一种鳜鱼脊髓组织细胞系及其构建方法与应用与流程

1.本发明属于水生生物细胞及水产养殖病害防控技术领域，具体地说，涉及一种鳜鱼脊髓组织细胞系及其构建方法与应用。


背景技术：

2.鳜鱼(mandarin fish,siniperca chuatsi)味道鲜美，营养价值高。2019年我国鳜鱼养殖总产量近32万吨，产值突破200亿元。主要在广东、湖北、江西、安徽和江苏等省养殖，其中广东是鳜鱼产量最高的省份。随着鳜鱼养殖规模和密度的迅速扩大，多种病原微生物导致鳜鱼的疾病暴发。影响鳜鱼的病害主要有病毒性疾病、细菌性疾病、寄生虫病，病毒性疾病的危害最为严重，其中传染性脾肾坏死病毒、鳜鱼弹状病毒是影响鳜鱼最严重的病毒性病原。2015年以后，关于鳜鱼蛙虹彩病毒的报道逐渐增多，张文峰(aquaculture,520(2020):734989.)报道2017年广东省数百个鳜鱼养殖场感染了鳜鱼蛙虹彩病毒，有超过1000万条鳜鱼幼鱼因该病而死亡。鳜鱼蛙虹彩病毒的分离株与大口黑鲈蛙虹彩病毒属于同一分支。因此，目前传染性脾肾坏死病毒、蛙虹彩病毒、弹状病毒是影响鳜鱼的主要病毒性疾病。三种病毒均具有传染性强、致死率高，给鳜鱼养殖业造成了重大的经济损失，严重威胁该产业的健康发展。因此，如何预防和治疗这三种病毒病已成为当今鳜鱼养殖业急需解决的重要问题。细胞系是鱼类免疫学、功能基因组学和环境毒理学研究的强有力的工具，也是研究生物进化、发育和遗传的良好材料。同时，细胞系也是进行鱼类病毒学研究，分离、鉴定鱼类病毒及研制病毒疫苗所必须的材料。
3.鱼类原代细胞系的建立技术目前是一种较为成熟的技术，但是要获得针对病毒敏感的细胞系仍存着很大的偶然性和困难性。殷霞与刘景华在其主编的《动物病毒学》一书中指出，关于哪些类型的细胞对哪些种类的病毒具有敏感性，没有明确的规律性，似乎只能依靠经验，也就是通过实践来发现和验证。所以有效的途径是以数量对质量，即制备各种鱼类各种组织的原代细胞，从中筛选出敏感的细胞系。且同种组织中的不同类型细胞对病毒敏感性也不一样，因此最好进行细胞克隆以便筛选到更敏感的细胞系。目前来源于鳜鱼幼鱼或组织建立的细胞系有二个，一是一株鳜鱼幼鱼细胞系mff
‑
1，从早期的上皮样细胞与纤维样细胞混合的传到60代时变成了全是上皮样细胞；二是一种鳜脑细胞系的构建方法。但尚未有一种鳜鱼细胞系同时对鳜鱼传染性脾肾坏死病毒、鳜鱼蛙虹彩病毒和鳜鱼弹状病毒敏感。
4.因此，建立的对三种病毒同时敏感的鳜脊髓组织细胞系及其构建方法与应用具有创造性和新颖性。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明针对上述的问题，提供了一种鳜鱼脊髓组织细胞系及其构建方法与应用，以鳜鱼脊髓组织为对象，成功建立了鳜鱼脊髓组织细胞系，并对多种病毒感染，为分离、鉴定鱼类病毒及病毒疫苗制备提供重要研究平台和实验材料，同时，本发明建立的
方法也可以应用于从其它鱼类建立细胞系。
6.为了解决上述技术问题，本发明公开了一种鳜鱼脊髓组织细胞系，于2021年08月31日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为cctcc no：c2021226，名称为：鳜鱼脊髓组织细胞系ssc。
7.本发明还公开了一种上述的鳜鱼脊髓组织细胞系的构建方法，包括以下步骤：
8.步骤1、脊髓组织的处理：取鳜鱼脊髓组织并进行消毒、切块，处理后浸泡待用；
9.步骤2、原代培养：取步骤1处理后的鳜鱼脊髓组织经胰酶消化液消化后进行原代培养；
10.步骤3、传代培养：原代培养细胞汇合度达60
‑
90％时进行传代培养，每5
‑
7天传代一次。
11.可选地，所述的步骤1中取鳜鱼脊髓组织并进行消毒、切块，处理后浸泡待用具体为：取鲜活鳜鱼，用75％酒精对鳜鱼进行消毒，无菌条件下解剖取脊髓组织，切块，浸泡于漂洗液进行漂洗。
12.可选地，所述的步骤1中所述的漂洗液为含有400iu/ml青霉素、400μg/ml链霉素的hbss溶液。
13.可选地，所述的步骤2中取步骤1处理后的鳜鱼脊髓组织经胰酶消化液消化后进行原代培养具体为：将步骤1得到的脊髓组织加入胰酶消化液，在室温下消化20
‑
30min，消化后收集细胞悬液；将细胞悬液加入1
‑
2ml含血清培养液终止消化，并用100μm滤网过滤，吸取滤液1200r离心5min后，弃上清，沉淀中加入增值培养液重悬，重悬后，置于24
‑
28℃恒温培养箱开始原代培养，每2
‑
3天按半量换液方式更换增值培养液。
14.可选地，所述的胰酶消化液为0.5％trypsin
‑
edta(10x)；所述的增值培养液为含有20％胎牛血清、100iu/ml青霉素、100μg/ml链霉素的l15培养液。
15.可选地，所述的步骤3中原代培养细胞汇合度达60
‑
90％时进行传代培养，每5
‑
7天传代一次具体为：原代培养细胞长至汇合度达60
‑
90％时，加入胰蛋白酶消化，用传代培养液悬起细胞，然后接种于培养瓶内在24
‑
28℃培养箱中培养，每5
‑
7天传代一次。
16.可选地，所述的步骤3中传代培养液为含有10
‑
15％胎牛血清、100iu/ml青霉素、100μg/ml链霉素的l
‑
15培养液。
17.本发明还公开了一种上述的鳜鱼脊髓组织细胞系在鳜鱼传染性脾肾坏死病毒、鳜鱼蛙虹彩病毒、鳜鱼弹状病毒分离、培养、检测和疫苗制备中的应用。
18.与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：
19.1)本发明对鳜鱼脊髓组织细胞进行了原代及传代培养，取得了较好的培养效果，从而建立了鳜鱼脊髓组织细胞系，已连续传至35代。
20.2))细胞系可连续传代，因此本发明技术方案能提供大量的鳜鱼脊髓组织来源细胞，且细胞增殖或传代培养液配方简单，无需添加外源生长因子，传代细胞能维持良好的生长状态，并可对其进行冷冻保存。
21.3)本发明所构建的细胞系同时对鳜鱼传染性脾肾坏死病毒、鳜鱼蛙虹彩病毒、鳜鱼弹状病毒均敏感，且对弹状病毒、蛙虹彩病毒细胞病变时间快。因此，该细胞系可很好地应用于鳜鱼病毒的分离、繁殖及病毒疫苗研究。同时，也为其它鱼类病毒的分离培养及疫苗研制等提供了细胞材料。
22.当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。
附图说明
23.此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
24.图1是本发明实施例1的鳜鱼脊髓组织传代培养细胞图；
25.图2是本发明不同培养温度对脊髓组织细胞生长的影响；
26.图3是本发明不同胎牛血清浓度对脊髓组织细胞生长的影响；
27.图4是本发明实施例3中针对实施例1的第30代脊髓组织细胞中期染色体分裂相图；
28.图5是本发明实施例4中针对实施例1的鳜鱼蛙虹彩病毒感染细胞4天的cpe观察图；
29.图6是本发明实施例4中针对实施例1的鳜鱼弹状病毒感染细胞1天的cpe观察图；
30.图7是本发明实施例4中针对实施例1的鳜鱼isknv感染细胞7天的cpe观察图。
具体实施方式
31.以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。
32.实施例1
33.一种鳜鱼脊髓组织细胞系的构建方法，具体包括如下步骤：
34.(1)脊髓组织的处理：取鳜鱼脊髓组织并进行消毒、切块，处理后浸泡待用，具体为：取鲜活鳜鱼，用75％酒精对鳜鱼进行消毒，无菌条件下解剖取脊髓组织，切块，浸泡于漂洗液进行漂洗；
35.所述的漂洗液为含有400iu/ml青霉素、400μg/ml链霉素的hbss(1x)(hank's balanced salt solution)溶液。
36.(2)原代培养：取上述处理后的鳜鱼脊髓组织经胰酶消化液消化后进行原代培养，具体为：将步骤(1)得到的脊髓组织加入胰酶消化液(0.5％trypsin
‑
edta(10x))，其中，胰酶消化液的添加量是脊髓组织体积的10倍，在室温下消化20
‑
30min，消化后收集细胞悬液；将细胞悬液加入1
‑
2ml含血清培养液(含有100iu/ml青霉素、100μg/ml链霉素、15％胎牛血清的l15培养液)终止消化，并用100μm滤网过滤，吸取滤液1200r离心5min后，弃上清，沉淀中加入增值培养液重悬，重悬后，置于24
‑
28℃恒温培养箱开始原代培养，每2
‑
3天按半量换液方式更换增值培养液。
37.所述增值培养液为含有20％胎牛血清、100iu/ml青霉素、100μg/ml链霉素的l15培养液。
38.(3)传代培养：原代培养细胞汇合度达60
‑
90％时进行传代培养，每5
‑
7天传代一次，具体为：原代培养细胞长至汇合度达60
‑
90％时，加入胰蛋白酶消化，用传代培养液悬起细胞，然后接种于培养瓶内在24
‑
28℃培养箱中培养，每5
‑
7天传代一次；传代传至第5
‑
10代时，将培养液中胎牛血清浓度降为15％；传至第15
‑
20代时，将培养液中胎牛血清含量降至10％；参见实施例1中细胞生长状态，以成纤维样细胞为主要形态，如图1所示；细胞能稳定
增殖，目前细胞已传至35代以上，构建得到鳜鱼(mandarin fish,siniperca chuatsi)脊髓组织细胞系(spinal cord tissue cell lines)，于2021年08月31日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为cctcc no：c2021226，名称为：鳜鱼脊髓组织细胞系ssc。
39.其中，传代培养液为含有10
‑
15％胎牛血清、100iu/ml青霉素、100μg/ml链霉素的l
‑
15培养液。
40.下面结合具体的实验数据来说明本发明的技术效果：
41.1.不同培养温度对细胞生长情况的影响。
42.取上述实施例1的8
×
104/ml ssc细胞(30代)，将细胞分别接种于含10％fbs的l15培养液，分别于17℃、24℃、28℃、37℃培养箱下培养。于培养后1、3、7天用scepter
tm handheld automated cell counter(细胞计数器)进行细胞计数，绘制细胞系在不同培养温度下的生长量。如图2所示，ssc细胞在28℃生长速度明显高17℃、24℃、37℃培养。
43.2.不同fbs浓度下对细胞生长情况的影响。
44.取上述实施例1的8
×
104/ml ssc细胞(30代)，将细胞分别接种于含10％、20％fbs的l15培养液，于28℃培养箱下培养。于培养后1、3、7天用scepter
tm handheld automated cell counter(细胞计数器)进行细胞计数，绘制细胞系在不同fbs浓度下的生长量。
45.如图3所示，ssc细胞在20％fbs培养液中生长速度明显高于10％fbs。但鉴于培养液的成本控制原因，在传代培养时，特别是传至第15
‑
20代后，胎牛血清浓度可适当降低至10
‑
15％。
46.实施例2验证实施例1制备得到的ssc细胞系细胞的冻存后复苏性能力
47.1)取实施例1处于对数生长期的细胞，经胰酶消化后获得单细胞悬液，1600g离心10min，弃掉上清液。向细胞沉淀中加入适量的细胞冻存液(zenoaq，jpn)，重悬，转移入1.8ml无菌冻存管中；将冻存管放入程序降温盒中，
‑
80℃冰箱过夜，隔天放入液氮中长期保存；
48.2)对上述冻存的细胞进行复苏，将冻存管从液氮罐中取出，放入37℃水浴锅中快速摇晃至融化，加至含6
‑
8ml培养液的细胞瓶中，28℃培养箱中培养，隔天换液。
49.不同代次细胞冻存后复苏率为82％
‑
96％，复苏细胞能够贴壁并生长分裂，并可以正常传代，细胞形态与增殖能力同冻存前无明显差异。
50.实施例3对实施例1获得的ssc细胞系的染色体分析
51.取上述实施1的ssc细胞系(30代)，分别将30代的细胞贴壁稳定生长36
‑
48h，加入终浓度0.6
‑
1.0μg/ml秋水仙素作用4
‑
8h，胰酶消化后1600g离心10min回收细胞；75mm kcl 37℃低渗处理30min，再加入2ml固定液(甲醇：冰醋酸3：1)预固定；1600g离心10min，弃上清，加固定液室温固定30min；重复固定步骤2
‑
3次；最后一次固定留适量固定液，轻柔吹匀；吸取固定悬液，15cm高处滴于
‑
20℃预冷的载玻片上，迅速用力将液滴吹散，室温晾干；姬姆萨染液染色10min，油镜下观察实施例1的细胞染色体形态，计数染色体数目。
52.染色体数目和核型是细胞遗传学的基础，是鉴定生物种属和性别等较为准确的指标；在细胞培养的过程中，染色体常用来鉴定细胞的来源、是否发生转化的可靠指标。上述染色体分析的结果显示：实施例1的细胞在统计的100个分裂相中，染色体数目从44
‑
50不等，但85％的分裂相染色体数目为48条，如图4所示，符合鳜鱼染色体数目特征。虽然染色体数目分布不均匀，但二倍体染色体数目出现频率是最高的，其他非整倍体只占了很小的比
例。
53.实施例4对实施例1获得的ssc细胞系的病毒感染实验
54.1)取上述实施例1的ssc细胞系(28代)；
55.2)细胞病变效应(cytopathic effect，cpe)观察：待接种细胞铺满25cm2细胞瓶底后，将病毒溶液加入细胞培养瓶中，28℃孵育1小时，弃病毒溶液，更换为含2％胎牛血清的l15细胞培养液，继续培养，每天用倒置显微镜观查细胞病变。
56.3)滴度测定：细胞完全病变后，收取病毒悬液，将收获的病毒液10倍系列稀释至10
‑
10
，每个稀释度重复6孔，加入接种了上述细胞的96孔板中，28℃培养箱中培养，每天观察cpe产生，按照reed&muench(reed and muench,1938)方法计算病毒滴度。
57.细胞变圆为病毒感染后的光镜观察的一个描述，病毒感染后导致细胞变圆、死亡。如图5所示，结果显示，鳜鱼蛙虹彩病毒感染细胞4天后观察到明显的cpe，细胞变圆、圆缩，折光性增高；圆缩细胞逐渐变多，整个细胞单层形成一种网状联结；最后细胞单层完全解体。鳜鱼蛙虹彩病毒感染上述细胞完全cpe后测定病毒感染滴度，滴度达到10
9.6
tcid
50
ml
‑1。
58.如图6所示，鳜鱼弹状病毒感染细胞24小时后观察到明显的cpe，细胞变圆、圆缩，折光性增高，圆缩细胞逐渐变多，整个细胞单层形成一种网状联结；最后细胞单层完全解体。鳜鱼弹状病毒感染上述细胞完全cpe后测定病毒感染滴度，滴度达到10
9.4
tcid
50
ml
‑1。
59.如图7所示，鳜鱼isknv病毒感染细胞7天后观察到明显的cpe，细胞变圆、圆缩，折光性增高，圆缩细胞逐渐变多，整个细胞单层形成一种网状联结；最后细胞单层完全解体。isknv感染上述细胞完全cpe后测定病毒感染滴度，滴度达到10
7.4
tcid
50
ml
‑1。
60.上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。