用于直接检测蚕丝丝胶蛋白的多肽抗体及制备方法及应用与流程

用于直接检测蚕丝丝胶蛋白的多肽抗体及制备方法及应用
1.本技术是分案申请，原申请的申请日为2020
‑
06
‑
19，申请号为2020105639178，发明创造名称为用于直接检测蚕丝丝胶蛋白的多肽抗体及制备方法及应用。
技术领域
2.本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种用于直接检测蚕丝丝胶蛋白的多肽抗体及制备方法及应用。


背景技术：

3.蚕丝是一种天然高分子蛋白质纤维，主要分为家蚕丝和柞蚕丝两大类。我国是最早利用柞蚕和放养柞蚕的国家，蚕丝是熟蚕结茧时分泌丝液凝固而成的连续长纤维，是一种天然纤维，也是人类利用最早的动物纤维之一。目前，从蚕丝中提取出的丝素和丝胶蛋白等物质被广泛应用于医药、化工、食品等领域。
4.蚕丝主要由两部分构成，包括丝胶和丝素，丝胶包裹和渗入两根丝素就构成了一根蚕丝。丝胶和丝素虽均属蛋白，但两者的结构与氨基酸成份存有差异。丝素蛋白是蚕丝中主要的组成部分，约占质量的70％—73％，丝胶约占23％—25％。丝胶蛋白主要由丝胶蛋白1、丝胶蛋白2和丝胶蛋白3三个基因通过mrna的选择性拼接产生的至少8种分子量不同的蛋白质组成。其中，丝胶2主要存在于蚕最初吐出的网架上，在后期吐出的丝中，丝胶2的含量很少；丝胶3主要位于蚕丝丝胶的最外层，有很好的亲水性；丝胶1是蚕丝丝胶的主要成分，位于丝胶的内层，紧贴丝素。丝胶蛋白的总体分子构象主要为无规卷曲状，分子空间结构松散、含有无序β结构，但无α螺旋结构。丝胶蛋白链上有许多侧链较长的氨基酸，如精氨酸赖氨酸、谷氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、酪氨酸等，以及许多极性亲水基团(如
‑
oh、
‑
cooh、
‑
nh2、>nh等)处于多肽链表面，这些结构特征赋予丝胶蛋白优异的调湿、保湿作用，也很好的保护了内部的丝素成分。
5.蚕丝加工生产过程中，需要对生丝进行残留丝胶蛋白脱去处理，以得到可用于丝绸生产的熟丝。在生丝去除残留丝胶的过程中，常常需要使用相关化学试剂进行处理以精炼。但存在着不同批次的生丝因残留的丝胶蛋白含量存在差异，需要配制的精炼试剂成分也不一样，精炼过渡和精炼不足会分别造成内部丝素受损和大量丝胶残留，影响熟丝品质的技术问题。且实际生产中，需要提高生产速率，常常会对不同批次或者不同来源的生丝使用同一种精炼试剂进行处理，这样粗犷的处理方式常常导致精炼后的熟丝品质不均一，影响后期丝绸产品的质量。反过来，又会为了追求品质而浪费蚕丝，使厂家获得的利润变少。
6.丝织品流通过程中，也需要质检，以检测织物是否为真丝织品及达到质量要求。不同品种蚕丝或不同丝织品丝胶含量不尽相同，不同加工程度的蚕丝以及不同品种蚕丝其丝胶含量也存在差异，在市面上售卖的蚕丝也有真有假，蚕丝丝织品的质量也良莠不齐，有好有坏对蚕丝材料进行甄别鉴定，是需要也是个难题。
7.目前对丝胶蛋白的定性和定量检测通过一些蛋白质的检测手段来进行，例如bca法定量检测、凯氏定氮法检测等，但难以胜任特异性检测以及超灵敏检测的需求。如凯氏定
氮法检测丝胶废水回收实验中的丝胶蛋白浓度，结果很容易受到废水中其他含氮有机物的影响。也有采用蒸发水分法来计算丝胶蛋白的浓度，这种方法虽然操作简单，但对于低浓度的丝胶蛋白溶液检测能力有限且检测结果容易受到水中其它杂质的影响。
8.利用丝胶蛋白抗体进行wb或者elisa检测可定性检测丝胶蛋白。elisa(酶联免疫吸附测定)具有检测灵敏度高、特异性强的特点，被广泛应用于各种生化实验之中。要完成elisa实验，需要合适的elisa抗体。目前elisa抗体种类丰富，却难以满足所有蛋白质的检测。且丝胶蛋白成分复杂，难以分离；分子量大(>100kd),无法用原核表达的方式获得。因此，市面上一直没有可用于直接检测丝胶蛋白的抗体。


技术实现要素：

9.为了解决以上技术问题，本发明提供一种用于直接检测蚕丝丝胶蛋白的多肽抗体及制备主及应用，首次纯化得到了丝胶蛋白的多肽抗体，用于快速、直接和准确灵敏的检测丝胶蛋白，为快速准确灵敏的检测丝胶蛋白提供了实现的通道。
10.解决以上技术问题的本发明中的一种用于直接检测蚕丝丝胶蛋白的多肽抗体，其特征在于：
11.所述丝胶蛋白多肽抗原包括多肽一、多肽二、多肽三、多肽四、多肽五、多肽六和多肽七中一种或两种以上，其中多肽一的氨基酸序列为seq id no.1所示，多肽二的氨基酸序列为seq id no.2所示，多肽三的氨基酸序列为seq idno.3所示，多肽四的氨基酸序列为seq id no.4所示，多肽五的氨基酸序列为seq id no.5所示，多肽六的氨基酸序列为seq id no.6所示，多肽七的氨基酸序列为seq id no.7所示。
12.本发明中多肽抗体可以对任何一种需要检测的对像进行检测，先以确定检测对像中是否有丝胶存在。也可以对丝胶类别检测，即用7个多肽抗体中一个或几个来进行测试，以区分丝胶是哪种蛋白。
13.优化方案中，所述丝胶蛋白多肽抗体包括多肽一和多肽二，或多肽三、多肽四和多肽五，或多肽六和多肽七。
14.对丝胶类别检测中，多肽一和多肽二可测丝胶蛋白1，多肽三、多肽四和多肽五可测丝胶蛋白2，多肽六和多肽七可测丝胶蛋白3。
15.进一步优化方案中，所述丝胶蛋白多肽抗体包括多肽一、多肽二、多肽三、多肽四、多肽五、多肽六和多肽七。七个多肽放在一起检测对像，任意一个信号出现就表明其中含丝胶，检测对像范围广泛和结果准确高。
16.上述氨基酸序列中的字母为相应氨基酸的单字母符号，右端为c端测序，左端为n端测序。
17.所述抗原位点(a)至(g)(包括所示的两个末端的氨基酸残基)以包括氨基酸残基1201
‑
1217之间的区域的氨基酸残基，也包括氨基酸残基1201
‑
1217之间的区域的氨基酸残基，也包括741
‑
757，902
‑
916，214
‑
230，1710
‑
1727，205
‑
223和35
‑
51之间的区域的氨基酸残基。
18.ser
‑
1b:
19.741
‑
757:c
‑
gsssntdsstknagsrt
‑
nh2多肽一
20.21
‑
37:c
‑
ghhpgnrdtvevknrky
‑
nh2
21.1201
‑
1217:c
‑
fknifdipyhlrknigv多肽二
22.>ser
‑2‑
2:
23.902
‑
916:c
‑
tekakpndrspsdrd
‑
nh2多肽三
24.214
‑
230:c
‑
saertkskrgerkeveg
‑
nh2多肽四
25.1710
‑
1727:c
‑
nrvvekstdgdneesyrs
‑
nh2多肽五
26.>ser
‑3‑
2:
27.482
‑
499:c
‑
dedsddssgatkgnssks
‑
nh2
28.205
‑
223:c
‑
eessnggsgsgrtgsaggt
‑
nh2多肽六
29.35
‑
51:c
‑
gggrgrgsgvrrldsg
‑
nh2多肽七
30.虽然知道蛋白序列就可以设计多肽位点制备抗体，但不是所有的多肽位点都可以获得抗体，抗原多肽位点的选择很重要。
31.本发明中一种用于直接检测蚕丝丝胶蛋白的多肽抗体的制备方法，其特征在于：所述样品茧层经过合成多肽、多肽与klh偶联作为免疫抗原、pbs将免疫抗原分别稀释、抗原加入福氏不完全佐剂并乳化注射、小动物血液离心和抗体纯化步骤。
32.所述pbs贮存液(10
×
)配法：
[0033][0034][0035]
其中2.85g的na2hpo4
·
12h2o还可以为1.13g的na2hpo4
·
2h2o，将上述原料溶于100ml去离子水中，调节ph值至7.2。
[0036]
所述抗体纯化步骤后还有免疫分析步骤，其中加入二抗中时进行再次酶标记。
[0037]
第一次酶标识，对于样本量大时适用；如果需要更精确、样本量少，灵敏检测时再次进行酶标记，在加入二抗过程中。
[0038]
所述酶标记中酶为辣根过氧化物酶。
[0039]
本发明中一种蚕丝丝胶蛋白多肽抗体的应用，为蚕丝丝胶蛋白多肽抗体在制备检测丝胶的试剂盒中的应用。
[0040]
本发明的制备方法中，首先通过人工合成丝胶蛋白的多肽，然后将合成多肽作为完全抗原注射至活体动物上，进行动物免疫，纯化后得到丝胶蛋白1、丝胶蛋白2和丝胶蛋白3的多肽片段的多克隆抗体，同时，对抗体进行了hrp(辣根过氧化物酶)标记，使本发明的丝胶蛋白多肽抗体能对茧丝中的丝胶蛋白含量进行定量测定。
[0041]
本发明首次纯化得到了丝胶蛋白的多肽抗体，可对各样蚕丝材料进行甄别鉴定，检测快速、直接、准确和灵敏，为实际生产及质检中的丝胶蛋白的定性和定量检测提供了实现的通道，填补工业应用研究上的空白以及确保购买到高品质蚕丝。
附图说明
[0042]
下面结合附图及具体实施方式对本发明做更进一步详细说明：
[0043]
图1为本发明中二十种氨基酸的字母缩写表；
[0044]
图2为本发明中多肽抗体的免疫荧光检测结果图；
[0045]
图3为本发明中多肽抗体的检测点杂交结果图
[0046]
图4为本发明中不同丝胶抗体对家蚕msg不同区域内容物的western blot检测图
[0047]
(其中，a：872品系丝腺；b：msg内容物的sds
‑
page；c
‑
e：不同丝胶抗体的western blot鉴定)
[0048]
图5为本发明中茧丝加工过程中丝胶的去除图
具体实施方式
[0049]
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步说明：
[0050]
实施例1
[0051]
蚕丝丝胶蛋白多肽抗体，包括多肽一、多肽二、多肽三、多肽四、多肽五、多肽六和多肽七。七个多肽放在一起检测对像，任意一个信号出现就表明其中含丝胶，检测对像范围广泛和结果准确高。
[0052]
样品中含丝胶总含量在1ug/mg以上的样品即可进行检测。
[0053]
多肽一的氨基酸序列为：c
‑
gsssntdsstknagsrt
‑
nh2，多肽二的氨基酸序列为：c
‑
fknifdipyhlrknigv
‑
nh2，多肽三的氨基酸序列为：c
‑
tekakpndrspsdrd
‑
nh2，多肽四的氨基酸序列为：c
‑
saertkskrgerkeveg
‑
nh2，多肽五的氨基酸序列为：c
‑
nrvvekstdgdneesyrs
‑
nh2，多肽六的氨基酸序列为：c
‑
eessnggsgsgrtgsaggt
‑
nh2，多肽七的氨基酸序列为：c
‑
gggrgrgsgvrrldsg
‑
nh2。上述氨基酸序列中的字母为相应氨基酸的单字母符号，详情见附图1。
[0054]
上述氨基酸序列中的字母为相应氨基酸的单字母符号，右端为c端测序，左端为n端测序。
[0055]
实施例2
[0056]
丝胶蛋白多肽抗体包括多肽一和多肽二，测丝胶蛋白1。样品中丝胶1含量在1ug/mg以上的样品即可进行检测。多肽一的氨基酸序列为：c
‑
gsssntdsstknagsrt
‑
nh2，多肽二的氨基酸序列为：c
‑
fknifdipyhlrknigv
‑
nh2。
[0057]
实施例3
[0058]
丝胶蛋白多肽抗体包括多肽三、多肽四和多肽五，测丝胶蛋白2。样品中丝胶2含量在1ug/mg以上的样品即可进行检测。
[0059]
多肽三的氨基酸序列为：c
‑
tekakpndrspsdrd
‑
nh2，多肽四的氨基酸序列为：c
‑
saertkskrgerkeveg
‑
nh2，多肽五的氨基酸序列为：c
‑
nrvvekstdgdneesyrs
‑
nh2。
[0060]
实施例4
[0061]
丝胶蛋白多肽抗体包括多肽六和多肽七，测丝胶蛋白3。样品中含丝胶3含量在1ug/mg以上的样品即可进行检测。
[0062]
多肽六的氨基酸序列为：c
‑
eessnggsgsgrtgsaggt
‑
nh2，多肽七的氨基酸序列为：c
‑
gggrgrgsgvrrldsg
‑
nh2。
[0063]
实施例5
[0064]
蚕丝丝胶蛋白多肽抗体的应用，为蚕丝丝胶蛋白多肽抗体在制备检测丝胶的试剂盒中的应用。
[0065]
实施例6
[0066]
抗原位点(a)至(g)(包括所示的两个末端的氨基酸残基)以包括氨基酸残基1201
‑
1217之间的区域的氨基酸残基。也包括氨基酸残基1201
‑
1217之间的区域的氨基酸残基，也包括741
‑
757，902
‑
916，214
‑
230，1710
‑
1727，205
‑
223和35
‑
51之间的区域的氨基酸残基。
[0067]
ser
‑
1b:
[0068]
741
‑
757:c
‑
gsssntdsstknagsrt
‑
nh2多肽一
[0069]
21
‑
37:c
‑
ghhpgnrdtvevknrky
‑
nh2
[0070]
1201
‑
1217:c
‑
fknifdipyhlrknigv多肽二
[0071]
>ser
‑2‑
2:
[0072]
902
‑
916:c
‑
tekakpndrspsdrd
‑
nh2多肽三
[0073]
214
‑
230:c
‑
saertkskrgerkeveg
‑
nh2多肽四
[0074]
1710
‑
1727:c
‑
nrvvekstdgdneesyrs
‑
nh2多肽五
[0075]
>ser
‑3‑
2:
[0076]
482
‑
499:c
‑
dedsddssgatkgnssks
‑
nh2
[0077]
205
‑
223:c
‑
eessnggsgsgrtgsaggt
‑
nh2多肽六
[0078]
35
‑
51:c
‑
gggrgrgsgvrrldsg
‑
nh2多肽七
[0079]
实施例7
[0080]
本发明的丝胶蛋白多肽抗体的具体制备步骤如下：
[0081]
免疫流程：
[0082]
(1)合成多肽：根据抗原设计原则，设计出适合用于制备抗体的多肽序列，通过进一步分析，挑选最有可能获得抗体的多肽序列进行人工多肽合成。
[0083]
(2)将多肽与klh偶联作为免疫抗原，多肽与bsa偶联作为检测抗原，其中klh偶联剂为sulfo
‑
smcc，bsa偶联剂为戊二醛；
[0084]
(3)用pbs将免疫抗原分别稀释为1mg/ml，分装冻存于
‑
20℃冰箱，备用；
[0085]
其中，pbs的制备方法为：
[0086]
①
pbs贮存液(10
×
)配法：
[0087][0088]
其中2.85g的na2hpo4
·
12h2o还可以为1.13g的na2hpo4
·
2h2o，将上述原料溶于100ml去离子水中，调节ph值至7.2；
[0089]
②
pbs使用液配法(1
×
)：取贮存液50ml加去离子水450ml即可，置室温或4℃保存备用；
[0090]
(4)第1天，每种抗原取1ml加入1ml福氏完全佐剂，乳化，直至将一滴乳化抗原液滴入生理盐水中不散开，表明乳化已达到要求，接着在颈背部皮下多点注射，注射点数≧8点，每种抗原免疫2只新西兰白兔；
[0091]
(5)第15天，每种抗原取1ml加入1ml福氏不完全佐剂，乳化，接着在颈背部皮下多
点注射，注射点数≧8点，每种抗原免疫2只新西兰白兔；
[0092]
(6)第29天，每种抗原取1ml加入1ml福氏不完全佐剂，乳化，接着在颈背部皮下多点注射，注射点数≧8点，每种抗原免疫2只新西兰白兔；
[0093]
(7)第43天，每种抗原取1ml加入1ml福氏不完全佐剂，乳化，接着在颈背部皮下多点注射，注射点数≧8点，每种抗原免疫2只新西兰白兔；
[0094]
(8)第53天，颈动脉取血，将兔子处死；
[0095]
(9)兔血在4℃放置过夜，4℃温度下以10000rpm的速度进行离心30分钟，收集上清液；
[0096]
抗体纯化
[0097]
(1)将多肽连接到活化的sulfolink resin上，制备抗原亲和柱，1ml sulfolink resin偶联1mg多肽；
[0098]
(2)亲和柱用10倍柱体积pbs平衡，流尽溶液；兔血清经0.45um滤膜过滤；
[0099]
(3)再将兔血清过抗原亲和柱，流尽溶液，收集流穿；
[0100]
(4)再用10倍柱体积pbs平衡，流尽溶液；
[0101]
(5)加入5ml抗体洗脱液，分管收集洗脱液，每管1ml，抗体洗脱液制备方法为：称取7.5g甘氨酸，溶于100ml去离子水，用浓盐酸调节ph值到2.7，4℃保存备用；
[0102]
(6)用收集的洗脱液检测280nm处的吸光度，吸光度大于1.0的组分合并，对pbs透析；
[0103]
(7)透析后的抗体鉴定：使用紫外吸收法检测蛋白浓度，elisa确定抗体效价，最终得到丝胶蛋白1、丝胶蛋白2和丝胶蛋白3的6个多肽片段的多克隆抗体。
[0104]
实施例7
[0105]
elisa法抗体免疫分析：
[0106]
(1)包被：用抗原包被液包被抗原，且将包被抗原用cbs稀释为1ug/ml，加入酶标板中，每孔100ul，4℃过夜；其中抗原包被液(cbs，1
×
)的制备方法为：称取na2co3 1.59g，nahco3 2.93g，去离子水950ml，调节ph值至9.6，加去离子水定容至1000ml，4℃保存；
[0107]
(2)封闭：将包被液弃去，每孔加入200ul封闭液，37℃放置1.5小时，其中封闭液制备方法为：称取5g脱脂奶粉，溶解于100mlpbs中，混匀，4℃保存备用，且存储时间≤3天；
[0108]
(3)加入样本：弃去封闭液，加入血清或者抗体样品，每孔100ul加入酶标板，37℃放置1小时；
[0109]
(4)洗涤：用自来水冲洗10次，拍干；
[0110]
(5)加入二抗：酶标羊抗兔用封闭液稀释至工作浓度，每孔100ul加入酶标板，37℃放置30分钟；
[0111]
(6)洗涤：用自来水冲洗10次，拍干；
[0112]
(7)加入tmb显色底物：每孔100ul加入酶标板，37℃放置15分钟；其中tmb显色底物制备方法为：
[0113]
①
tmb贮存液：称取tmb粉末，用dmso配成1.5mg/ml的贮存液，
‑
20℃分装保存；
[0114]
②
naac缓冲液：配制200mm的naac溶液，用hac调节ph值至5.3；
[0115]
③
h2o2溶液：配制0.03％的h2o2溶液；
[0116]
④
使用时按照tmb贮存液：naac缓冲液：h2o2溶液＝1:4:5的比例配制显色液，现配
现用；
[0117]
(8)加入终止液：每孔加入2m h2so4 50ul，终止液制备方法为：将100ml浓硫酸缓慢加入900ml水中，室温保存备用；
[0118]
(9)读数：使用酶标仪od450nm读数，获取od值，即可得到抗体数量。
[0119]
实施例8
[0120]
其它内容相同，加入二抗：酶标羊抗兔用封闭液稀释至工作浓度，每孔100ul加入酶标板，37℃放置30分钟；在酶标板中进行酶标记，其中酶为辣根过氧化物酶。
[0121]
实施例7或8实验结果如下：
[0122]
(1)编号374
‑
1(多肽一：c
‑
gsssntdsstknagsrt
‑
nh2)
[0123]
最终得到374
‑1‑
r1抗体2.3ml，0.57mg/ml；374
‑1‑
r2抗体1.8ml，1.02mg/ml，详细检测结果见下表：
[0124][0125][0126]
(2)编号374
‑
2(多肽二：c
‑
fknifdipyhlrknigv
‑
nh2)
[0127]
最终得到374
‑2‑
r1抗体1.7ml，1.85mg/ml；374
‑2‑
r2抗体3.1ml，1.11mg/ml，详细检测结果见下表：
[0128][0129]
(3)编号374
‑
3(多肽三：c
‑
tekakpndrspsdrd
‑
nh2)
[0130]
最终得到374
‑3‑
r1抗体2.5ml，0.89mg/ml；374
‑3‑
r2抗体1.1ml，0.73mg/ml，详细检测结果见下表：
[0131][0132]
(4)编号374
‑
4(多肽四：c
‑
saertkskrgerkeveg
‑
nh2)
[0133]
最终得到374
‑4‑
r1抗体3.3ml，1.3mg/ml；374
‑4‑
r2抗体3.3ml，0.87mg/ml，详细检测结果见下表：
[0134][0135][0136]
(5)编号374
‑
5(多肽五：c
‑
nrvvekstdgdneesyrs
‑
nh2)
[0137]
最终得到374
‑5‑
r1抗体1.7ml，2.5mg/ml；374
‑5‑
r2抗体2.3ml，1.76mg/ml，详细检测结果见下表：
[0138][0139]
(6)编号374
‑
6(多肽六：c
‑
eessnggsgsgrtgsaggt
‑
nh2)
[0140]
最终得到374
‑6‑
r1抗体1.7ml，1.7mg/ml；374
‑6‑
r2抗体3.1ml，0.54mg/ml，详细检测结果见下表：
[0141][0142]
(7)编号374
‑
7(多肽七：c
‑
gggrgrgsgvrrldsg
‑
nh2)
[0143]
最终得到374
‑7‑
r1抗体1.7ml，2.06mg/ml；374
‑7‑
r2抗体2.9ml，1.02mg/ml，详细检测结果见下表：
[0144][0145]
以上效价测定表明，所制备的抗体效价均达到1:80000，完全可用于后续的免疫检测。上述多肽抗体的免疫荧光检测结果见附图2，上述多肽抗体的检测点杂交结果见附图3。结果表明，制备的抗体除编号为374
‑
4的抗体无法用于免疫组化实验以外，其余抗体都可用于丝胶蛋白的原位检测及免疫检测。
[0146]
对制备丝胶1、丝胶2和丝胶3的抗体中各挑选一个进行组织样品内容物的免疫检测，结果表明可以特异的检测到丝腺各个部位的丝胶蛋白，结果见附图4。
[0147]
对不同加工过程的茧及丝制品进行检测，发现利用该抗体组可以检测到茧丝加工过程中丝胶的去除情况。在缫丝的茧中，不含有丝胶2蛋白，这与已经报道的丝胶2蛋白只存在于茧网中的结果一致，因缫丝的茧都已去除茧网及茧丝。缫丝过程中，最先去除是丝胶3蛋白，专门的精炼过程才能有效的去除丝胶1蛋白，丝绸基本不含丝胶，结果见附图5。
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以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征以及本发明的优点，上述实施例和说明书所描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都将落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护的范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
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