一种具有产香抑膻功能特性的菌种筛选方法及其应用与流程

1.本发明涉及一种具有产香抑膻功能特性的菌种筛选方法及其应用，属于微生物技术领域。


背景技术：

2.山羊乳营养价值高，富含维生素、矿物质元素以及活性物质，其蛋白质、氨基酸含量均普遍高于牛乳。另外，其乳糖含量低且易于吸收，是现代人类健康的营养佳品，有“奶中之王”之称。然而，山羊乳及其乳制品的风味较为独特，其相应的产品时常存在着膻味过重的问题发生，进一步降低了消费者的接受度，制约了羊乳产业的进一步发展。
3.为改善和提升山羊乳制品的风味品质，目前，主要采用外源添加途径和内源增香途径来加以调控。但与常规化学增香、调香剂等外源增香途径相比，通过微生物发酵达到内源增香的目的更加的安全健康、且不受原料的限制。
4.产香微生物是指在生长过程中可以发酵代谢产生香味物质的微生物，大部分为乳酸菌、双歧杆菌、酵母菌和霉菌类，不同的产香微生物产生的香味物质各不相同。通过对传统酸凝奶酪山羊乳饼的特征风味进行鉴定和香气品质研究，我们发现奶香味、果香味属性易被消费者接受，而膻味、过重酸味不易被接受。同时，具有奶香味特征的2
‑
庚酮、2
‑
壬酮等甲基酮物质、具有坚果、杏仁味的苯甲醛、具有果香味的丁酸乙酯等物质对膻味具有抑制作用。
5.因此，对于发酵菌株而言，增香(呈奶香味、果香味等风味物质的增加)、抑膻(己酸、辛酸等脂肪酸含量的降低)菌株的筛选可用于改善和提升山羊乳制品的风味品质。


技术实现要素：

6.本发明所要解决的技术问题是：针对传统工艺下山羊乳制品的膻味较重问题，提供一种具有产香抑膻功能特性的菌种筛选方法。
7.为了解决上述问题，本发明提供了一种具有产香抑膻功能特性的菌种筛选方法，包括如下步骤：
8.步骤1：在无菌环境下，分别从多份鲜制乳饼中取样品至无菌试管中，加入无菌水充分振荡溶解均匀，得到菌悬液，用无菌水将菌悬液稀释成不同浓度的菌液，依次涂布于mrs琼脂培养基上恒温下培养，待长出菌落后，挑取单菌落划线纯化培养获得单一菌株；
9.步骤2：将上述所获得的单一菌株分别接种于mrs液体培养基，进行恒温发酵，分别得到单一菌株的发酵液；
10.步骤3：将上述获得的发酵液分别进行离心，离心所得的沉淀分别用无菌水清洗多次，然后分别在清洗后的沉淀中加入与步骤1中的菌悬液等体积的无菌水，涡旋震荡，得到发酵培养液；
11.步骤4：将步骤3所得发酵培养液接种至无菌山羊乳中，于37℃下进行发酵培养至ph＝4.6发酵结束，然后自然冷却至室温，得到待测发酵乳；
12.步骤5：取待测发酵乳样品分别进行感官评价初筛和gc
‑
ms香气测定，经过菌种鉴定，获得具有产香抑膻功能特性的菌种。
13.优选地，所述步骤1中的mrs琼脂培养基的成分包括：蛋白胨10.0g/l、牛肉浸粉8.0g/l、酵母浸粉4.0g/l、葡萄糖20.0g/l、磷酸氢二钾2.0g/l、柠檬酸氢二铵2.0g/l、乙酸钠5.0g/l、硫酸镁0.2g/l、硫酸锰0.04g/l、琼脂14.0g/l和吐温801.0g/l；所述步骤2中的mrs液体培养基的成分包括：蛋白胨10.0g/l、牛肉浸粉10.0g/l、酵母浸粉5.0g/l、葡萄糖20.0g/l、硫酸镁0.1g/l、乙酸钠5.0g/l、磷酸氢二钾2.0g/l、柠檬酸铵2.0g/l、硫酸锰0.05g/l和吐温801.0g/l。
14.优选地，所述步骤1中的菌悬液的浓度为0.1g/ml；所述不同浓度的菌液包括浓度分别为10
‑2、10
‑3、10
‑4、10
‑5和10
‑6的菌液。
15.优选地，所述步骤1中恒温下培养的条件为：温度37℃，时间12h；所述步骤2中恒温发酵的条件为：温度37℃，时间12h。
16.优选地，所述步骤3中离心的条件为：温度4℃，转速6000rpm，时间15min；所述震荡的条件为：转速6000rpm，时间10min。
17.优选地，所述步骤4中发酵培养液与无菌山羊乳的体积比为5％。
18.优选地，所述步骤5中的感官评价包括香气接受度和香气强度评价指标；所述gc
‑
ms香气测定包括：采用顶空固相微萃取提取待测发酵乳中的风味物质，采用gc
‑
ms对所述的风味物质进行分析鉴定，分析关键香气成分的产生及其含量变化。
19.优选地，所述关键香气成分包括2
‑
庚酮、苯甲醛、己酸和辛酸。
20.本发明还提供了一种具有产香抑膻功能特性的菌种，采用上述的具有产香抑膻功能特性的菌种筛选方法筛选而得，包括乳酸乳球菌sd
‑
3、乳酸片球菌dn
‑
1和植物乳杆菌gm
‑
6；
21.所述乳酸乳球菌sd
‑
3的保藏编号为cctcc m 2021743，拉丁名为lactococcus lactis sd
‑
3，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2021年6月23日，保藏地址为湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心；
22.所述乳酸片球菌dn
‑
1的保藏编号为cctcc m 2021794，拉丁名为pediococcus lactis dn
‑
1，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2021年6月28日，保藏地址为湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心；
23.所述植物乳杆菌gm
‑
6的保藏编号为cctcc m 2021744，拉丁名为lactobacillus plantarum gm
‑
6，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2021年6月23日，保藏地址为湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心。
24.本发明还提供了上述的具有产香抑膻功能特性的菌种在发酵山羊乳中的应用。
25.gc
‑
ms香气测定表明所述乳酸乳球菌乳酸sd
‑
3所制备的发酵乳样品2
‑
庚酮、苯甲醛以及酯类化合物的含量较高，感官评价结果最佳，总体接受度以及香气接受度感官得分均为最高，其中奶香味最为丰富，香气化合物种类和总量上更为丰富；
26.gc
‑
ms香气测定表明所述乳酸片球菌dn
‑
1所制备的发酵乳样品含有大量的2
‑
庚酮、异戊醇等关键香气化合物，丁酸、己酸、辛酸等脂肪酸类化合物含量较低；
27.gc
‑
ms香气测定表明所述植物乳杆菌gm
‑
6所制备的发酵乳样品香气接受度较高，醛类化合物含量较高，坚果风味明显。
28.与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
29.1.本发明的一种具有产香抑膻功能特性的菌种筛选方法，筛选得到的菌株可以保证发酵样品能内源产生更多的对膻味有抑制作用的呈奶香味、果香味物质，并一定程度上减少了膻味脂肪酸成分的产生，在不需要外源添加香气物质的基础之上，优化了发酵乳品的风味品质，降低了发酵乳品制作的生产成本；
30.2.本发明的筛选方法筛选得到的三株具有产香抑膻功能特性的菌种乳酸乳球菌(lactococcus lactis)sd
‑
3、乳酸片球菌(pediococcus lactis)dn
‑
1和植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)gm
‑
6发酵的山羊乳，产生3
‑
羟基
‑2‑
丁酮、2
‑
庚酮、2
‑
辛酮以及2
‑
壬酮的含量均较高，以上酮香类物质具有奶油、乳酪、椰子、果香以及甜香等香气特征；同时还含有高含量的杏仁味的苯甲醛和果香味的异戊醇，以上在酸凝奶酪山羊乳饼的特征风味鉴定过程中被作为具有抑膻作用的、积极影响的香气成分；与此同时，通过分析不同菌种发酵样品的香气成分，还可以看出由sd
‑
3、dn
‑
1和gm
‑
6发酵得到的样品所产生的具有膻味的脂肪酸，与对比例中商业菌粉yf
‑
l811制备的发酵乳样品相比其含量也较低。即从香气物质的的生成情况来看，三株乳酸菌应用于发酵山羊乳时，具有较为明显的产香抑膻特性；
31.3.本发明筛选得到的乳酸乳球菌乳酸sd
‑
3、乳酸片球菌dn
‑
1和植物乳杆菌gm
‑
6发酵的山羊乳，在色泽、质地、滋味接受度、香气接受度和总体接受度等感官接受度评价指标方面均高于商业菌粉yf
‑
l811制备的发酵乳样品。
附图说明
32.图1为实施例2、3、4和对照实施例下的发酵山羊乳的感官评价雷达图。
33.保藏说明
34.乳酸乳球菌sd
‑
3的保藏编号为cctcc m 2021743，拉丁名为lactococcus lactis sd
‑
3，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2021年6月23日，保藏地址为湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心；
35.乳酸片球菌dn
‑
1的保藏编号为cctcc m 2021794，拉丁名为pediococcus lactis dn
‑
1，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2021年6月28日，保藏地址为湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心；
36.植物乳杆菌gm
‑
6的保藏编号为cctcc m 2021744，拉丁名为lactobacillus plantarum gm
‑
6，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2021年6月23日，保藏地址为湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心。
具体实施方式
37.为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下。
38.本发明的各实施例中所用到的mrs琼脂培养基的成分包括：蛋白胨10.0g/l、牛肉浸粉8.0g/l、酵母浸粉4.0g/l、葡萄糖20.0g/l、磷酸氢二钾2.0g/l、柠檬酸氢二铵2.0g/l、乙酸钠5.0g/l、硫酸镁0.2g/l、硫酸锰0.04g/l、琼脂14.0g/l和吐温801.0g/l。
39.本发明的各实施例中所用到的mrs液体培养基的成分包括：蛋白胨10.0g/l、牛肉浸粉10.0g/l、酵母浸粉5.0g/l、葡萄糖20.0g/l、硫酸镁0.1g/l、乙酸钠5.0g/l、磷酸氢二钾2.0g/l、柠檬酸铵2.0g/l、硫酸锰0.05g/l和吐温801.0g/l。
40.本发明的各实施例中所得发酵乳中的香气化合物采用顶空固相微萃取(hs
‑
spme)进行提取，气相色谱
‑
质谱联用技术(gc
‑
ms)进行分析测定，步骤如下：
41.精确称量4.0g的发酵乳于15ml的萃取瓶中，加入内标物100μl 20mg/l的2
‑
辛醇，放入转子，在60℃的恒温水浴锅中平衡5min，将老化20min后的萃取头装置(75μm car/pdms)插入15ml的萃取瓶中，于60℃下萃取40min。然后，萃取完成后，将萃取头推入250℃的气相进样口中解析5分钟，结合gc
‑
ms对所提取的挥发性化合物进行分析鉴定。
42.气相色谱条件如下：色谱柱：hp
‑
innowax(60m
×
0.25mm
×
0.25μm)；进样口温度：250℃；程序升温：40℃保持4min，4℃/min升至100℃，保持2min，3℃/min升至150℃，最后以10℃/min升到230℃，保持5min；载气：氦气(纯度为99.99％)；流量：1ml/min；进样方式：不分流进样。质谱条件：电子轰离能：70ev；离子源温度：230℃；四极杆温度：150℃；发射电流：35μa；扫描速度：1.9scans/s；质量扫描范围：30
‑
450amu。每次解析完成后，均需将萃取头在250℃下的老化仪器中进行老化20min。每个样品重复分析3次。
43.所有挥发性化合物的定性首先采用nist11和wiley7n.1质谱谱库进行检索，根据匹配度、离子碎片等信息初步确定化合物。再利用c6
‑
c30正构烷烃标准品的保留时间计算出保留指数(ri)。将以上两种方法结合最终完成挥发性化合物的定性。
44.本发明的各实施例中筛选菌株所得发酵乳中的感官评价描述词及参考标准，如下所示：
45.(1)感官接受度检验：10名具有食用和消费山羊乳制品习惯的评价员，在独立的感官隔间内依次对三位数随机编码的发酵乳样品进行接受度检验，室内温度保持在20℃。分别对样品的色泽、质地、香气、滋味及整体接受度这5项指标进行评价。采用9点喜好度标度的方式对样品进行打分(数字1
‑
9分别代表极其讨厌、非常讨厌、比较讨厌、有点讨厌、既不讨厌也不喜欢、有点喜欢、比较喜欢、非常喜欢、极其喜欢)。
46.(2)感官评价流程：15名经过筛选和培训的感官评价员对发酵乳的10种香气属性进行评价，香气特征及参考物有：“奶香味”、“酸味”、“果香味”、“酒味”、“硫味”、“酸腐味”、“动物的(山羊味)”、“脂肪味”、“坚果味”和“奶酪味”。这10个香气描述词的定义以及参考样如下：“奶香味”，0.002％的双乙酰水溶液；“酸味”，0.06％的乳酸水溶液；“果香味”，0.002％的己酸乙酯水溶液；“酒味”，30％的乙醇水溶液；“硫味”，捣碎的鸡蛋壳；“酸腐味”，0.1％的丁酸水溶液；“动物的(山羊味)”，新鲜山羊奶；“脂肪味”，色拉油；“坚果味”，生坚果；“奶酪味”，新鲜椰子肉或黄油。待测试样品用数字随机编码，每个样品切成大小均匀的颗粒并称取5g，分别保存在一个有盖的、无气味的玻璃容器中(总容量为50ml)。按随机的顺序排列、依次呈送给评价员进行感官评价测试。每个香气属性以0
‑
10分的强度等级进行划分(强度说明：0＝无强度或香气无察觉，5＝中等强度，10＝非常强)。
47.本发明各实施例中对菌种的鉴定采用如下方法：
48.对菌株进行16s rdna序列鉴定。在鉴定前，对dna序列进行pcr扩增，其反应体系为：2μl的27f引物(5
’‑
gagagtttgatcctggctcag
‑3’
)(seq id no:1)；2μl的1492r引物(5
’‑
tacggctaccttgttacgac
‑3’
)(seq id no:2)；2μl菌液；19μl的ddh2o；25μl的2
×
gold star best mixed。pcr反应程序为：(1)95℃10min，(2)94℃30s，(3)55℃30s，(4)72℃1.5min，步骤(2)～(4)重复30个循环，(5)72℃5min，(6)4℃保存。然后将pcr产物用1.0％琼脂糖进行凝胶电泳检测，在100v电压下0.5
×
tae电泳液中电泳20min，然后在凝胶成像仪上对提取效
果进行检测，若可见到清晰的条带，并且无明显非特异性扩增，即可判断pcr成功。再将菌株进行16s rdna序列与genbank中己知菌株序列进行比对。
49.实施例1
50.从发酵乳样品中分离菌株并制备发酵乳，步骤如下：
51.(1)在无菌环境下取1g样品(所述的样品为从云南大理采集的若干鲜制乳饼(乳饼配料为山羊奶和发酵乳清酸水)，采样后带回实验室，放置冰箱密封保存，并尽快处理)至无菌试管中，向试管中加入生理盐水9ml，充分振荡溶解均匀得到稀释度为10
‑1的菌液；
52.(2)取步骤(1)所得的稀释度为10
‑1的菌液1ml于另一无菌试管中，向试管中加入生理盐水9ml，充分振荡溶解均匀得到稀释梯度为10
‑2的菌液；
53.重复上述步骤4次，依次得到稀释度为10
‑3菌液、10
‑4菌液、10
‑5菌液和10
‑6菌液；
54.(3)分别从步骤(2)所得的五支试管中取0.2ml菌液涂布于mrs琼脂培养基平板，放置在37℃恒温下培养2至3天；
55.(4)用接种针挑取步骤(3)平板培养后所得的60株分离株单菌落，分别接种于mrs液体培养基，控制温度为37℃恒温发酵12h，分别得到60株分离株的发酵液；
56.(5)将步骤(4)所对应的60株分离株发酵液分别在4℃下，6000rpm离心15min，离心所得的沉淀分别用无菌水清洗2
‑
3次，然后分别在清洗后的沉淀中加入与原始菌悬液等体积的无菌水，于6000rpm下涡旋震荡10min，备用；
57.(6)取约1l山羊乳，50℃搅拌器下搅拌30min；然后升温到60℃，定容至1l，180bar下均质；再在95℃下水浴，样品温度为85℃时，计时10min；然后，用冰块冷却至44℃。
58.(7)取60份步骤(6)所得的无菌山羊乳，分别按体积5％的比例计算接入步骤(5)所得的菌种培养液，同时，加入商业菌粉yf
‑
l811(5mg/l，用于辅助凝乳)，控制温度为37℃进行发酵培养至凝乳发酵结束(ph＝4.6)，然后自然冷却至25℃，得到发酵乳。
59.实施例2
60.从发酵乳样品中筛选菌株，包括如下步骤：
61.(1)菌株的分离和发酵乳的制备：同实施例1的操作步骤；
62.(2)对步骤(1)所得发酵乳样品进行感官评价初筛和gc
‑
ms香气测定，筛选获得具有产香抑膻功能特性的乳酸菌sd
‑
3，对菌株sd
‑
3进行16s rdna序列鉴定，序列如seq id no:3所示，并与genbank中己知菌株序列进行比对，sd
‑
3为乳酸乳球菌乳酸亚种(lactococcus lactis)，保藏编号为cctcc m2021743。
63.实施例3
64.从发酵乳样品中筛选菌株，包括如下步骤：
65.(1)菌株的分离和发酵乳的制备：同实施例1的操作步骤；
66.(2)对步骤(1)所得发酵乳样品进行感官评价初筛和gc
‑
ms香气测定，筛选获得具有产香抑膻功能特性的乳酸菌dn
‑
1，对菌株dn
‑
1进行16s rdna序列鉴定，序列如seq id no:4所示，并与genbank中己知菌株序列进行比对，dn
‑
1为乳酸片球菌(pediococcus lactis)，保藏编号为cctcc m 2021794。
67.实施例4
68.从发酵乳样品中筛选菌株，包括如下步骤：
69.(1)菌株的分离和发酵乳的制备：同实施例1的操作步骤；
70.(2)对步骤(1)所得发酵乳样品进行感官评价初筛和gc
‑
ms香气测定，筛选获得具有产香抑膻功能特性的乳酸菌gm
‑
6。对菌株gm
‑
6进行16s rdna序列鉴定，序列如seq id no:5所示，并与genbank中己知菌株序列进行比对，gm
‑
6为植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)，保藏编号为cctcc m 2021744。
71.对比例
72.将商业菌粉yf
‑
l811接种至无菌山羊乳，于37℃进行发酵培养至凝乳发酵结束(ph＝4.6)，自然冷却至25℃，得到对照发酵乳。对对照发酵乳样品进行感官评价初筛和gc
‑
ms香气测定，分析鉴定2
‑
庚酮、异戊醇等关键香气化合物及丁酸、己酸、辛酸等脂肪酸类化合物含量变化与发酵乳特征奶香味、果香味、坚果味与膻味、酸味、酸腐味的感官评价结果。
73.测定上述实施例2、3、4和对比例中发酵山羊乳的感官指标以及香气成分，gc
‑
ms鉴定结果如表1所示，并对不同菌种发酵山羊乳感官接受度进行评价，结果如表2所示。
74.表1不同菌种的发酵山羊乳的gc
‑
ms测定结果
75.[0076][0077]
表2不同菌种发酵山羊乳感官接受度评价结果
[0078] 色泽质地滋味接受度香气接受度总体接受度sd
‑
35.4
±
0.525.6
±
0.705.4
±
0.527.4
±
0.847.5
±
0.97dn
‑
15.5
±
0.536.0
±
0.824.7
±
0.956.9
±
0.746.7
±
0.67gm
‑
65.6
±
0.704.1
±
0.746.6
±
0.846.8
±
0.927.0
±
0.67对比例5.3
±
0.674.3
±
0.675.0
±
0.945.4
±
0.705.2
±
0.63
[0079]
由表1可以看出，由乳酸乳球菌乳酸亚种(lactococcus lactis)sd
‑
3、乳酸片球菌(pediococcus lactis)dn
‑
1和植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)gm
‑
6发酵的山羊乳，产生3
‑
羟基
‑2‑
丁酮、2
‑
庚酮、2
‑
辛酮以及2
‑
壬酮的含量均较高，以上酮香类物质具有奶油、乳酪、椰子、果香以及甜香等香气特征；同时还含有高含量的杏仁味的苯甲醛和果香味的异戊醇，以上在酸凝奶酪山羊乳饼的特征风味鉴定过程中被作为具有抑膻作用的、积极影响的香气成分。与此同时，通过分析不同菌种发酵样品的香气成分，还可以看出由sd
‑
3、dn
‑
1和gm
‑
6发酵得到的样品所产生的具有膻味的脂肪酸，与对比例中商业菌粉yf
‑
l811制备的发酵乳样品相比其含量也较低。即从香气物质的的生成情况来看，三株乳酸菌应用于发酵山羊乳时，具有较为明显的产香抑膻特性。
[0080]
由表2可以看出，由乳酸乳球菌乳酸亚种(lactococcus lactis)sd
‑
3、乳酸片球菌
(pediococcus lactis)dn
‑
1和植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)gm
‑
6发酵的山羊乳，在色泽、质地、滋味接受度、香气接受度和总体接受度等感官接受度评价指标方面均高于商业菌粉yf
‑
l811制备的发酵乳样品。
[0081]
根据确定的描述性感官分析指标，实施例2、3、4和对比例的感官评价雷达图如图1所示，从图1中可以看出所述的由sd
‑
3、dn
‑
1和gm
‑
6发酵所得的酸奶的奶香味、果香味和坚果味较高。根据酸凝奶酪山羊乳饼的香气品质评价得知，奶香味、果香味及坚果味是受消费者接受和喜爱的三类香气属性。另外，三种菌株发酵所得发酵乳的膻味、酸味和酸腐味强度也较商业菌粉发酵所得发酵乳的强度低。由此表明了所述乳酸菌的产香抑膻性能良好。
[0082]
综上所述，本发明的一种具有产香抑膻功能特性的菌种的筛选方法，筛选得到的菌株可以保证发酵样品能内源产生更多的对膻味有抑制作用的呈奶香味、果香味物质，并一定程度上减少了膻味脂肪酸成分的产生，在不需要外源添加香气物质的基础之上，优化了发酵乳品的风味品质，降低了发酵乳品制作的生产成本。
[0083]
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。