一种与梨果实乙烯跃变相关的分子标记及检测方法和应用与流程

1.本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种与梨果实乙烯跃变相关的分子标记及检测方法和应用。


背景技术：

2.梨(拉丁学名：pyrus spp，英文名：pear)，蔷薇科梨属植物，通常品种是一种落叶乔木或灌木，极少数品种为常绿，叶片多呈卵形，大小因品种不同而各异。
3.花为白色，或略带黄色、粉红色，有五瓣。果实形状有圆形的，也有基部较细尾部较粗的，即俗称的“梨形”。不同品种的果皮颜色大相径庭，有黄色、绿色、黄中带绿、绿中带黄、黄褐色、绿褐色、红褐色、褐色，个别品种亦有紫红色。野生梨的果径较小，在1到4厘米之间，而人工培植的品种果径可达8厘米，长度可达18厘米。
4.梨的果实通常用来食用，不仅味美汁多，甜中带酸，而且营养丰富，含有多种维生素和纤维素，不同种类的梨味道和质感都完全不同。梨既可生食，也可蒸煮后食用。在医疗功效上，梨可以通便秘，利消化，对心血管也有好处。
5.跃变型果实在开始成熟时，乙烯含量急剧上升，根据这个原理，可以通过测定果实中乙烯的含量来确定采收期。目前，美国密歇根州立大学研究出了便携带式的乙烯测定仪，使果实成熟度的确定更加科学可靠，在梨采摘之后进行储藏时，由于梨果实的成熟度具有一定的差异，因此，有的果实过度成熟会导致腐败，而仅仅通过外观难以鉴别梨果实的耐存储还是需要尽快消费，造成了资源的浪费。
6.在育种过程中果实成熟大部分还是依赖外观判定，结果带有主观性，缺乏定量的检测方法，而梨果实育种过程中也缺乏能够直接检测乙烯跃变的分子标记。


技术实现要素：

7.本发明提供的一种与梨果实乙烯跃变相关的分子标记及检测方法和应用，分子标记与梨果实乙烯跃变性状紧密相关，用于梨果实的育种研究。
8.本发明提供了一种与梨果实乙烯跃变相关的分子标记，该分子标记表现为seq id no.1所示核苷酸序列的插入/缺失长度多态性。
9.进一步地，具有seq id no.1所示核苷酸序列且在所述分子标记位点纯合的个体，表现为非乙烯跃变；
10.缺失seq id no.1所示核苷酸序列且在所述分子标记位点纯合的个体，表现为乙烯跃变；
11.缺失seq id no.1所示核苷酸序列且在所述分子标记位点杂合的个体，表现为乙烯跃变。
12.本发明还提供了用于检测所述的分子标记的引物对，包括核苷酸序列如seq id no.2所示的正向引物f和核苷酸序列如seq id no.3所示的反向引物r。
13.进一步地，利用所述引物对对梨基因组dna进行pcr扩增并检测扩增片段长度，当
扩增片段为146bp时，所述待测梨具有seq id no.1所示核苷酸序列的插入，表现为非乙烯跃变；
14.当扩增片段为121bp时，所述待测梨缺失seq id no.1所示核苷酸序列，表现为乙烯跃变；
15.当扩增片段为146bp和121bp时，待测梨所述分子标记位点杂合，表现为乙烯跃变。
16.本发明还提供了上述引物对在梨育种中的用途。
17.本发明还提供了一种包含上述引物对的试剂盒，所述试剂盒用于检测所述分子标记。
18.本发明还提供了所述的试剂盒在梨育种中的用途。
19.本发明还提供了所述的分子标记检测梨果实乙烯跃变性状的方法，包括如下步骤：
20.利用上述引物对，或者上述的试剂盒，对待测梨基因组dna进行pcr扩增并检测扩增片段长度，当扩增片段为146bp时，表现为非乙烯跃变，当扩增片段为121bp时，表现为乙烯跃变，当扩增片段为146bp和121bp时，待测梨所述分子标记位点杂合，表现为乙烯跃变。
21.进一步地，利用琼脂糖凝胶电泳检测扩增片段长度。
22.本发明还提供了所述的分子标记在梨储藏管理中的用途。
23.与现有技术相比，本发明提供的一种与梨果实乙烯跃变相关的分子标记，具有以下有益效果：
24.1、本发明提供的分子标记与梨果实乙烯跃变性状紧密相关，通过pcr扩增获得的基因片段长度判断是否发生乙烯跃变，能够快速准确的判断梨果实的成熟情况，能够用于梨的育种中。
25.2、本发明所述的分子标记与梨果实乙烯跃变性状紧密相关，用于梨果实的储存管理，能够避免资源浪费和对于果实的误判。
附图说明
26.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
27.图1为本发明实施例1中梨果实样品1
‑
样品12不同天数的乙烯生成量变化趋势图；
28.其中，图(1)
‑
图(12)分别代表样本1
‑
样本12不同天数的乙烯生成量变化趋势图；
29.图2为本发明实施例1中梨果实样品13
‑
24不同天数的乙烯生成量变化趋势图；
30.其中，图(13)
‑
图(24)分别代表样本13
‑
样本24不同天数的乙烯生成量变化趋势图；
31.图3为本发明实施例1中梨果实样品1
‑
24的检测电泳结果。
具体实施方式
32.下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的材料、试
剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
33.实施例1
34.一、采集成熟梨样本，检测乙烯生成量
35.采集成熟梨作为待测样本，共有24个样本，分别标记序号为1，2，3，4
…
23，24，我们对所有样本进行乙烯生成量的检测，利用样本在不同天数的乙烯生成量变化趋势判断判断样品是否发生乙烯跃变；
36.结果显示：图1中为样本1
‑
12的乙烯生成量检测结果，根据图1中不同样本的乙烯生成量变化趋势可以看出，样本1
‑
12中乙烯生成量趋于稳定，均未发生乙烯跃变，即样本1
‑
12均判断为非乙烯跃变；
37.图2为样本13
‑
24的乙烯生成量检测结果，根据图2中不同样本的乙烯生成量变化趋势可以看出样本13
‑
24的乙烯生成量发生跃变，即样本13
‑
24均判断为乙烯跃变。
38.二、与梨果实乙烯跃变相关的分子标记验证
39.本发明提供的一种与梨果实乙烯跃变相关的分子标记，所述分子标记表现为seq id no.1所示核苷酸序列的插入/缺失长度多态性；
40.seq id no.1：acggtagtaccattcaacttttttg。
41.利用上述分子标记检测梨果实乙烯跃变性状的步骤如下：
42.1、提取上述24个样本的梨基因组dna；
43.2、设计正向引物f和反向引物r
44.所述正向引物f的核苷酸序列如seq id no.2所示，所述反向引物r的核苷酸序列如seq id no.3所示；
45.seq id no.2：tagtcactgaccatttgatcttaattc
46.seq id no.3：gagtccctgttctcgttaactctaa
47.利用seq id no.2和seq id no.3所示的引物对，对所有待测梨基因组dna样本进行pcr扩增并检测扩增片段长度，扩增体系为：dna模板0.5μl，正向引物f 0.5μl，反向引物r 0.5μl，2
×
extaqtm 0.5μl，rnase free water 0.5μl；
48.扩增程序为：95.0℃，3min；95.0℃，30s，50.0℃，30s，72.0℃，30s，34cycles；72.0℃，5min；4.0℃，pluse；
49.3、结果判断
50.结果如图3所示，当扩增片段为146bp时，表现为非乙烯跃变，当扩增片段为121bp时，表现为乙烯跃变，当扩增片段为146bp和121bp时，待测梨所述分子标记位点杂合，表现为乙烯跃变。
51.我们发现乙烯生成量变化结果与本发明通过分子标记判断结果一致，本发明提供的一种与梨果实乙烯跃变相关的分子标记，能够通过检测该分子标记准确判断梨果实的乙烯跃变发生情况，能够快速准确的判断梨果实的成熟情况，用于梨果实的储存管理，能够避免资源浪费和对于果实的误判。
52.需要说明的是，为了防止赘述，本发明的描述了优选的实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
53.显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精
神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。