检测HLA-A基因SNP标记rs1136697-G的PCR扩增引物、试剂盒及方法与流程

检测hla
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a基因snp标记rs1136697
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g的pcr扩增引物、试剂盒及方法
技术领域
1.本发明属于鼻咽癌易感标记检测领域，尤其涉及一种用于检测hla
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a基因snp标记rs1136697
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g的pcr扩增引物、试剂盒及检测hla
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a基因snp标记rs1136697
‑
g的方法。


背景技术：

2.hla
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a基因snp标记rs1136697
‑
g近期已被证实为中国南方人群鼻咽癌的一个重要的遗传易感标记(or(95％ci)＝1.79(1.54
–
2.09),p<0.0001)。现有人类白细胞抗原(hla)基因分型技术均基于聚合酶链式反应(pcr)，其中pcr
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ssp(sequence specific priming,序列特异性引物技术)因具有快速、实验操作简洁的特点，被广泛应用。该技术利用了pcr扩增很大程度上依赖引物3’末端与待测序列的互补性这一原理，但现有的pcr
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ssp技术至少需要设计2对pcr引物，除特异性引物外，另有一对为内参照引物，由于内参照引物与特异性引物在同一pcr体系内扩增，彼此间存在相互竞争与干扰，需反复优化实验参数和各组分浓度，可出现结果难以判定乃至假阳性、假阴性结果。
3.因此，开发一套既能检测hla靶基因snp标记、又可同时作为内参照的pcr引物具有十分重要的意义。


技术实现要素：

4.本发明所要解决的技术问题是，克服以上背景技术中提到的不足和缺陷，以鼻咽癌易感标记之一——hla
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a基因snp rs1136697
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g为研究对象，研发一种既能检测靶标记、又可同时作为内参照的pcr扩增引物、试剂盒及检测hla
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a基因snp标记rs1136697
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g的方法。
5.为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为：
6.一种检测hla
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a基因snp标记rs1136697
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g的pcr扩增引物，包括上游引物rs113
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sf2和下游rs113
‑
rev1，其碱基序列如下：
7.rs113
‑
sf2：5
’‑
cacaccgtccagaggatgag
‑3’
(由seq id no:1所示)；
8.rs113
‑
rev1：5
’‑
tgcgctgcagcgtctcctt
‑3’
(由seq id no:2所示)。
9.该pcr扩增引物是在hla
‑
a基因第3外显子设计的一套pcr引物，通过在上游引物3’末端第2位碱基人为引入错配特异性扩增rs1136697
‑
g，pcr产物长度为268bp；该引物对并识别人类血管生成素(ang)基因保守区域，pcr产物扩增长度为360bp，可作为pcr反应的内参照。该pcr扩增引物既可检测hla基因snp标记，同时又可作为内参照，扩增过程快速、结果准确。
10.基于一个总的发明构思，本发明还提供一种试剂盒，包含seq id no:1
‑
2所述的pcr扩增引物。
11.上述的hla
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a基因的试剂盒，进一步的，包含：1.3pmole上游引物rs113
‑
sf2、1.3pmole下游引物rs113
‑
rev1、5μl 2
×
taq mastmix和ddh2o。
12.基于一个总的发明构思，本发明还提供一种检测hla
‑
a基因snp标记rs1136697
‑
g的方法，包括如下步骤：
13.(1)提取样本dna；
14.(2)利用所述的pcr扩增引物，对所述步骤(1)得到的样本dna进行pcr扩增；
15.(3)将所述步骤(2)得到的pcr扩增产物进行琼脂糖电泳，读取电泳结果；若同时出现268bp和360bp的条带，则鉴定为rs1136697
‑
g阳性样本；若仅出现360bp的条带，则鉴定为rs1136697
‑
g阴性样本。
16.上述的方法，进一步的，所述pcr扩增的反应体系含：2
×
taq mastmix 5μl、上游引物rs113
‑
sf2 1.3pmole、下游引物rs113
‑
rev1 1.3pmole、基因组dna 50ng，用灭菌ddh2o补足反应体系至10μl。
17.进一步的，所述pcr扩增的反应参数条件为：预变性95℃，2min；95℃变性30s，63℃退火50s，72℃延伸30s，循环35次，再72℃延伸5min。
18.进一步的，所述琼脂糖电泳的参数条件为：采用2％琼脂糖电泳，200v，电泳15min。
19.与现有技术相比，本发明的有益效果为：
20.1、本发明的pcr扩增引物，既可检测特异性靶序列(hla
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a基因snprs1136697
‑
g)，同时又可作为内参照，只用一对pcr引物就能实现对pcr
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ssp的检测，扩增过程快速、结果准确，避免出现假阳性、假阴性结果，可用于hla基因snprs1136697
‑
g分型、鼻咽癌易感标记检测和高危人群筛查与预警等领域。
21.2、本发明的检测方法，以人类外周血基因组dna为模板，经pcr扩增后行2％琼脂糖电泳，根据pcr产物带型即可判定结果；采用单盲法对经sanger测序的hla
‑
a基因型数据进行检测，证实该方法快速、准确。
附图说明
22.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
23.图1为本发明的pcr扩增引物与hla
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a基因snp标记rs1136697序列比对；
24.图2为本发明的pcr扩增引物核心序列与人类血管生成素(homo sapiens angiogenin，ang)基因序列比对；
25.图3是实施例的pcr扩增产物的琼脂糖电泳结果；
26.图4是实施例的sanger测序结果。
具体实施方式
27.为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本发明做更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。
28.除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。
29.除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
30.实施例：
31.一种用于检测hla
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a基因snp标记rs1136697
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g的pcr扩增引物，pcr扩增引物信息如下表1所示：
32.表1：本发明的pcr扩增引物信息
33.引物名称序列(5
’‑3’
)rs113
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sf25
’‑
cacaccgtccagaggatgag
‑3’
(由seqidno:1所示)rs113
‑
rev15
’‑
tgcgctgcagcgtctcctt
‑3’
(由seqidno:2所示)
34.该pcr扩增引物是在hla
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a基因第3外显子设计的一套pcr引物，通过在上游引物3’末端第2位碱基人为引入错配特异性扩增rs1136697
‑
g，pcr产物长度为268bp；该引物对并识别人类血管生成素(ang)基因保守区域，pcr产物扩增长度为360bp，可作为pcr反应的内参照。该pcr扩增引物与hla
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a基因snp标记rs1136697序列比对情况如图1所示。pcr扩增引物核心序列与人类血管生成素(homo sapiens angiogenin，ang)基因序列比对情况如图2所示。
35.上述pcr扩增引物还可以制成试剂盒，包含：1.3pmole上游引物rs113
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sf2、1.3pmole下游引物rs113
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rev1、5μl 2
×
taq mastmix和灭菌ddh2o。
36.采用上述pcr扩增引物检测hla
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a基因snp标记rs1136697
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g的方法，包括如下步骤：
37.(1)人外周血基因组dna提取：
38.取5％edta
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na2抗凝外周血0.5ml，加1ml红细胞裂解液，混匀，13000rpm离心1min，去上清，用1ml ddh2o洗涤细胞沉淀，去上清后加80μl蛋白酶k缓冲液，40μl 10％sds，30μl蛋白酶k，220μl ddh2o混匀，56℃孵育10min。加入1/4体积饱和醋酸钠，剧烈震荡15秒，13000rpm离心6min，将上清转移至另一灭菌eppendorf管内，加入等体积异丙醇，轻轻混匀至dna呈絮状析出，13000rpm离心1min，收集dna。用预冷的70％乙醇溶液洗涤dna，共3次。去上清，于室温放置3～5分钟后加te液200μl，
‑
20℃保存备用。
39.(2)pcr扩增：
40.pcr反应体系含：2
×
taq mastmix 5μl、rs113
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sf2和rs113
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rev1引物各1.3pmole、基因组dna 50ng，用灭菌ddh2o补足反应体系至10μl；
41.pcr扩增参数为：预变性95℃，2min；95℃变性30s，63℃退火50s，72℃延伸30s，循环35次，再72℃延伸5min；
42.(3)pcr产物的2％琼脂糖电泳：200v，电泳15min；
43.(4)结果记录与分析：读取电泳结果，若同时出现268bp和360bp的条带，则鉴定为rs1136697
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g阳性样本；若仅出现360bp的条带，则鉴定为rs1136697
‑
g阴性样本。
44.上述2％琼脂糖电泳结果如图3所示，dna标本5
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6为rs1136697
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g阳性样本，各泳道有明亮的268bp特异性产物，并有360bp条带；(2)dna标本1
‑
4、7、9
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12为rs1136697
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g阴性样本，各泳道仅有360bp产物条带；第8孔为空白对照(ddh2o作为模板)，m为100bp dnaladder，最小片段为100bp。
45.上述rs1136697
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g阳性、阴性dna样本均已经sanger测序做hla
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a基因型测定。对上
述360bp条带采用sanger方法测序(如图4所示)，证实均为人类血管生成素(ang)序列。说明本发明的pcr扩增引物既可检测特异性靶序列(hla
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a基因snprs1136697
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g)，同时又可作为内参照，根据pcr产物的电泳结果带型即可判定hla
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a基因snp rs1136697
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g的检测结果。采用单盲法对经sanger测序的hla
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a基因型数据进行检测，证实该方法快速、准确。