一种装载细胞的方法与流程

1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种装载细胞的方法，该方法可以方便快捷装载细胞，细胞活率可达90％以上。


背景技术：

2.细胞装载技术可以使细胞能够在载体的三维立体空间结构中迁移、生长，构成三维的细胞/载体复合物，在癌症研究、干细胞研究、药物研发、再生医学等前沿热点领域应用潜力巨大。
3.现有装载细胞的方法可分为如下两种：一种是将细胞分散在生物材料中，然后通过材料交联实现细胞装载；另外一种是将细胞“播种”在生物材料上，通过细胞与材料结合实现细胞装载。
4.cn109810267a“一种可实现细胞三维装载的丝素蛋白/透明质酸双网络水凝胶的制备方法”属于第一种方法，其中，通过向丝素蛋白溶液和改性透明质酸溶液形成的预聚物溶液中加入光引发剂，然后经超声处理与细胞混合，在紫外光下进行光交联成胶实现细胞在高强、高韧的双网络水凝胶中的装载。然而该方法过程复杂，光引发剂有细胞毒性，紫外光照射也会损伤细胞。
5.cn102286422b“一种用于体外细胞共培养的复合微囊模型”，其中，通过将材料与细胞混合，然后滴入多价阳离子溶液中交联成胶实现装载细胞。该方法虽然操作简便，但交联过程反应强烈，多价阳离子浓度过高，对细胞活性影响较大。
6.snippert h j使用matrigel与细胞混合，matrigel在10℃以上即可成胶装载细胞。但操作过程中需要保持matrigel一直置于冰上，所有接触matrigel的细胞培养器皿、移液吸头、分装管等都必须经过预冷处理。该方法操作比较复杂，耗时较长，而且形成的水凝胶结构力学强度很低，基本呈无定形状态。snippert h j.single lgr5 stem cells build crypt
‑
villus structures in vitro without a mesenchymal niche.nature,2009,459,262
‑
265.
7.cn109593704a“一种三维微载体细胞吸附培养的方法”属于第二种方法，其中，将细胞悬液与干燥的三维微载体混合，然后采用旋转动态吸附方法孵育，使细胞粘附于所述三维微载体上实现装载细胞。该方法操作比较复杂，耗时较长，材料并非三维包裹细胞，只能形成仿生的三维立体生长模式。
8.针对以上装载细胞方法中的问题，本发明采用低温下材料与细胞直接混合，高温下快速成胶的方式装载细胞，操作过程方便快捷，15分钟以内即可完成；过程中无有害物质(如交联剂)添加，温度变化不影响细胞正常生长，细胞活率可达90％以上；装载的细胞在材料三维包裹中，而且具有一定的力学强度，可模拟细胞体内三维生长微环境。


技术实现要素：

9.本发明提供一种装载细胞的方法。
10.一种装载细胞的方法，其中，依次包括如下步骤：
11.(1)在低温条件下，将生物大分子材料与细胞直接混合，反复吹打细胞，直至细胞与材料混合均匀；
12.(2)将材料/细胞混合物置于高温条件下，形成水凝胶结构封装细胞。
13.本发明一种装载细胞的方法，其中，所述步骤(1)中低温条件范围为
‑5–
15℃。
14.本发明一种装载细胞的方法，其中，所述步骤(1)中低温条件范围为0
–
4℃。
15.本发明一种装载细胞的方法，其中，所述步骤(1)中吹打细胞的次数范围为10
–
100次。
16.本发明一种装载细胞的方法，其中，所述步骤(1)中吹打细胞的操作可以用搅拌材料/细胞混合物的方式代替，搅拌速度范围为5
–
200rpm。
17.本发明一种装载细胞的方法，其中，所述步骤(1)所需时间范围为0.5
–
5分钟。
18.本发明一种装载细胞的方法，其中，所述步骤(1)中吹打细胞的次数及所需时间与操作的低温条件有关，为了避免温度过低影响材料流动性及细胞活性，应尽量减少在低温条件下的吹打次数和所需时间，例如，
‑5–
0℃条件下，吹打细胞的次数范围为10
–
20次，所需时间范围为0.5
–
1分钟。
19.本发明一种装载细胞的方法，其中，所述步骤(2)中高温条件范围为25
–
45℃。
20.本发明一种装载细胞的方法，其中，所述步骤(2)中高温条件范围为35
–
37℃。
21.本发明一种装载细胞的方法，其中，所述步骤(2)所需时间范围为0.1
–
10分钟。
22.本发明一种装载细胞的方法，其中，所述步骤(2)中高温条件应尽可能选择与一般细胞培养温度或体内温度一致的范围，即35
–
37℃，减少过高温度对细胞活性的影响；如高温条件范围为37
–
45℃，应尽量缩短步骤(2)所需时间，范围为0.1
–
1分钟。
23.本发明一种装载细胞的方法，其中，所述步骤(2)中水凝胶结构的压缩模量范围为10pa
–
1mpa。
24.本发明一种装载细胞的方法，其中，所述步骤(2)中装载的细胞活率范围为90
–
99％。
25.本发明一种装载细胞的方法，采用低温下材料与细胞直接混合，高温下快速成胶的方式装载细胞，操作过程方便快捷，15分钟以内即可完成；过程中无有害物质(如交联剂)添加，温度变化不影响细胞正常生长，细胞活率可达90％以上；装载的细胞在材料三维包裹中，而且具有一定的力学强度，可模拟细胞体内三维生长微环境。
附图说明
26.图1实施例1中装载细胞过程演示(图1a是4℃条件下生物大分子材料与细胞混合过程，图1b是将材料/细胞混合物置于37℃的过程，图1c是形成封装细胞的水凝胶结构)
27.图2实施例1的荧光染色结果(图2a是实施例1培养1天的样品，图2b是实施例1培养7天的样品，图2c实施例1培养14天的样品)
28.图3实施例2的荧光染色结果(图3a是实施例2培养1天的样品，图3b是实施例2培养10天的样品)
29.图4实施例3的荧光染色结果(图4a是实施例3培养1天的样品，图4b是实施例3培养10天的样品)
30.图5实施例4的荧光染色结果(图5a是实施例4培养1天的样品，图5b是实施例4培养10天的样品)
具体实施方式
31.实施例1
32.一种装载小鼠成纤维细胞l929的方法，其中，依次包括如下步骤：
33.(1)在4℃条件下，将生物大分子材料与细胞直接混合，反复吹打细胞50次，直至细胞与材料混合均匀，所需时间为2分钟；
34.(2)将材料/细胞混合物置于37℃条件下5分钟，形成水凝胶结构封装细胞。
35.装载细胞过程演示见图1。
36.实施例2
37.一种装载人脐静脉内皮细胞huvec的方法，其中，依次包括如下步骤：
38.(1)在
‑
5℃条件下，将生物大分子材料与细胞直接混合，反复吹打细胞10次，直至细胞与材料混合均匀，所需时间为0.5分钟；
39.(2)将材料/细胞混合物置于25℃条件下10分钟，形成水凝胶结构封装细胞。
40.实施例3
41.一种装载小鼠骨髓瘤细胞sp2/0的方法，其中，依次包括如下步骤：
42.(1)在15℃条件下，将生物大分子材料与细胞直接混合，反复吹打细胞100次，直至细胞与材料混合均匀，所需时间为5分钟；
43.(2)将材料/细胞混合物置于45℃条件下0.1分钟，形成水凝胶结构封装细胞。
44.实施例4
45.一种装载小鼠主动脉血管平滑肌细胞movas的方法，其中，依次包括如下步骤：
46.(1)在10℃条件下，将生物大分子材料与细胞直接混合，搅拌材料/细胞混合物，搅拌速度为80rpm，直至细胞与材料混合均匀，所需时间为4分钟；
47.(2)将材料/细胞混合物置于30℃条件下7分钟，形成水凝胶结构封装细胞。
48.实施例5
49.装载细胞效果的比较试验
50.一、对比装载细胞的方法
51.对比例1：一种装载小鼠成纤维细胞l929的方法，其中，依次包括如下步骤：
52.(1)在4℃条件下，将生物大分子材料与细胞直接混合，反复吹打细胞50次，直至细胞与材料混合均匀，所需时间为2分钟；
53.(2)将材料/细胞混合物置于60℃条件下20分钟，形成水凝胶结构封装细胞。
54.对比例2：一种装载小鼠成纤维细胞l929的方法，其中，依次包括如下步骤：
55.(1)在
‑
20℃条件下，将生物大分子材料与细胞直接混合，无法吹打细胞；
56.(2)将材料/细胞混合物置于37℃条件下5分钟，无法形成水凝胶结构，无法封装细胞。
57.二、效果试验对比
58.(一)水凝胶结构压缩模量测试：在电子拉力测试仪(model 3365,instron)上测试水凝胶结构的压缩模量，载荷10n，压缩速度20mm/min，温度25℃。水凝胶结构尺寸通过电子
千分尺测量，精确至1um。压缩模量测试结果如表1所示。
59.表1压缩模量比较
[0060][0061]
由表1可知，本发明实施例1
‑
4及对比例1可以形成稳定的水凝胶结构装载细胞，对比例2由于材料和细胞混合过程温度过低，无法形成稳定的水凝胶结构，也无法装载细胞。
[0062]
(二)封装的细胞状态观察：将封装细胞的水凝胶结构置于37℃细胞培养箱中进行三维细胞培养实验，分别在预设的培养时取样，使用吖啶橙ao/碘化丙啶pi双染试剂标记样品中的活/死细胞，使用dapi试剂标记细胞核，通过荧光显微镜观察记录细胞在产品中的生长状态，活率和增殖情况，通过活细胞数/总细胞数比例计算细胞活率。
[0063]
荧光显微镜品牌为mshot明美，型号为mi52
‑
n，激发波长330
‑
380nm、460
‑
490nm和510
‑
550nm分别激发蓝光荧光、绿光荧光和红光荧光。吖啶橙(acridineorange，简称ao)可以通过完整的细胞膜，嵌入所有细胞(活细胞和死细胞)的细胞核，呈现绿色荧光；碘化丙啶(propidiumiodide，简称pi)只能通过不完整的细胞膜，即死细胞的细胞膜，嵌入所有死细胞的细胞核，呈现红色荧光；dapi可以穿透细胞膜，和双链dna结合呈现蓝色荧光。
[0064]
实施例1的荧光染色结果见图2。实施例2的荧光染色结果见图3。实施例3的荧光染色结果见图4。实施例4的荧光染色结果见图5。细胞活率结果见表2。
[0065]
表2细胞活率比较
[0066] 实施例1实施例2实施例3实施例4对比例1对比例2细胞活率95％90％99％92％8％5％
[0067]
由图2
‑
5和表2可知，本发明实施例1
‑
4中细胞可以正常生长，细胞活率都可达90％以上；装载的细胞三维包裹在材料中，可模拟细胞体内三维生长微环境；而对比例1
‑
2中温度变化已损伤细胞，细胞无法正常生长，细胞活率低于10％。
[0068]
结合上述试验可知，实施例1
‑
4与对比例1
‑
2比较，本发明步骤简洁，材料与细胞直接混合后通过升温的方式即可装载细胞；本发明对细胞影响极小，装载过程中无有害物质(如交联剂)添加，装载时间短，控制在15分钟以内，温度变化不影响细胞正常生长，细胞活率可达90％以上；本发明可达到材料三维包裹细胞的效果，形成的水凝胶结构具有一定的力学强度，可模拟细胞体内三维生长微环境。
[0069]
以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。