扩增子，
[0413]
‑
hpv58特异性引物对的第十一子集的至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17或至少18对引物，或者1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18对引物，所述hpv58特异性引物对能够产生具有选自由seq id no：2113至seq id no：2130组成的组的核酸序列的扩增子，
[0414]
‑
hpv59特异性引物对的第十二子集的至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17或至少18对引物，或者1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18对引物，所述hpv59特异性引物对能够产生具有选自由seq id no：2131至seq id no：2148组成的组的核酸序列的扩增子，
[0415]
‑
hpv66特异性引物对的第十三子集的至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17或至少18对引物，或者1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18对引物，所述hpv66特异性引物对能够产生具有选自由seq id no：2149至seq id no：2166组成的组的核酸序列的扩增子。
[0416]
融合集合还可以包含：
[0417]
‑
hpv68特异性引物对的第十四子集的至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17或至少18对引物，或者1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18对引物，所述hpv68特异性引物对能够产生具有选自由seq id no：2167至seq id no：2184组成的组的核酸序列的扩增子，和/或
[0418]
‑
hpv73特异性引物对的第十五子集的至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17或至少18对引物，或者1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18对引物，所述hpv73特异性引物对能够产生具有选自由seq id no：2185至seq id no：2202组成的组的核酸序列的扩增子，和/或
[0419]
‑
hpv82特异性引物对的第十六子集的至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17或至少18对引物，或者1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18对引物，所述hpv82特异性引物对能够产生具有选自由seq id no：2203至seq id no：2220组成的组的核酸序列的扩增子。
[0420]
在一个实施例中，融合引物集合包含具有以下核酸序列的引物对：seq id no：1933至seq id no：2166，以及任选地seq id no：2167至seq id no：2184和/或seq id no：2185至seq id no：2202和/或seq id no：2203至seq id no：2220。
[0421]
在一个优选的实施例中，融合引物集合包含能够产生具有核酸序列seq id no：1869至seq id no：2220的扩增子的引物对。
[0422]
在一个实施例中，融合引物集合由能够产生具有以下核酸序列的扩增子的引物对组成：seq id no：1933至seq id no：2166，以及任选地seq id no：2167至seq id no：2184和/或seq id no：2185至seq id no：2202和/或seq id no：2203至seq id no：2220。
[0423]
在一个优选的实施例中，融合引物集合由能够产生具有核酸序列seq id no：1869至seq id no：2220的扩增子的引物对组成。
[0424]
在一个实施例中，用于对hpv进行分型的引物组合物包含具有核酸序列seq id no：1
‑
2至seq id no：1439
‑
1440的引物对。
[0425]
在一个实施例中，用于对hpv进行分型的引物组合物由能够产生具有核酸序列seq id no：1
‑
2至seq id no：1439
‑
1440的扩增子的引物对组成。
[0426]
在一个实施例中，用于对hpv进行分型的引物组合物包含能够产生具有核酸序列seq id no：1501至seq id no：2220的扩增子的引物对。
[0427]
在一个实施例中，用于对hpv进行分型的引物组合物由具有核酸序列seq id no：1501至seq id no：2220的引物对组成。
[0428]
人引物集合的引物靶向人序列。
[0429]
人引物集合可以包含具有选自由以下项组成的组的核酸序列的至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29或至少30对引物，或者1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30对引物：seq id no：1441
‑
1442、seq id no：1443
‑
1444、seq id no：1445
‑
1446、seq id no：1447
‑
1448、seq id no：1449
‑
1450、seq id no：1451
‑
1452、seq id no：1453
‑
1454、seq id no：1455
‑
1456、seq id no：1457
‑
1458、seq id no：1459
‑
1460、seq id no：1461
‑
1462、seq id no：1463
‑
1464、seq id no：1465
‑
1466、seq id no：1467
‑
1468、seq id no：1469
‑
1470、seq id no：1471
‑
1472、seq id no：1473
‑
1474、seq id no：1475
‑
1476、seq id no：1477
‑
1478、seq id no：1479
‑
1480、seq id no：1481
‑
1482、seq id no：1483
‑
1484、seq id no：1485
‑
1486、seq id no：1487
‑
1488、seq id no：1489
‑
1490、seq id no：1491
‑
1492、seq id no：1493
‑
1494、seq id no：1495
‑
1496、seq id no：1497
‑
1498和seq id no：1499
‑
1500。
[0430]
在一个优选实施例中，人引物集合包含seq id no：1441
‑
1442至seq id no：1499
‑
1500。
[0431]
在一个更优选的实施例中，人引物集合由seq id no：1441
‑
1442至seq id no：1499
‑
1500组成。
[0432]
人引物集合可以包含能够产生具有选自由seq id no：2221至seq id no：2250组成的组的核酸序列的扩增子的至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29或至少30对引物，或者2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30对引物。
[0433]
在一个优选的实施例中，人引物集合包括能够产生具有核酸序列seq id no：2221至seq id no：2250的扩增子的引物对。
[0434]
在一个更优选的实施例中，人引物集合由能够产生具有核酸序列seq id no：2221至seq id no：2250的扩增子的引物对组成。
[0435]
在一个实施例中，用于hpv分型的引物组合物包含具有核酸序列seq id no：1
‑
2至seq id no：1499
‑
1500的引物对。
[0436]
由于引物对之间的冗余，核酸序列seq id no：1
‑
2至seq id no：1499
‑
1500仅代表525对独特的引物。
[0437]
在一个实施例中，用于hpv分型的引物组合物由能够产生具有核酸序列seq id no：1
‑
2至seq id no：1499
‑
1500的扩增子的引物对组成。
[0438]
在一个实施例中，用于hpv分型的引物组合物包含能够产生具有核酸序列seq id no：1501至seq id no：2250的扩增子的引物对。
[0439]
在一个实施例中，用于hpv分型的引物组合物由具有核酸序列seq id no：1501至seq id no：2250的引物对组成。
[0440]
本发明还涉及用于hpv分型的试剂盒，其包含本发明的用于hpv分型的引物组合物
以及任选地用于cdna扩增的试剂。
[0441]
用于hpv分型的试剂盒的试剂可以与用于检测hsil的试剂相同。
[0442]
本发明还涉及如上文定义的用于hpv分型的引物组合物或如上文定义的用于hpv分型的试剂盒用于hpv分型的用途。
[0443]
用于生物样品中的hpv分型的体外方法
[0444]
本发明还涉及用于生物样品中的hpv分型的体外方法，其包括以下步骤：
[0445]
‑
(a)从生物样品中提取rna，
[0446]
‑
(b)将rna逆转录，以便生成cdna，
[0447]
‑
(c)使用用于hpv分型的引物组合物扩增步骤(b)生成的cdna，以便产生扩增子，
[0448]
‑
(d)对每个扩增子的表达水平进行定量。
[0449]
每个扩增子的表达水平的定量以及步骤(a)至(c)，可以通过与用于检测hsil的体外方法所公开的相同的方法进行。
[0450]
通常，用于生物样品中的hpv分型的体外方法进一步包括步骤(e)：对于每种hpv类型，将所述hpv类型特异性的所有扩增子的表达水平与参考值进行比较，其中如果所述hpv类型特异性的所有扩增子的表达水平高于参考值，则它指示生物样品中所述hpv类型的存在。
[0451]
实际上，映射到hpv特异性扩增子(即，范畴“剪接点”、“非剪接点”和“基因组”的总和)的读数数目用于检测给定hpv基因型的存在。根据本发明人的结果，参考值优选为100
‑
200个读数，更优选为150个读数。
[0452]
除非另有说明，否则本发明的实践将采用在本领域的技术内的常规技术。此类技术在文献中得到充分说明。
[0453]
为了更好地理解本发明并显示如何实施本发明，现在将参考附图以示例的方式描述由本发明人考虑的具体模式，在所述附图中：
[0454]
图1显示了其中定位了已知的和预测的剪接供体和剪接受体位点的hpv基因组的比对。
[0455]
图2显示了hpv以及预测剪接供体(sd)和剪接受体(sa)位点在基因组上的定位。
[0456]
图3显示了接收者操作特征(roc)曲线。hpv dna(papillocheck)用作参考，以评估hpv rna
‑
seq用于hpv基因分型应用的性能。auc意指曲线下面积。
[0457]
图4显示了在150个读数的闽值下，通过hpv rna
‑
seq(左侧条)相对于hpv dna
‑
papillocheck(右侧条)鉴定的hpv基因型数目。
[0458]
实例和附图不应以任何方式解释为限制本发明的范围。
[0459]
实例：
[0460]
材料与方法：
[0461]
用于rna保存的转运培养基的评估
[0462]
培养hpv16阳性宫颈鳞状细胞癌siha细胞，并且在四种转运培养基中以7x104个细胞/ml的最终浓度接种：preservcyt solution(hologic，usa)、novaprep hq solution(novaprep，法国)、rna protectcell reagent(qiagen，德国)和nuclisens lysis buffer(biom
é
rieux，法国)。将混合物在1ml管中等分，并且在室温下保持2小时(d0)、48小时(d2)、168小时(d7)、336小时(d14)和504小时(d21)。平行地，将不含转运培养基的7x104个细胞保
持
‑
80℃冷冻2小时、48小时、168小时、336小时和504小时作为对照。在d0、d2、d7、d14和d21时，将室温等分试样离心，去除培养基，并且在进行rna提取之前，将团块
‑
80℃冷冻短时间(＜1小时)。在nuclisens lysis buffer的特殊情况下，由于细胞被裂解，因此整个1ml等分试样
‑
80℃冷冻短时间，而无需事先离心。对于每个样品，使用picopure rna isolation试剂盒(thermo fisher scientific，usa)提取rna，连同相应的(时间匹配的)冷冻对照，使得所有样品都已经历一个冷冻循环。执行rt
‑
qpcr，以定量以下的表达：两种人基因g6pd(正向引物：tgcagatgctgtgtctgg(seq id no：2251)；反向引物：cgtactggcccaggacc(seq id no：2252)和gapdh(正向引物：gaaggtgaaggtcggagtc；反向引物：gaagatggtgatgggatttc(seq id no：2253))，以及两种病毒基因hpv16 e6(正向引物：atgcaccaaaagagaactgc(seq id no：2254)；反向引物：ttacagctgggtttctctac(seq id no：2255))和e7(正向引物：gtaaccttttgttgcaagtgtgact(seq id no：2256)；反向引物：gattatggtttctgagaacagatgg(seq id no：2257))。在bioanalyzer仪器(agilent，usa)上评价rna完整性。
[0463]
hpv选择和剪接位点分析
[0464]
由国际人乳头瘤病毒参考中心(international human papillomavirus reference center)(karolinska university，stockholm，瑞典)提供的hpv参考克隆充当参考基因组，除了从chen等人(evolution and taxonomic classification of alphapapillomavirus 7complete genomes：hpv18，hpv39，hpv45，hpv59，hpv68 and hpv70.plos one，2013，8：e72565)检索到的hpv68之外。本研究中使用的登录号为：k02718(hpv16)、x05015(hpv18)、j04353(hpv31)、m12732(hpv33)、x74477(hpv35)、m62849(hpv39)、x74479(hpv45)、m62877(hpv51)、x74481(hpv52)、x74483(hpv56)、d90400(hpv58)、x77858(hpv59)、u31794(hpv66)、kc470267(hpv68)、x94165(hpv73)和ab027021(hpv82)。使用geneious v10(kearse m.等人geneious basic：an integrated and extendable desktop software platform for the organization and analysis of sequence data.bioinforma oxf engl，2012，28：1647
‑
9)，用clustalw v2.1完成hpv基因组的多重比对。在比对时报告了先前已知的关于hpv16(zheng z
‑
m等人，papillomavirus genome structure，expression，and post
‑
transcriptional regulation.front biosci j virtual libr，2006，11：2286302)和hpv18(wang x等人，construction of a full transcription map of human papillomavims type 18 during productive viral infection.j virol，2011，85：808092)的剪接供体(sd)和剪接受体(sa)位点，并且未知的sd和sa位点的预测对于其它基因型通过序列类比手动完成(图1和2)。
[0465]
hpv rna
‑
sea amplisea定制实验对象组
[0466]
定制的ampliseq实验对象组设计为在pgm和ion proton仪器(thermo fisher scientific)两者上使用。靶序列的五个范畴如下定义：
[0467]
hpv剪接点(sp)：其为特异性hpv剪接事件的靶序列集合，所述hpv剪接事件涉及一对剪接供体(sd)和剪接受体(sa)位点。命名法包括“sp”标签。例如，“31_sp_1296_3295_j43
‑
46"代表hpv31(31)、剪接点(sp)、在hpv31基因组上的位置1296处的sd、在hpv31基因组上的位置3295处的sa和在扩增子上的位置43
‑
46处的接点(j)。接点坐标以4碱基间隔给出，其中前2个碱基对应于序列的供体部分(或左侧部分)，并且后2个碱基对应于受体部分(或右侧部分)。在表2a和2abis处给出了对应于剪接点集合的引物和扩增子。
[0468]
hpv非剪接点(unsp)：靶序列集合，其为在不存在任何剪接事件的情况下，跨越sd或sa位点的特异性hpv基因组区域。命名法包括“unsp”标签。例如，“31_unsp_1296_1297_j43
‑
46”代表hpv31(31)、非剪接的(unsp)、在hpv31基因组上的位置1296处的扩增子的左侧部分的最后一个碱基、在hpv31基因组上的位置1297处的扩增子的右侧部分的第一个碱基、在扩增子上的位置43
‑
46处的接点(j)。在表2b和2bbis处给出了对应于非剪接点集合的引物和扩增子。在此上下文中，术语
‘
接点’指外显子
‑
内含子界面(即在剪接事件的情况下，在其中将发现供体或受体位点的位置)，并且如节段“测序数据处理”中所述，相关的接点坐标用于在生物信息学上表征非剪接的序列。
[0469]
远离剪接点的hpv基因组(gen)：其为远离任何sd或sa位点的特异性hpv基因组区域的靶序列集合。命名法包括“gen”标签。例如，“45_gen_1664_1794_noj”代表hpv45(45)、hpv基因组区域(gen)、从hpv45基因组上的位置1664到位置1794的扩增子坐标。在表2c和2cbis处给出了对应于基因组集合的引物和扩增子。
[0470]
hpv
‑
人融合序列(fus)：假设驱动的病毒
‑
细胞融合转录物集合，其基于先前的描述(wentzensen n等人，characterization of viral
‑
cellular fusion transcripts in a large series of hpv16 and 18 positive anogenital lesions.oncogene，2002，21：4192622
‑
26，tang k
‑
w等人，the landscape of viral expression and host gene fusion and adaptation in human cancer.nat commun，2013，4：2513，peter m等人，myc activation associated with the integration of hpv dna at the myc locus in genital tumors.oncogene，2006，25：5985
‑
93，lu x等人，multiple
‑
integrations of hpv16 genome and altered transcription of viral oncogenes and cellular genes are associated with the development of cervical cancer.plos one，2014，9：e97588，kraus i等人，the majority of viral
‑
cellular fusion transcripts in cervical carcinomas cotranscribe cellular sequences of known or predicted genes.cancer res，2008，68：251422)。对于每种hpv，将18个融合序列候选物加入设计中，所述融合序列候选物涉及用于病毒部分的sa2或者假定的断点1或2(put.bkpt，参见图2)、以及用于细胞部分的来自myc或pvt1癌基因的特异性外显子。例如，“18_fus_929_myc_001_外显子3_j37
‑
40”代表hpv18(18)、候选融合转录物(fus)、与myc mrna同种型001外显子3融合的在hpv18基因组上的位置929处的断裂/融合、在扩增子上的位置37
‑
40处的接点(j)。在表2d和2dbis处给出了对应于融合集合的引物和扩增子。
[0471]
人序列(hg)：用作内部对照的30种人序列的集合，其从可公开获得的ampliseq项目检索到，并且代表管家基因(actb、b2m、gapdh、gusb、rplp0)、上皮标记物(krt10、krt14、krt17)、癌基因、肿瘤抑制基因、经典癌症途径和hpv癌蛋白的直接或间接下游效应子(akt1、bcl2、braf、cdh1、cdkn2a、cdkn2b、erbb2、fos、hras、kras、met、mki67、myc、notch1、pcna、pten、rb1、stat1、tert、top2a、tp53、wnt1)。这些序列的命名法包括“hg”标签。例如，“hg_top2a_e21e22”代表人拓扑异构酶2amrna外显子(wang x等人2011，wentzensen n等人，2002)。在表2e和2ebis处给出了对应于人集合的引物和扩增子。
[0472]
总的来说，750个靶序列被包括到实验对象组内(表1)，并且可以用525种独特引物(表2a
‑
2e)的库进行扩增。实验对象组的平均扩增子大小(包括引物)为141bp(范围：81
‑
204bp)。在表2abis
‑
2ebis中给出了包括引物的核酸序列连同其相应的扩增子和扩增子序
列的详细表格。
[0473]
下表1显示了hpv rna
‑
seq ampliseq定制的实验对象组内容。对于每个范畴(sp、unsp、gen、fus、hg)以及每种病毒和细胞起源，指示了靶扩增子的数目。假定的高风险hpv通过星号(*)指示。
[0474][0475][0476]
表1
[0477]
[0478]
[0479]
[0480]
[0481]
[0482]
[0483]
[0484]
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[0609]
[0610]
[0611]
[0612][0613]
研究参与者
[0614]
研究参与者是在法国医院转诊用于阴道镜检查咨询的25至65岁女性。在其依照法国关于宫颈癌筛查计划的建议执行的细胞学测试的lsil或hsil结果的背景下，将患者转诊用于阴道镜检查。患者根据法国法律提供了书面知情同意书。
[0615]
样本收集
[0616]
生殖器样品紧在执行阴道镜检查之前使用宫颈取样装置收集，在充满20ml preservcyt solution(hologic，usa)的小瓶中浸入并冲洗，并且在室温下送往在institut pasteur，paris，法国处的hpv national reference center(cnr)。从2014年7月到2015年4月，来自3个不同法国中心的84个患者入选研究：chu angers(n＝66)；chu kremlin
‑
(n＝10)；chu tours(n＝6)。由于技术原因(样品泄漏，n＝1)或法律问题(n＝7)、或者因为它们用于初始技术测试(rna保存、rna提取和扩增，n＝4)，样品从研究中去除。剩余的72个样品(hsil＝37；lsil＝35)进行处理。
[0617]
数据收集
[0618]
收集了下述生物临床数据：细胞学测试的日期和结果、在细胞学测试时的年龄、阴道镜检查后所有可用的组织学结果的日期和结果。由于阴道镜检查在常规医疗保健的背景下执行，因此在正常阴道镜检查的情况下并不执行活组织检查。
[0619]
使用papillocheck test kit(hpv dna)的hpv dna检测
[0620]
在cnr处接收后，将16ml细胞学样品转移到50ml falcon管内，并且以4500g离心10分钟。去除上清液并且用1ml pbs洗涤团块。然后将样品再次以5000g离心10分钟，并且去除上清液。在dna提取前，团块在
‑
80℃下冷冻。在dna提取(macherey nagel，德国)之后，根据制造商的说明书，使用papillocheck test kit(greiner bio
‑
one gmbh，德国)完成hpv检测。
[0621]
rna提取和表征
[0622]
与hpv dna程序平行，将3
×
1ml等分试样的细胞学样本以14000rpm离心7分钟，去除上清液并且用1ml pbs洗涤团块。然后将样品再次以14,000rpm离心7分钟，并且去除上清液。在提取rna前，团块在
‑
80下冷冻。使用picopure rna isolation试剂盒(thermo fisher scientific)，包括柱上dna酶处理，伴随30μl的最终洗脱体积，来完成rna提取。在nanodrop(life technologies)上定量总rna，并且使用rin(rna完整值)，范围为1(强烈降解的rna)至10(完整rna)的质量评分，在bioanalyzer rna 6000 pico芯片(agilent)上评估rna完整性。对于每个样品，用45个扩增循环，以sybr green形式完成靶向来自以下的mrna的rt
‑
qpcr：管家基因actb(正向引物：catcgagcacggcatcgtca(seq id no：2258)；反向引物：tagcacagcctggatagcaac(seq id no：2259)；扩增子大小＝210bp)和gapdh(正向引物：gaaggtgaaggtcggagtc(seq id no：2260)；反向引物：gaagatggtgatgggatttc(seq id no：2261)；扩增子大小＝226bp)。还运行了rt阴性(rt
‑
)pcr，以评估rna提取后残留dna的存在。
[0623]
扩增和测序
[0624]
从rna起始，使用superscript iii(n＝17个样品)或superscript iv(n＝55个样品)(thermo fisher scientific)与随机六聚体和最终的rna酶h处理生成cdna。使用ampliseq library kit 2.0和ampliseq定制实验对象组wg_wg00141，伴随在衔接子的连接前的21个扩增循环，来制备文库。每个样品个别地加上条形码。仅对阳性文库进行测序。总的来说，在4次ion proton运行中，对55个临床样品加上1个细胞模型(siha)进行测序。
[0625]
测序数据处理
[0626]
通过仅报告唯一映射的读数(
‑‑
outfiltermultimapnmax 1)并关闭剪接比对(
‑‑
alignintronmax 1)，在局部比对模式(参数
‑‑
alignendstype endtoend)下，使用star23 v2.5.3a，将读数与扩增子的参考序列进行比对。每个扩增子的表达通过唯一映射到其分别
序列的测序读数数目(读数计数)进行评估。对于含有剪接点的参考序列，仅保持在连接位点处映射并且包含接点前至少10个碱基和接点后10个碱基的读数。
[0627]
hsil预测模型
[0628]
扩增子的选择
[0629]
读取计数通过文库的大小进行标准化(每个读取计数除以给定样品的文库大小/跨越样品的平均文库大小的比率)，并且选择了捕获16种高风险或假定的高风险hpv的剪接点(sp)的215个扩增子。这些扩增子已用通用名称关于它们捕获的转录物类型进行注释，所述转录物跨越hpv种类是共享的(例如“sd1
‑
sa1”，参见图2)。对捕获跨越16个hpv种类保守的同源通用剪接点的扩增子进行总结，导致在模型中用作预测因子的18个变量的限定。55个临床样品中的33个已选择为呈现这些特异性扩增子的足够覆盖(20个单一感染和13个多重感染的样品)。数据集的剩余22个样品未用于逻辑回归分析中，因为它们在用于预测的剪接点处具有缺失或太低的表达信号，反映了例如hpv阴性样品。
[0630]
逻辑回归模型
[0631]
将高级别细胞学y调用为对于高级别(hsil)取值1，且对于低级别(lsil)取值0，以及扩增子集合x，使用逻辑回归模型来预测给定观察属于“1”类别的概率相对于它属于“0”类别的概率。逻辑回归将事件(此处为细胞学级别)的对数几率建模为预测变量(此处为通过其读取计数估计的扩增子表达)的函数。形式上，逻辑回归模型假设对数几率是预测因子的线性函数：
[0632][0633]
其中指示事件(是高级别的)的概率，βi是回归系数，且xi是解释变量，在我们的情况下，映射到扩增子的读数的log2数目。
[0634]
求解π，这给出：
[0635]
逻辑回归模型的实现
[0636]
为了限制过度拟合，本发明人使用了l2范数(岭)正则化，其允许缩小回归系数的量级，使得它们将更好地拟合未来的数据。本发明人使用r(http：//www.r
‑
project.org/)软件包glmnet(friedman j，hastie t，tibshirani r.regularization paths for generalized linear models via coordinate descent.j stat softw，2010，33：122)估计了逻辑模型。留一法(loo)交叉验证用于挑选正则化参数λ，使用给出最小平均交叉验证错误分类误差的参数。使用λ作为正则化参数，模型输出由对于逻辑回归模型中的每个变量的系数值β的估计值组成。然后，通过分开处理每个hpv种类，该模型用于预测多重感染观察的级别。
[0637]
训练集和测试集
[0638]
该模型基于从细胞学分析获得的临床结果lsil或hsil进行构建，并且在由20个单一感染的样品(5个lsil和15个hsil)组成的训练集上进行评估，以便避免混淆偏差。事实上预料到，在多重感染的样品的情况下，几种hpv可以不同地促成病变的进展或同一样品内的几个级别的混合，因为它们处于其周期的不同阶段。然后在由13个多重感染的样品组成的测试集上评估模型的性能。在这种情况下，每个hpv种类的扩增子集合分别用于对多重感染
的样品进行分类，以获得一种预测/hpv，如对于单一感染的样品完成的。例如，如果样品具有来自hpv16和hpv32两者的扩增子表达，则给出两种预测：一种仅使用映射到hpv16的测序读数，并且一种仅使用映射到hpv32的测序读数。像这样，从病毒学的角度对结果进行精细解释成为可能，因为本发明人可以区分哪种hpv负责病变。
[0639]
结果：
[0640]
用于rna保存的转运培养基的评估
[0641]
来自宫颈细胞的总rna在室温下的稳定性在四种溶液中进行评估：preservcyt(hologic)，最广泛地用于妇科样本收集的溶液；novaprep hq solution(novaprep)，用于细胞和dna回收的竞争产品，但从未对于rna保存进行评估；rna protect cell reagent(qiagen)，用于rna稳定性的流行溶液；和nuclisens lysis buffer(biom
é
rieux)，nuclisens自动化核酸程序的裂解缓冲液部分，其已被描述为rna稳定剂。掺料的hpv16阳性宫颈鳞状细胞癌细胞(siha)的量进行校准，以代表宫颈涂片。在室温下48小时后，细胞和病毒转录物的rt
‑
qpcr测量显示preservcyt中没有或很少的rna损失，在rna protect和nuclisens lysis buffer中仅有限的rna降解(＜1log)，以及在novaprep hq solution中明显的rna损失(＞2log)。在7天和最多21天后，仅preservcyt溶液提供了具有有限的rna降解模式的rna质量，如通过18s和28s rrna的检测所指示的。因此，本发明人决定使用preservcyt溶液来收集研究的妇科样本。
[0642]
hpv rna
‑
seq ampliseq定制实验对象组
[0643]
对于hpv1620和hpv1821已知的转录组图谱用于预测对于hpv31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68、73和82未知但很可能的剪接供体和剪接受体位点(图1和2)。所得到的重构的转录物以及hpv基因组序列用作用于设计ion ampliseq实验对象组的模板，所述实验对象组靶向16种高风险或假定的高风险hpv，并且命名为hpv rna
‑
seq。还将hpv基因组中的假定断点以及用作内部对照的30种人细胞基因加入设计中。总的来说，750个序列通过由525个独特引物(表1和表2a
‑
2e)构成的单一混合物靶向。
[0644]
样品、rna和测序
[0645]
来自3个不同法国中心(angers、kremlin
‑
和tours)并在preservcyt溶液中收集的72个妇科样品(hsil＝37；lsil＝35)进行rna提取，使用设计为从少至单个细胞中回收总rna的方法(picopure rna isolation试剂盒，thermo fisher scientific，usa)。在大多数情况下，总rna可使用nanodrop测量(70/72个阳性，关于阳性rna洗脱物的平均值＝18ng/μl)，并且可在bioanalyzer pico rna芯片上检测到，其模式指示rna降解(63/72个阳性，关于阳性的平均rna完整值＝2.2)。对于关于actb mrna(扩增子大小＝210bp)和gapdh mrna(扩增子大小＝226bp)的所有样品执行的rt
‑
qpcr，指示了rna质量与200
‑
250bp大小片段的扩增相容(actb mrna平均ct＝27.8；gapdh mrna平均ct＝30.1)。未能通过这种初始rt
‑
pcr质量控制的样品未进行测序。还运行了在省略逆转录步骤(rt
‑
)后执行的qpcr，并且一般而言显示了没有或很少的残留基因组dna的痕迹(actb dna平均ct＝38.4；gapdhdna平均ct＝35.6)。应注意，rna制备中残留的细胞dna或hpv dna的存在不是主要问题，因为ampliseq测定可以区别hpv转录物和基因组序列。ampliseq文库从总rna开始，并且在21个扩增循环后对于55个样品呈阳性(即，可在bioanalyzerhs dna芯片上检测到)。尝试增加一或两个扩增循环并未给结果带来任何显著改善(数据未显示)。总的来说，55个患者(hsil＝
27；lsil＝28)，加上作为对照的sihahpv16阳性细胞，已在ionproton上进行测序。将测序读数与靶序列比对，并且生成读数计数。达到240万个可用读数/样品的平均值(最小值＝0.02m；最大值＝8.3m)，其中平均210万个读数映射到用作内部对照的人序列(hg)(最小值＝0.01m；最大值＝8.06m)。即使观察到样品间变动，在所有样品中高度表达的人序列的检测促成验证测序程序，这对于hpv阴性样品的解释尤为重要。对于假设的众多hpv
‑
人融合序列(fus)中的一些，也观察到罕见的非零值，但都是假阳性，之所以如此鉴定是因为仅一半的参考序列被读数覆盖。
[0646]
用于hpv检测和基因分型的hpv rna
‑
seq
[0647]
hpv rna
‑
seq的第一个应用是检测给定样品通过实验对象组靶向的16种高风险或假定的高风险hpv中任一种的存在。映射到hpv特异性扩增子(即，范畴“sp”、“unsp”和“gen”的总和)的读数数目用于检测给定hpv基因型的存在。为了帮助确定检测闽值，我们将对于临床使用验证的hpv dna测试(papillocheck，greinerbio
‑
one gmbh)作为参考。对于100
‑
200个读数的闽值，获得两个测试之间的最佳灵敏度和特异性值(图3)。例如，对于检测由约50％hsil和50％lsil组成的这一群体中的高风险hpv(表3)，150个读数的闽值导致97.3％的灵敏度(se(hpv
‑
dna))、83.3％的特异性(sp(hpv
‑
dna))，导致92.3％的阳性预测值(ppv(hpv
‑
dna))和93.8％的阴性预测值(npv(hpv
‑
dna))。表3显示了在150个读数的闽值下，hpv rna
‑
seq用于hpv检测相对于hpv dna(papillocheck)的性能。给出了灵敏度(se)、特异性(sp)、阳性预测值(ppv)和阴性预测值(npv)。hpv 意指在患者中鉴定了至少一种hpv基因型。
[0648][0649]
表3
[0650]
图4中给出了通过两种技术鉴定的基因型的更详细视图。表4中概括了通过两种测试鉴定的单一感染、多重感染或hpv阴性样品的数目。应注意，因为hpv dna测试可以检测通过hpv rna
‑
seq捕获的16种高风险或假定的高风险hpv(hpv16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68、73和82)、加上8种另外的低风险hpv(hpv6、11、40、42、43、44/45、53和70)，所以比较仅基于两种测试共有的16种hpv。
[0651][0652]
表4
[0653]
使用150个读数的闽值，hpv rna
‑
seq比hpv dna测试多检测到两个阳性患者(n＝39相对于n＝37，表3)。hpv rna
‑
seq比hpv dna测试多鉴定了对于3个患者的多于一种hpv的存在(n＝13相对于n＝10个多重感染的样品，表4)。总体上，hpv16通过hpv rna
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seq以略微更低的出现率发现(n＝18相对于n＝19)，有利于其它基因型如hpv31、33、45、52、56、58或66，其通过hpv dna测试较不常发现(hpv31 n＝5相对于n＝4；hpv33 n＝3相对于n＝1；hpv45 n＝3相对于n＝2；hpv52 n＝5相对于n＝3；hpv56 n＝4相对于n＝2；hpv58 n＝5相对于n＝4；hpv66 n＝2相对于n＝1，图4)。除去hpv16，仅hpv51通过hpv rna
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seq比通过hpv dna更不频繁地发现(n＝2相对于n＝3)。如预计的，细胞模型(siha)在两种测试中均仅给出hpv16信号。
[0654]
hpv rna
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seq用作高级别细胞学的标记物
[0655]
本发明人对20个单一感染的样品进行探索性分析，其中他们显示了hpv rna剪接点可以用于预测高级别细胞学。他们将分析重点放在捕获剪接点(范畴“sp”)的扩增子上，以确保检测到hpv转录物。然而，用作训练集的单一感染样品的数目(n＝20)很少，特别是lsil样品的数目(n＝5)。loo交叉验证用于挑选使用岭正则化给出最小交叉验证误差的λ。λ＝0.08给出了15％的平均交叉验证误差。本发明人还使用嵌套交叉验证计算了20％的预测误差。这个误差率可以视为模型可以如何拟合未来数据集的指标。本发明人使用相应的参数来拟合正则化的逻辑回归模型，对每个扩增子分配系数(表5)，并且对每个样品分配高级别的概率(表6)。在v5中，第一列和第四列给出了通过扩增子捕获的剪接点的id，第二列给出了通过逻辑回归分配的系数，第三列指示了剪接点是来自“晚期”还是“早期”转录物。
[0656]
[0657][0658]
表5
[0659]
[0660][0661]
表6
[0662]
表6显示了(岭)逻辑回归的分类结果。第一列给出了样品id，第二列给出了样品为hsil的概率估计值，第三列和第四列给出了相应的预测，如果预测与通过细胞学评估的级别一致，则第五列含有真。
[0663]
除了一个观察之外，20个单一感染样品的级别被正确分类(表5)。有趣的是，应注意，通过细胞学分析分类为lsil的这个独特的错误分类样品(ionxpress_019_2613)，在对于hpv rna
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seq/细胞学取样完成的取样后多于一年执行的组织学检查后，进一步发现为含有lsil和hsil病变的混合物。
[0664]
然后使用估计的模型对13个多重感染的样品进行分类，其中一个样品内存在的每个hpv种类对于其在hsil发展中的牵涉个别地进行分类。如果至少一个hpv种类给出hsil预测，则该样品被视为hsil。我们计算了关于所有样品的hsil预测的性能，将没有剪接点的足够覆盖的6个样品和未超过hpv检测闽值的16个hpv阴性样品两者均不视为高级别的。与55个患者(单一感染、多重感染和hpv阴性)的细胞学相比，关于hsil预测的计算性能为se(cyto)＝66.7％、sp(cyto)＝85.7％、ppv(cyto)＝81.8％和npv(cyto)＝72.7％(表7中a)。还对于通过hpv rna
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seq鉴定的具有至少一种hpv的39个样品的子集计算了性能，在这种情况下，给出了se(cyto/hr )＝94.7％、sp(cyto/hr )＝80.0％、ppv(cyto/hr )＝81.8％和npv(cyto/hr )＝94.1％(表7中b)。在表7中，给出了灵敏度(se)、特异性(sp)、阳性预测值(ppv)和阴性预测值(npv)。“非hsil”意指或者通过hpv rna
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seq在样品中并未检测到hpv，或者检测到的hpv基因型无一给出hsil预测。
[0665]
[0666][0667]
表7
[0668]
应注意，hsil/lsil的比率在这两个群体之间保持相似(约1∶1)，使得ppv和npv的比较成为可能。最后，表8中呈现了关于hpv检测和基因分型(hpv rna
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seq相对于hpv dna)和高级别细胞学预测(hpv rna
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seq相对于细胞学)的概括，包括当可用时的宫颈活组织检查的以后组织学数据。
[0669]
[0670]
[0671][0672]
hpv rna
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seq用作分诊测试
[0673]
使用组织学作为黄金标准来评估hpv rna
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seq作为分诊测试的性能。然而，并非对
于所有患者都可获得来自组织学检查的结果。将hpv rna
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seq/细胞学测试与组织学分析分开的0至780天不等的时间间隔是本研究中的另一个局限性。为了尝试克服这些缺点，我们将hpv rna
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seq相对于组织学的性能与细胞学相对于组织学的性能进行比较，或考虑了所有可用的样品、或仅考虑了在hpv rna
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seq/细胞学后少于3个月完成组织学的样品、或仅考虑了在hpv rna
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seq/细胞学后少于6个月完成组织学检查的样品。另外并且对于每个范畴，我们区分了将hpv rna
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seqhpv阳性和hpv阴性患者一起分组时，或仅考虑hpv阳性患者时获得的性能。还完成了根据群体中的hsil流行率的ppv计算。
[0674]
参考文献：
[0675]
本技术自始至终，各种参考文献描述了本发明所属领域的技术。这些参考文献的公开内容在此引入本技术作为参考。