山羊副流感病毒3型感染性cDNA克隆构建方法及其应用与流程

山羊副流感病毒3型感染性cdna克隆构建方法及其应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，具体涉及山羊副流感病毒3型感染性cdna克隆构建方法及其应用。


背景技术：

2.山羊副流感病毒3型(caprine parainfluenza virus 3，cpiv3)是新近鉴定的一种副粘病毒科呼吸道病毒属成员，为有囊膜的单股负链rna病毒，主要感染山羊和绵羊。cpiv3基因组大小为15624bp，与同属的病毒相似，从3’到5’端依次是3’端前导序列、核蛋白(n)基因、磷蛋白(p)基因、基质蛋白(m)基因、融合蛋白(f)基因、血凝素蛋白(hn)基因、大转录蛋白(l)基因和5’端序列。该病毒主要通过呼吸道传播，引起呼吸道疾病，在应激、混合或继发感染其他病原等情况下会导致明显的临床症状，引起严重的呼吸道疾病，导致较高的发病率和死亡率。流行病学研究表明国内羊群存在较高的病毒感染率。该病毒为新近发现的新病原，尽管已经分别围绕病毒感染与i型干扰素反应、细胞凋亡、mirna及外泌体的相互作用开展研究，但目前对其感染和致病机制的研究尚不深入。国内外均无对该病毒有效防控方法的报道，且尚无可以预防山羊副流感病毒3型感染的疫苗。
3.反向遗传技术是新兴的一种定向修饰或改造病毒的重要技术，应用前景非常广阔，该技术已成功广泛应用于多种病毒的疫苗和致病机制研究。但是，现有技术中还未有人构建出山羊副流感病毒3型感染性cdna克隆。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供山羊副流感病毒3型感染性cdna克隆构建方法及其应用，构建效率高，该感染性cdna克隆拯救的病毒rcpiv3感染mdbk细胞后能够快速产生细胞病变，病毒滴度可达到108tcid
50
/ml以上，且保持稳定。
5.本发明的目的采用如下技术方案实现：
6.山羊副流感病毒3型感染性cdna克隆构建方法，包括以下步骤：
7.(1)将seq id no:1所示序列插入pci
‑
neo质粒，得到重组质粒pci
‑
neo
‑
1；
8.(2)以山羊副流感病毒3型的总rna的反转录产物为模板，用引物af1、af2和ar扩增a片段，用引物bf和br扩增b片段，用引物cf和cr扩增c片段，用引物df、dr1和dr2扩增d片段；将扩增得到的片段a和b插入pci
‑
neo
‑
1载体，得到重组载体pci
‑
a
‑
b；将扩增得到的片段c和d插入pci
‑
neo
‑
1载体中，得到重组载体pci
‑
c
‑
d；
9.(3)以pci
‑
a
‑
b为模板，用引物ab
‑
f和ab
‑
r扩增片段a
‑
b；以pci
‑
c
‑
d为模板，用引物cd
‑
f和cd
‑
r，扩增c
‑
d片段；以pyesll质粒为模板，用引物vector
‑
f和vector
‑
r扩增，获得线性化的pyes1l载体；
10.(4)将线性化的pyes1l载体、a
‑
b和c
‑
d片段混和，导入酵母内进行同源重组，得到山羊副流感病毒3型感染性cdna克隆质粒pyes1l
‑
cpiv3。
11.在本发明中，用引物af1、af2和ar扩增a片段，包括两个pcr扩增反应；首先，以af1
和ar为引物进行第一次pcr扩增；然后以第一次pcr扩增产物为模板，以af2和ar为引物，进行第二次pcr扩增，得到a片段。
12.在本发明中，用引物df、dr1和dr2扩增d片段，包括两个pcr扩增反应；首先，以df和dr1为引物进行第一次pcr扩增；然后以第一次pcr扩增产物为模板，以df和dr2为引物，进行第二次pcr扩增，得到d片段。
13.本发明还提供上述方法得到的山羊副流感病毒3型感染性cdna克隆质粒及其在拯救山羊副流感病毒3型中的应用。
14.在本发明中，所述应用包括如下步骤：分别构建表达山羊副流感病毒3型n、p、l蛋白的辅助质粒，利用转染试剂lipofectamine
tm 2000将权利要求4所述感染性cdna克隆质粒和辅助质粒共转染293t细胞，收获细胞培养物并接种mdbk细胞，收获细胞培养物，获得拯救的感染性山羊副流感病毒3型rcpiv3。
15.在本发明中，所述辅助质粒是将通山羊副流感病毒3型n、p和l蛋白的编码基因分别克隆至pcaggs，得到pcaggs
‑
n，pcaggs
‑
p和pcaggs
‑
l三个辅助质粒。
16.优选的技术方案中，感染性cdna克隆质粒、辅助质粒pcaggs
‑
n、pcaggs
‑
p和pcaggs
‑
l的质量比为5：5：2：1。
17.相较于现有技术，本发明的有益效果是：本发明以高效同源重组系统，以pyes1l为骨架载体，利用基于酵母的同源重组技术，率先构建了山羊副流感病毒3型毒株js14
‑
2株全基因组cdna感染性克隆以及3个辅助质粒，建立了山羊副流感病毒3型反向遗传操作系统，利用该系统能够实现重组病毒的稳定高效拯救。本发明构建方法，效率高。拯救的病毒rcpiv3感染mdbk细胞后，于感染后24h
‑
48h产生细胞病变，获得的rcpiv3病毒滴度可达到108tcid
50
/ml以上，病毒增殖速度高于野生型毒株，滴度与野生毒株一致，且保持稳定。为未来山羊副流感病毒3型新型疫苗、羊用多联疫苗研制和山羊副流感病毒3型致病机理研究奠定基础。
附图说明
18.图1山羊副流感病毒3型全长cdna分段扩增策略，其中数字表示病毒基因组位置(bp)。
19.图2山羊副流感病毒3型全长cdna克隆质粒构建策略。
20.图3山羊副流感病毒3型辅助质粒构建的鉴定，其中a图：泳道1为dna marker dl2000，泳道2为bglii酶切后的pcaggs
‑
n，泳道3为bglii酶切后的pcaggs
‑
p，泳道4为dna marker 1kb plus；b图中泳道1为dna marker dl2000，泳道2为hindiii酶切后的pcaggs
‑
l，泳道3为dna marker 1kb plus。
21.图4重组病毒的mdbk细胞病变，其中a图：正常mdbk细胞，b图：接毒2天的细胞病变，c图：接毒3天的细胞病变。
22.图5重组病毒的间接免疫荧光鉴定，a图：正常细胞，b图：接毒细胞。
23.图6重组病毒的生长曲线。
具体实施方式
24.下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，应该理解的是，这些实施例仅用于
例证的目的，决不限制本发明的保护范围。
25.实施例1山羊副流感病毒3型js14
‑
2株感染性cdna克隆质粒的构建
26.1.cdv
‑
3株全基因组克隆及序列测定
27.取冻存的山羊副流感病毒3型js14
‑
2株(公开于中国专利zl 201810926226.2中，保藏号为cctcc no:v201832)细胞培养悬液200μl，根据axygen核酸提取试剂盒操作说明，提取总rna。根据cpiv3 js2013株参考序列，将病毒全基因组序列划分为9个目标片段，用软件primer premier 5.0设计了9对特异性引物(如表1)分别扩增目标片段1
‑
9，将引物送南京擎科生物科技有限公司合成。以提取的rna为模板，分别以各对特异性引物用一步法rt
‑
pcr试剂盒(北京全式金生物科技有限公司)进行rt
‑
pcr扩增。rt
‑
pcr总体积20μl，其中2
×
r
‑
mix buffer 10μl，上下游引物各0.5μl，e
‑
mix 0.4μl，rna模板2μl，无rnase水补足至20μl。扩增程序：45℃反转录30min；94℃5min；94℃30s，55
‑
60℃30s(根据不同引物对的tm值调整退火温度)，72℃2min，35个循环；72℃10min。对目的片段1
‑
9进行回收纯化，产物送南京擎科生物科技有限公司进行序列测定。根据测序结果，拼接得到病毒全基因组序列，比对发现该序列与已有毒株序列同源性为99.6％
‑
99.9％，与同源性最高的ahqj2015
‑
1株(mf693177.1)相比有15个核苷酸突变(表2)。
28.表1全基因组扩增用引物
[0029][0030]
表2js14
‑
2与ahqj2015
‑
1全基因组序列差异情况
[0031]
[0032]
2.cpiv3全基因组cdna重组质粒的构建
[0033]
利用软件分析js14
‑
2株全基因组序列的单一性酶切位点，选取适当的位置作为衔接点，将全基因组分为四个片段a、b、c、d，具体见图1。首先人工合成序列1(seq id no:1)(tagcctcgagaattcacgcgtggtacctctaggtcgacggtaccgtttaaacgggttattaattaaatcattcgcggccgcttcc)，插入pci
‑
neo质粒(购自promega)的xhoi和noti酶切位点之间，得到重组质粒pci
‑
neo
‑
1，其序列中依次包含酶切位点xhoi
‑
sali
‑
pmei
‑
paci
‑
noti。
[0034]
利用primer premier5.0设计特异性引物(如表3)分别扩增a、b、c、d四个片段，其中扩增的a片段的一端连接有锤头状核酶序列，扩增的d片段的一端连接有丁型肝炎核酶序列。
[0035]
以提取的js14
‑
2株病毒的总rna为模板，按照反转录试剂盒(北京全式金生物科技有限公司)说明书制备山羊副流感病毒3型js14
‑
2株cdna。
[0036]
扩增a片段包括两次pcr扩增。第一次pcr扩增，总体积20μl，其中2
×
pcr buffer 10μl，上下游引物(af1、ar)各0.5μl，cdna模板2μl，无rnase水补足至20μl。扩增程序：94℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃6min，35个循环；72℃10min。以第一次pcr扩增产物为模板，以af2、ar为引物，进行第二次pcr扩增，得到一端连接有锤头状核酶序列的a片段，pcr体系的构成同第一次pcr扩增，pcr程序同第一次pcr扩增。
[0037]
扩增d片段包括两次pcr扩增。第一次pcr扩增，pcr体系总体积20μl，其中2
×
pcr buffer 10μl，上下游引物(df、dr1)各0.5μl，cdna模板2μl，无rnase水补足至20μl。扩增程序：94℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃2min，35个循环；72℃10min。以第一次pcr扩增产物为模板，以df、dr2为引物，进行第二次pcr扩增，得到一端连接有丁型肝炎核酶序列的d片段，pcr体系的构成同第一次pcr扩增，pcr程序同第一次pcr扩增。
[0038]
扩增b片段时，引物为bf和br，pcr总体积20μl，其中2
×
pcr buffer 10μl，上下游引物各0.5μl，cdna模板2μl，无rnase水补足至20μl。扩增程序：94℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃2min，35个循环；72℃10min。
[0039]
扩增c片段时，引物为cf和cr，pcr总体积20μl，其中2
×
pcr buffer 10μl，上下游引物各0.5μl，cdna模板2μl，无rnase水补足至20μl。扩增程序：94℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃6min，35个循环；72℃10min。
[0040]
将一端连接有锤头状核酶序列的片段a和pci
‑
neo
‑
1分别采用xhoi和sali酶进行双酶切，然后采用t4 dna连接酶进行连接，将片段a插入pci
‑
neo
‑
1中，得到了pci
‑
a。将pci
‑
a和片段b分别采用sali和pmei酶进行双酶切，然后采用t4 dna连接酶进行连接，将片段b插入pci
‑
a中，得到了pci
‑
a
‑
b。
[0041]
将片段c、pci
‑
neo
‑
1分别用pmei和paci酶进行双酶切，然后采用t4 dna连接酶进行连接，将片段c插入pci
‑
neo
‑
1中，得到pci
‑
c。将pci
‑
c和一端连接有丁型肝炎核酶序列的片段d分别采用paci和noti进行双酶切，然后采用t4 dna连接酶进行连接，将连接有丁型肝炎核酶序列的片段d插入pci
‑
neo
‑
1中，获得pci
‑
c
‑
d。
[0042]
以pci
‑
a
‑
b为模板，用引物ab
‑
f和ab
‑
r，扩增片段a
‑
b(片段a和b相连形成的片段)。pcr总体积20μl，其中2
×
pcr buffer 10μl，上下游引物各0.5μl，模板2μl，无rnase水补足至20μl。扩增程序：94℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃6min，35个循环；72℃10min。
[0043]
以pci
‑
c
‑
d为模板，用引物cd
‑
f和cd
‑
r，扩增c
‑
d片段(片段c和d相连形成的片段)。
pcr总体积20μl，其中2
×
pcr buffer 10μl，上下游引物各0.5μl，模板2μl，无rnase水补足至20μl。扩增程序：94℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃6min，35个循环；72℃10min。
[0044]
以pyesll质粒(购自thermo fisher scientific)为模板，以引物vector
‑
f和vector
‑
r进行pcr扩增，获得线性化的pyes1l载体。
[0045]
将线性化的pyes1l载体、片段a
‑
b和片段c
‑
d混和，加入到mav203酵母感受态(购自thermo fisher scientific)中，利用醋酸锂转化法转化至酵母细胞，然后接种于色氨酸(trp)缺陷型平板(购自thermo fisher scientific)上，在30℃培养3天后，用引物cpiv3
‑
f和cpiv3
‑
r进行菌落pcr鉴定，筛选出阳性克隆(克隆策略如图2所示)。由于线性化的pyes1l载体和片段a
‑
b、片段a
‑
b和片段c
‑
d、线性化的pyes1l载体和片段c
‑
d分别存在着末端同源臂，因此，在宿主细胞酵母内，通过同源重组机制组装成携带cpiv3全长cdna的重组质粒。
[0046]
将菌落pcr筛选阳性的酵母菌落的裂解液电转化dh10b感受态细胞，通过大观霉素抗性筛选阳性重组子，增殖后通过质粒中量提取试剂盒纯化携带cpiv3全长cdna的重组质粒，命名为pyes1l
‑
cpiv3。大量提取重组质粒pyes1l
‑
cpiv3，测定浓度后分装，置
‑
20℃保存。
[0047]
表3病毒cdna克隆构建扩增引物
[0048][0049][0050]
注：表3中下划线为核酶序列，斜体为酶切位点。
[0051]
实施例2辅助质粒的构建与鉴定
[0052]
针对cpiv3中n、p和l基因的开放阅读框区域，利用primer premier5.0设计特异性引物(包含同源臂，见表4)，以重组质粒pyes1l
‑
cpiv3为模板，进行pcr扩增，获得n、p和l基因片段。回收纯化后的n、p和l基因片段，分别采用南京诺唯赞生物科技有限公司
clonexpress ii one step cloningkit，通过同源重组的方法(参照试剂盒说明书操作)克隆至pcaggs质粒的xhoi和bglii位点之间，然后将携带各基因的重组质粒分别转化dh5α大肠杆菌感受态细胞，经pcr酶切鉴定的阳性菌落克隆(图3)，进一步测序鉴定筛选出正确的重组质粒pcaggs
‑
n(携带n基因的重组质粒)，pcaggs
‑
p(携带p基因的重组质粒)和pcaggs
‑
l(携带l基因的重组质粒)。按照无内毒素质粒提取试剂盒的操作说明提取质粒，测定浓度后分装，于
‑
20℃保存。
[0053]
表4n、p、l基因扩增引物
[0054][0055]
注：表4引物中画横线的部分是酶切位点。
[0056]
实施例3山羊副流感病毒3型js14
‑
2株重组病毒的拯救与生物学特性鉴定
[0057]
1.重组病毒的拯救与扩增
[0058]
于24孔板中按照5
×
104个细胞/孔接种293t细胞，待细胞生长至90％汇合度时开始转染，每孔中的质粒用量为：感染性cdna克隆质粒(重组质粒pyes1l
‑
cpiv3)0.5μg，辅助质粒pcaggs
‑
n 0.5μg，pcaggs
‑
p 0.2μg和pcaggs
‑
l 0.1μg，转染试剂(lipofectamine
tm 2000)1.5μl，具体转染方法按照lipofectamine
tm
2000说明书进行操作。
[0059]
将转染后的细胞在37℃、5％co2条件下培养4
‑
5d，收获细胞悬液，冻融三次，2000rpm离心5min，取上清接种mdbk细胞，观察细胞病变。结果：接种后第二天，mdbk细胞即出现山羊副流感病毒3型典型的细胞病变：出现合胞体、融合、脱落(图4)。收获细胞培养物，得到第一代拯救病毒rcpiv3。将拯救病毒rcpiv3连续传代，每一代培养物均置
‑
70℃保存。
[0060]
2.重组病毒的鉴定
[0061]
2.1间接免疫荧光检测
[0062]
将收获的拯救病毒rcpiv3接种至mdbk细胞，培养72h。弃去培养液，使用免疫染色固定液固定细胞15min；再加入免疫染色封闭液37℃通透封闭30min；加入cpiv3特异单克隆抗体，37℃孵育1h；pbs洗涤3次；加入fitc标记羊抗小鼠igg荧光二抗，37℃孵育1h，pbs洗涤3次。在荧光显微镜下观察可见感染病毒的细胞呈现特异的绿色荧光，而未接毒的对照细胞无荧光(图5)。说明重组病毒拯救成功，具有感染性。
[0063]
2.2rt
‑
pcr鉴定
[0064]
分别提取重组病毒(拯救病毒rcpiv3)和亲本病毒(山羊副流感病毒3型js14
‑
2株)rna，用一步法rt
‑
pcr试剂盒(北京全式金生物科技有限公司)，使用引物cf和cr进行rt
‑
pcr扩增，rt
‑
pcr总体积20μl，其中2
×
r
‑
mix buffer 10μl，上下游引物各0.5μl，e
‑
mix 0.4μl，rna模板2μl，无rnase水补足至20μl。扩增程序：45℃反转录30min；94℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃2min，35个循环；72℃10min。
[0065]
1％琼脂糖凝胶电泳后回收片段，送南京擎科生物科技有限公司测序，比较序列是否与设计的一致。结果：扩增的序列与病毒cdna质粒序列一致。
[0066]
3.生物学特性鉴定
[0067]
3.1tcid
50
测定
[0068]
用细胞维持液(含2％胎牛血清的dmem培养基)将第三代重组病毒(拯救病毒rcpiv3)作10倍梯度稀释。然后将各稀释度的病毒液分别接种于长满单层mdbk细胞的96孔细胞培养板中，每个稀释度病毒液接种4个孔，每孔接种100μl。同时设定不接毒的阴性对照。37℃培养5天，观察细胞病变并按照reed
‑
muench方法计算tcid
50
。结果表明：第三代重组病毒滴度可达108tcid
50
/ml以上。
[0069]
3.2生长曲线测定
[0070]
在长满单层mdbk细胞的24孔细胞培养板中，按感染复数(moi＝1)接种重组病毒(拯救病毒rcpiv3)和亲本病毒(山羊副流感病毒3型js14
‑
2株)，37℃培养。于感染后24h、48h、72h、96h和120h，分别取细胞培养上清，按照标题3.1中方法测定病毒的tcid
50
，绘制病毒生长曲线。结果表明重组病毒和亲本病毒滴度在24
‑
72h之间处于增长期，72
‑
120h之间达到稳定，重组病毒在24
‑
48h滴度高于亲本病毒(0.5log
10
)，说明重组病毒增殖速度高于亲本病毒(图6)。
[0071]
3.3稳定性测定
[0072]
按照标题3.1中方法在mdbk细胞上分别测定不同代次(第三代、第五代、第八代、第十代)重组病毒的滴度，结果表明各代次重组病毒滴度分别为108tcid
50
/ml、10
8.5
tcid
50
/ml、10
8.15
tcid
50
/ml和10
8.25
tcid
50
/ml，病毒生长滴度均可达108tcid
50
/ml以上且保持稳定。