一株白黄黑链霉菌、含有该菌的菌剂及它们在防治植物病害中的应用的制作方法

1.本发明涉及植物防治技术，具体地，涉及一株白黄黑链霉菌、含有该菌的菌剂及它们在防治植物病害中的应用。


背景技术：

2.植物病害是严重危害农作物的自然灾害之一，约80％的植物病害是由植物病原真菌引起的，植物病害会造成农作物局部细胞和组织死亡、腐烂、萎蔫等症状，进而会影响农作物的产量和品质，对国民经济的发展和人民的生活水平形成不良的影响，也严重威胁到农产品的经济性。
3.目前，对植物病原真菌感染导致的植物病害，主要防治手段是使用化学农药和培育抗病品种。化学农药的连年使用，不仅使植物病原真菌的抗药性有所增强，而且对生态环境造成严重的污染问题，随着食品的摄入和接触，化学农药在人体内易造成累积或残留，危害人类的健康安全。培育能够抗病的农作物品种被认为是防治植物病害的经济而有效的途径，但目前尚无优质高抗的品种可以大面积推广。


技术实现要素：

4.本发明的目的是为了克服现有技术存在的化学农药污染残留严重、培育抗病毒品种难度大的问题，提供一株白黄黑链霉菌、含有该菌的菌剂及它们在防治植物病害中的应用，该菌株及其发酵产物能有效抑制植物病原真菌的菌丝生长，从而达到防治目的。
5.为了实现上述目的，本发明第一方面提供一种白黄黑链霉菌，该白黄黑链霉菌(streptomyces albiflaviniger)的保藏编号为cctcc no：m2021913。
6.本发明第二方面提供一种白黄黑链霉菌的培养方法，包括以下步骤：
7.将白黄黑链霉菌进行活化后得到种子液，将所述种子液进行发酵培养后得到发酵液，其中，所述白黄黑链霉菌的保藏编号为cctcc no：m2021913。
8.优选地，所述活化采用lb培养基，所述发酵培养的液体培养基含有甘油、糊精、大豆蛋白、酵母粉、硫酸铵和碳酸钙；
9.优选地，所述发酵培养的液体培养基中，所述甘油的浓度为18
‑
20g/l，所述糊精的浓度为18
‑
20g/l，所述大豆蛋白的浓度为8
‑
12g/l，所述酵母粉的浓度为2
‑
3g/l，所述硫酸铵的浓度为0.4
‑
0.5g/l、所述碳酸钙的浓度为2
‑
3g/l；所述发酵培养的液体培养基ph为7.2
‑
7.4。
10.优选地，所述活化的条件至少满足：温度为25
‑
28℃、转速为160
‑
200rpm、时间为48
‑
168h；
11.所述发酵培养的条件至少满足：接种量为5
‑
15体积％、温度为25
‑
28℃、转速为160
‑
200rpm、时间为48
‑
168h。
12.本发明第三方面提供一种菌剂，该菌剂含有上述的白黄黑链霉菌，或者根据上述
的白黄黑链霉菌的培养方法制得的发酵液。
13.本发明第四方面提供上述的白黄黑链霉菌和/或上述的菌剂在防治植物病害中的应用。
14.优选地，所述植物病害选自禾谷镰刀菌、香梨腐烂病菌、烟草赤星病菌、立枯丝核菌、辣椒炭疽病菌和西瓜枯萎病菌中的至少一种引起的植物病害。
15.优选地，所述植物病害选自小麦赤霉病、香梨腐烂病、烟草赤星病、水稻纹枯病、辣椒炭疽病和西瓜枯萎病中的至少一种。
16.本发明第五方面提供一种防治植物病害的方法，该方法包括：将上述的白黄黑链霉菌和/或上述的菌剂与植物接触。
17.优选地，所述植物的植物病害选自禾谷镰刀菌、香梨腐烂病菌、烟草赤星病菌、立枯丝核菌、辣椒炭疽病菌和西瓜枯萎病菌中的至少一种引起的植物病害；
18.优选地，所述植物选自小麦、香梨、烟草、水稻、辣椒和西瓜中的至少一种。
19.通过上述技术方案，本发明的有益效果为：
20.本发明提供的白黄黑链霉菌(streptomyces albiflaviniger)对禾谷镰刀菌、香梨腐烂病菌、烟草赤星病菌、立枯丝核菌、辣椒炭疽病菌和西瓜枯萎病菌等多种植物病原真菌能够形成有效的抑制生长作用，并在一定时间段内，持续具有显著的抑制作用；该白黄黑链霉菌能够作为一种绿色、安全、环境友好型的生物防治媒介，为小麦、香梨、烟草、水稻、辣椒和西瓜等农作物的生物防治提供了新的选择。
21.本发明的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
22.生物保藏
23.本发明提供的菌株为白黄黑链霉菌(streptomyces albiflaviniger)，并于2021年7月20日被保藏在中国典型培养物保藏中心(保藏单位的简称为cctcc，地址位于中国.武汉.武汉大学，邮编：430072)，保藏编号为cctcc no：m2021913。
附图说明
24.图1是实施例1获得的pesy23菌株的菌落形态图；
25.图2是实施例1获得的pesy23菌株的气生菌丝图；
26.图3是实施例1获得的pesy23菌株的系统发育树；
27.图4是实施例1获得的pesy23与植物病原真菌的拮抗实验图，其中，1号为禾谷镰刀菌、2号为香梨腐烂病菌、3号为烟草赤星病菌、4号为立枯丝核菌、5号为辣椒炭疽病病菌、6号为西瓜枯萎病菌。
具体实施方式
28.在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
29.本发明第一方面提供一种白黄黑链霉菌，该白黄黑链霉菌(streptomyces albiflaviniger)的保藏编号为cctcc no：m2021913。
30.本发明的白黄黑链霉菌(streptomyces albiflaviniger)分离自健康的辣椒植株样品。
31.根据本发明，筛选所述白黄黑链霉菌的方法可以采用本领域常规的筛选新菌种的方法，例如该筛选方法可以包括：
32.(1)将从多年连作重茬的辣椒地采集的健康植株侧根剪下，用清水洗净泥沙，放入超净工作台中吹干，然后放入磷酸氢二钠中超声以进一步去除表面杂质，取出根系依次用无水乙醇、4％次氯酸钠、硫代硫酸钠进行表面消毒，再用无菌水清洗3遍(将最后1次清洗的水涂布平板，25
‑
35℃培养，检验表面消毒效果)，将消毒彻底的根系在超净工作台中吹干；
33.(2)将步骤(1)得到的消毒彻底的根系吹干后剪成小段，放置在分离培养基上，25
‑
35℃培养，待长出单菌落，挑取根系组织上的放线菌于分离培养基上，划线分离纯化，得到待选菌株，加甘油，于
‑
80℃保存；
34.(3)取将步骤(2)得到的待选菌株分别进行拮抗实验，具体过程为：将辣椒炭疽病病菌加入pda固体培养基中进行活化，待长出菌丝后，用打孔器打一菌饼置于另一新鲜的pda固体培养基平板中央，倒置放置，将步骤(2)分离出的所述待选菌株接种于菌饼周围，每个平板接种2或4个，25
‑
35℃恒温下培养，根据有无抑菌带和/或抑菌圈的大小来判断其拮抗效果；
35.(4)参照步骤(3)的拮抗实验过程，对步骤(3)得到的具有拮抗作用的待选菌株进行第二次拮抗实验，筛选出一株拮抗能力较强的菌株。
36.经过如上的筛选，得到了本发明的白黄黑链霉菌(streptomyces albiflaviniger)，并于2021年7月20日被保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：m2021913，其16s rdna的核苷酸序列如seq id no：1所示。
37.根据本发明，分离培养基为添加有抑菌剂的高氏1号培养基，高氏1号培养基中添加的抑菌剂含有萘啶酮酸(终浓度为20
‑
30mg/l)、重铬酸钾(终浓度为120
‑
180mg/l)和苯菌灵(终浓度为20
‑
30mg/l)；高氏1号培养基可以采用购买的市售品，也可以自行配制获得，示例性地，高氏1号培养基含有可溶性淀粉20g/l、kno
3 1g/l、k2hpo
4 0.5g/l、mgso4·
7h2o 0.5g/l、nacl 0.5g/l、feso4·
7h2o 0.01g/l、琼脂20g/l，ph＝7.4
‑
7.6。
38.本发明提供的白黄黑链霉菌经过培养能够产生大量白黄黑链霉菌的活菌体，所述培养的方法没有特别的要求，只要是能使所述白黄黑链霉菌增殖即可。
39.本发明第二方面提供一种白黄黑链霉菌的培养方法，包括以下步骤：将白黄黑链霉菌进行活化后得到种子液，将所述种子液进行发酵培养后得到发酵液，其中，所述白黄黑链霉菌的保藏编号为cctcc no：m2021913。
40.根据本发明，白黄黑链霉菌的培养过程，通过将白黄黑链霉菌的单菌落接种至活化液体培养基中进行活化后得到种子液，再将种子液转接至发酵培养基中进行培养得到发酵液，以实现对白黄黑链霉菌的增殖。
41.为了提高白黄黑链霉菌的增殖速率，增加白黄黑链霉菌的发酵产物的产量，优选情况下，所述活化采用lb培养基；所述发酵培养的液体培养基含有甘油、糊精、大豆蛋白、酵母粉、硫酸铵和碳酸钙。
42.示例性地，所述lb培养基含有蛋白胨10g/l、酵母粉5g/l、氯化钠5g/l，自然ph；所述发酵培养的液体培养基中，所述甘油的浓度为18
‑
20g/l，所述糊精的浓度为18
‑
20g/l，所
述大豆蛋白的浓度为8
‑
12g/l，所述酵母粉的浓度为2
‑
3g/l，所述硫酸铵的浓度为0.4
‑
0.5g/l、所述碳酸钙的浓度为2
‑
3g/l；所述发酵培养的液体培养基ph为7.2
‑
7.4。
43.根据本发明，所述活化的条件至少满足：温度为25
‑
28℃，具体可以为25℃、26℃、27℃、28℃，或者上述两个值之间的任意值；转速为160
‑
200rpm，具体可以为160rpm、170rpm、180rpm、190rpm、200rpm，或者上述两个值之间的任意值；时间为48
‑
168h，具体可以为48h、96h、120h、144h、168h，或者上述两个值之间的任意值；所述发酵培养的条件至少满足：接种量为5
‑
15体积％，具体可以为5体积％、7体积％、9体积％、11体积％、13体积％、15体积％，或者上述两个值之间的任意值；温度为25
‑
28℃，具体可以为25℃、26℃、27℃、28℃，或者上述两个值之间的任意值；转速为160
‑
200rpm，具体可以为160rpm、170rpm、180rpm、190rpm、200rpm，或者上述两个值之间的任意值；时间为48
‑
168h，具体可以为48h、96h、120h、144h、168h，或者上述两个值之间的任意值。
44.本发明可以进一步分离上述发酵液中的白黄黑链霉菌的活菌体，所述分离的方法没有特别的限制，只要是能从发酵液中富集菌体即可，例如可以通过离心和/或过滤的方法实现，所述离心和所述过滤的条件可以为公知的条件，本发明在此不再赘述。
45.本发明第三方面提供一种菌剂，该菌剂含有上述的白黄黑链霉菌，或者根据上述的白黄黑链霉菌的培养方法制得的发酵液。
46.根据本发明，在所述菌剂中，所述白黄黑链霉菌的浓度没有特别的限制，可以根据具体的情况进行具体的选择，在此不再详细赘述。
47.另外，根据预定的用途不同，本发明提供的菌剂可以制备为不同的剂型，并且添加有相应的不会对所述白黄黑链霉菌的活性造成影响的赋形剂等成分。例如可以为白黄黑链霉菌的发酵液，或者是白黄黑链霉菌的发酵液除去上清后的菌体。其中，在何种剂型的菌剂中添加何种辅料为本领域技术人员所熟知，在此不再详细说明。示例性地，菌剂可制成含有上述白黄黑链霉菌，或者根据上述的白黄黑链霉菌的培养方法制得的发酵液的生物药剂、生物土壤或生物肥料等。
48.本发明第四方面提供上述的白黄黑链霉菌和/或上述的菌剂在防治植物病害中的应用。
49.根据本发明，所述植物病害选自禾谷镰刀菌、香梨腐烂病菌、烟草赤星病菌、立枯丝核菌、辣椒炭疽病菌和西瓜枯萎病菌中的至少一种引起的植物病害。本发明提供的白黄黑链霉菌能够有效抑制禾谷镰刀菌、香梨腐烂病菌、烟草赤星病菌、立枯丝核菌、辣椒炭疽病菌和西瓜枯萎病菌的生长，进而其可应用于禾谷镰刀菌、香梨腐烂病菌、烟草赤星病菌、立枯丝核菌、辣椒炭疽病菌和西瓜枯萎病菌中任意一种或多种所导致的植物病害。
50.根据本发明，所述植物病害的载体可以是任意一种植物，优选情况下，采用本发明提供的白黄黑链霉菌防治小麦、香梨、烟草、水稻、辣椒和西瓜由禾谷镰刀菌、香梨腐烂病菌、烟草赤星病菌、立枯丝核菌、辣椒炭疽病菌和西瓜枯萎病菌所形成的植物病害。
51.根据本发明，所述植物病害选自小麦赤霉病、香梨腐烂病、烟草赤星病、水稻纹枯病、辣椒炭疽病和西瓜枯萎病中的至少一种。
52.本发明第五方面提供一种防治植物病害的方法，该方法包括：将上述的白黄黑链霉菌和/或上述的菌剂与植物接触。
53.根据本发明，与植物接触的白黄黑链霉菌的形式并没有特别的限定，只要保证加
入后所述白黄黑链霉菌能够对产生植物病害的植物病原真菌进行有效地抑制即可，例如，可以为培养至对数期的活化菌体(发酵液或菌体沉淀)，也可以为冷冻干燥后的菌体干粉，或者经复配后得到的菌剂，优选为培养至对数期的活化菌体。
54.本发明对加入的白黄黑链霉菌数量也没有特别的限制，这可以根据所述植物及其生长环境来决定。
55.根据本发明，所述植物的植物病害选自禾谷镰刀菌、香梨腐烂病菌、烟草赤星病菌、立枯丝核菌、辣椒炭疽病菌和西瓜枯萎病菌中的至少一种引起的植物病害；
56.根据本发明，所述植物选自小麦、香梨、烟草、水稻、辣椒和西瓜中的至少一种。
57.以下将通过实施例对本发明进行详细描述。
58.以下实施例中，原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到；
59.lb培养基的制备方法为：将10g蛋白胨、5g酵母粉、5g氯化钠混合后，补充蒸馏水至1000ml，自然ph，121℃高压蒸汽灭菌30min；
60.pda固体培养基的制备方法为：将200g土豆、20g葡萄糖与18g琼脂混合后，补充蒸馏水至1000ml，自然ph，115℃高压蒸汽灭菌30min；
61.sm 14液体培养基的制备方法为：将19g甘油、19g糊精、10g大豆蛋白、2.5g酵母粉、0.4g硫酸铵、2.5g碳酸钙混合后，补充蒸馏水至1000ml，调节ph至7.2
‑
7.4，121℃高压蒸汽灭菌30min；
62.分离培养基的制备方法为：将20g可溶性淀粉、1g的kno3、0.5g的k2hpo4、0.5g的mgso4·
7h2o、0.5g的nacl、0.01g的feso4·
7h2o、20g琼脂、0.03g萘啶酮酸、0.15g重铬酸钾和0.03g苯菌灵混合后，补充蒸馏水至1000ml，调节ph至7.4
‑
7.6，121℃高压蒸汽灭菌30min；
63.高氏2号液体培养基的制备方法为：将5g蛋白胨、5gnac1、10g葡萄糖混合后，补充蒸馏水至1000ml，自然ph，115℃高压蒸汽灭菌30min。
64.实施例1
65.(1)将从多年连作重茬的辣椒地采集的健康植株侧根剪下，用清水洗净泥沙，放入超净工作台中吹干，然后放入磷酸氢二钠中超声1min以进一步去除表面杂质，取出根系依次用无水乙醇、4％次氯酸钠、硫代硫酸钠进行表面消毒，再用无菌水清洗3遍(将最后1次清洗的水涂布平板，28℃培养，检验表面消毒效果)，将消毒彻底的根系在超净工作台中吹干；
66.(2)将步骤(1)得到的消毒彻底的根系吹干后剪成小段，放置在分离培养基上，28℃培养，待长出单菌落，挑取根系组织上的放线菌于分离培养基上划线分离纯化，得到待选菌株，加甘油，于
‑
80℃保存；
67.(3)取将步骤(2)得到的待选菌株分别进行拮抗实验，具体过程为：将辣椒炭疽病病菌加入pda固体培养基中进行活化，待长出菌丝后，用打孔器打一菌饼置于另一新鲜的pda固体培养基平板中央，倒置放置，将分离出的所述待选菌株接种于菌饼周围，每个平板接种2或4个，28℃恒温下培养，根据有无抑菌带和/或抑菌圈的大小来判断其拮抗效果；
68.(4)参照步骤(3)的拮抗实验过程，对步骤(3)得到的具有拮抗作用的待选菌株进行第二次拮抗实验，筛选出一株拮抗能力较强的菌株，命名为pesy23。
69.对pesy23菌株进行形态鉴定
70.将pesy23菌株接种于高氏2号固体培养基上，进行划线培养，倒置于28℃条件下，培养96
‑
120h，pesy23菌株在高氏2号固体培养基培养后的菌落形态图如图1所示。经观察发现，pesy23菌株的菌落小而致密、干而不透明，幼时表面光滑、边缘整齐、颜色单调、不易挑起，继而发展成绒毛状、表面起粉、灰色或黑色，正反面颜色不同。
71.pesy23菌株的气生菌丝图如图2所示，pesy23菌株的系统发育树图如图3所示。
72.对pesy23进行分子实验鉴定。
73.挑pesy23菌株的单菌落于装有20ml高氏2号液体培养基的三角瓶中，在温度为26℃下、以转速为180rpm振荡培养3d，取1ml菌液以转速为10000rpm离心1min后收集菌体；将菌体在无菌条件下研磨成匀浆状后，参考uniq
‑
10柱式细菌基因组抽提试剂盒说明书，提取基因组总dna，将总dna稀释到约50ng/ul为模板，进行16s rdna基因扩增。
74.参照以下扩增体系进行pcr扩增：25μl的2
×
easytaq pcr supermix( dye)、1.5μl的上游引物、1.5μl的下游引物、1.5μl的总dna模板混合后，用无菌水补充至50μl；
75.本实施例中，2
×
easytaq pcr supermix( dye)购至北京全式金生物技术有限公司，其中预含有dna聚合酶、dntps和反应缓冲液、电泳缓冲液等pcr扩增所需的常用试剂，本领域技术人员可根据需要直接选择其他pcr扩增试剂盒，或是根据需要自行采用独立的dna聚合酶、dntps和反应缓冲液进行pcr扩增；
76.上游引物采用27f，其核苷酸序列如seq id no：2所示，下游引物采用1492r，其核苷酸序列如seq id no：3所示；
77.seq id no.2(27f)：5
′‑
tcctccgcttattgatatgc
‑3′
；
78.seq id no.3(1492r)：5
′‑
caaacttggtcattagagga
‑3′
。
79.pcr扩增的条件为：95℃预变性10min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，重复35个循环；72℃继续延伸10min。
80.经过上述pcr扩增得到的扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离，在1500bp附近有明显的条带，对扩增产物进行双向测序，测序得到的基因序列如seq id no.1所示。将测序得到的基因序列与ez biocloud数据库(https://www.ezbiocloud.net)中的核苷酸序列进行比对，结果显示，pesy23菌株与streptomyces albiflaviniger strain nrrl b
‑
1356(登录号：aj391812)亲缘关系最近，同源性达到99.57％。
81.结合pesy23菌株的形态结构特征及系统发育树分析，确定pesy23菌株具体为白黄黑链霉菌(streptomyces albiflaviniger)，所述白黄黑链霉菌streptomyces albiflaviniger pesy23已于2021年7月20日被保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号cctcc no：m2021913。
82.实施例2
83.s1、挑取实施例得到的pesy23菌株的单菌落于装有20ml的lb液体培养基的三角瓶中，在温度为26℃下、以转速为180rpm振荡培养120h，制备得到种子液；
84.s2、将步骤s1得到的种子液以接种量为10体积％接种于装有sm14液体培养基的发酵罐中，在温度为26℃下、以转速为180rpm振荡培养120h，制备得到pesy23菌株发酵液。
85.实施例3
86.s1、挑取实施例得到的pesy23菌株的单菌落于装有20ml的lb液体培养基的三角瓶中，在温度为25℃下、以转速为200rpm振荡培养48h，制备得到种子液；
87.s2、将步骤s1得到的种子液以接种量为15体积％接种于装有sm14液体培养基的发酵罐中，在温度为25℃下、以转速为200rpm振荡培养48h，制备得到pesy23菌株发酵液。
88.实施例4
89.s1、挑取实施例得到的pesy23菌株的单菌落于装有20ml的lb液体培养基的三角瓶中，在温度为28℃下、以转速为160rpm振荡培养168h，制备得到种子液；
90.s2、将步骤s1得到的种子液以接种量为5体积％接种于装有sm14液体培养基的发酵罐中，在温度为28℃下、以转速为160rpm振荡培养168h，制备得到pesy23菌株发酵液。
91.测试例1
92.将禾谷镰刀菌接种在pda固体培养基上活化，长出菌丝后用打孔器取一个菌饼接种在新鲜pda固体培养基的中央，取实施例1得到的pesy23菌株的单菌落在距离禾谷镰刀菌饼3cm点接，25℃下培养6天，测量抑菌圈半径，结果见表1。图4中1号为实施例1提供的pesy23菌株在pda固体培养基上与禾谷镰刀菌的拮抗实验图，由图4中1号和表1可观察到，pesy23菌株对禾谷镰刀菌具有良好的拮抗作用。
93.表1pesy23菌株在pda固体培养基上拮抗禾谷镰刀菌的抑菌圈半径
94.培养天数1234平均值抑菌圈半径(mm)13.013.512.913.213.15
95.测试例2
96.将香梨腐烂病菌接种在pda固体培养基上活化，长出菌丝后用打孔器取一个菌饼接种在新鲜pda固体培养基的中央，取实施例1得到的pesy23菌株单菌落在距离香梨腐烂病菌饼3cm点接，25℃下培养6天，测量抑菌圈半径，结果见表2。图4中2号为实施例1提供的pesy23菌株在pda固体培养基上与香梨腐烂病菌的拮抗实验图，由图4中2号和表2可观察到，pesy23菌株对香梨腐烂病菌具有良好的拮抗作用，并且pesy23菌株对香梨腐烂病菌的抑制能力在一周内都保持较高的水平。
97.表2pesy23在pda固体培养基上拮抗香梨腐烂病菌的抑菌圈半径
98.培养天数1234平均值抑菌圈半径(mm)10.011.18.310.39.93
99.测试例3
100.将烟草赤星病菌接种在pda固体培养基上活化，长出菌丝后用打孔器取一个菌饼接种在新鲜pda固体培养基的中央，取实施例1得到的pesy23菌株单菌落在距离烟草赤星病菌饼3cm点接，25℃下培养6天，测量抑菌圈半径，结果见表3。图4中3号为实施例1提供的pesy23菌株在pda固体培养基上与烟草赤星病菌的拮抗实验图，由图4中3号和表3可观察到，pesy23菌株对烟草赤星病菌具有良好的拮抗作用，并且pesy23菌株对烟草赤星病菌的抑制能力在一周内都保持较高的水平。
101.表3pesy23菌株在pda固体培养基上拮抗烟草赤星病菌的抑菌圈半径
102.培养天数1234平均值抑菌圈半径(mm)11.011.211.511.211.23
103.测试例4
104.(1)取2ml实施例2得到的pesy23菌株发酵液，以转速为10000rpm离心1min后收集
菌体，将菌体用0.22μm一次性细菌过滤器过滤，得到的滤液放于
‑
20℃备用；
105.(2)将立枯丝核菌接种在pda固体培养基上活化，长出菌丝后用打孔器取一个菌饼接种在新鲜pda固体培养基的中央，制成立枯丝核菌拮抗试验平板；在距离菌饼3cm处用打孔器打四个孔，然后取100μl步骤(1)得到的滤液加入孔内，置于25℃培养6天，测量抑菌圈半径，结果见表4。图4中的4号为实施例2得到的pesy23菌株发酵液在pda固体培养基上与立枯丝核菌的拮抗实验图，由图4中4号和表4可观察到，pesy23菌株发酵液对立枯丝核菌具有良好的拮抗作用，并且pesy23菌株发酵液对立枯丝核菌的抑制能力在一周内都保持较高的水平。
106.表4pesy23菌株在pda固体培养基上拮抗立枯丝核菌的抑菌圈半径
107.培养天数1234平均值抑菌圈半径(mm)9.09.28.99.09.00
108.测试例5
109.(1)取2ml实施例3得到的pesy23菌株发酵液，以转速为10000rpm离心1min后收集菌体，将菌体用0.22μm一次性细菌过滤器过滤，得到的滤液放于
‑
20℃备用；
110.(2)将辣椒炭疽病病菌接种在pda固体培养基上活化，长出菌丝后用打孔器取一个菌饼接种在新鲜pda固体培养基的中央，制成辣椒炭疽病病菌拮抗试验平板；在距离菌饼3cm处用打孔器打四个孔，然后取步骤(1)得到的滤液100μl加入孔内，置于25℃培养6天，测量抑菌圈半径，结果见表5。图4中5号为实施例2得到的pesy23菌株发酵液在pda固体培养基上与辣椒炭疽病病菌的拮抗实验图，由图4中5号和表5可观察到，pesy23菌株发酵液对辣椒炭疽病病菌具有良好的拮抗作用。
111.表5pesy23在pda固体培养基上拮抗辣椒炭疽病病菌的抑菌圈半径
112.培养天数1234平均值抑菌圈半径(mm)13.014.012.913.613.38
113.测试例6
114.(1)取2ml实施例4得到的pesy23菌株发酵液，以转速为10000rpm离心1min后收集菌体，将菌体用0.22μm一次性细菌过滤器过滤，得到的滤液放于
‑
20℃备用；
115.(2)将西瓜枯萎病菌接种在pda固体培养基上活化，长出菌丝后用打孔器取一个菌饼接种在新鲜pda固体培养基的中央，制成西瓜枯萎病菌拮抗试验平板；在距离菌饼3cm处用打孔器打四个孔，然后取步骤(1)得到的滤液100μl加入孔内，置于25℃培养6天，测量抑菌圈半径，结果见表6。请参阅图4中6号为实施例3得到的pesy23菌株发酵液在pda固体培养基上与西瓜枯萎病菌的拮抗实验图，由图4中6号和表6可观察到，pesy23菌株发酵液对西瓜枯萎病菌具有良好的拮抗作用。
116.表6pesy23菌株在pda固体培养基上拮抗西瓜枯萎病菌的抑菌圈半径
117.培养天数1234平均值抑菌圈半径(mm)17.217.016.917.217.10
118.测试例7
119.在玻璃温室内采用盆栽接种的方式，将烟草赤星病菌在pda固体培养基上26℃恒温培养4
‑
5d，取4叶期烟草苗用5号注射器针头在中部叶片刺4针，然后将烟草赤星病菌的菌
饼贴在针刺处，用无菌脱脂棉蘸无菌水覆盖其上保湿，每处理15株，3次重复，28
‑
30℃高温培养，保湿48h后去除菌饼；
120.将接种烟草赤星病菌后的烟草苗分为3组，分别将实施例1得到的pesy23菌株发酵液的50倍稀释液(处理1)、50％多菌灵wp的500倍稀液(处理2)及清水(对照组)均匀喷于对应组别的烟草苗叶片的反正面，以叶面滴水为度，接种7天后调查病情指数，计算防治效果，结果见表7。
121.以常用的抗真菌药剂多菌灵为阳性对照，盆栽实验结果显示，采用上述优化的发酵条件得到的pesy23菌株发酵液对烟草赤星病具有很好的防治效果，处理后病情指数为25.86，明显低于对照，防治效果可达58.58％，与50％多菌灵wp的防治效果相当。
122.表7
123.处理病情指数防治效果(％)对照组62.43
‑
处理125.8658.58处理223.4562.43
124.以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。