一种利用斑马鱼评价高浓度葡萄糖发育毒性的方法与流程

1.本发明涉及毒理学检测技术领域，尤其涉及一种利用斑马鱼评价高浓度葡萄糖发育毒性的方法。


背景技术：

2.随着物质生活的不断丰富，妊娠合并糖尿病的发病率明显上升，危害孕妇和胎儿的健康，妊娠期糖尿病导致妊高症、早产、新生儿窒息、巨大儿的发生率明显升高。高浓度葡萄糖具有神经毒性作用，造成过多的氧自由基以及糖基化终末产物的产生，这些毒副作用对母体的健康及胎儿的早期发育都会造成巨大损害，甚至直接造成幼体的发育畸形或死亡。目前对这些高糖毒副作用的病理机制研究多采用年幼的小鼠、大鼠、兔或体外培养细胞来研究，该方法虽然得到广泛使用，但成本高、时间长、操作复杂，现象不易观察。
3.而斑马鱼一种原产于南亚地区的小型热带淡水鱼，由于其具有易饲养、繁殖力强，发育快，受精卵透明易观察等特点，现已成为在全世界范围内被广泛应用的脊椎实验动物。斑马鱼作为低等脊椎动物的代表，与人类基因同源性达87％，其在包括心血管系统、神经系统在内的多个重要组织器官在形态结构、生理功能及病理反应上与人类相仿，其在在发育生物学、化合物毒性评价和人类疾病模型研究等领域迅速得到广泛应用。


技术实现要素：

4.因此，基于以上背景，本发明提供一种操作简便、评价周期短，可高效、直观地利用斑马鱼评价高浓度葡萄糖发育毒性的方法。
5.本发明提供的技术方案为：
6.一种利用斑马鱼评价高浓度葡萄糖发育毒性的方法，其包括如下步骤：
7.s1:利用胚胎培养液配制成质量浓度在0.5％至3.5％的葡萄糖溶液；
8.s2：利用至少3对雌雄野生型斑马鱼(ab型)交配并产卵，收集并挑选受精卵混匀在一起；
9.s3：将葡萄糖溶液及胚胎培养液分别放入6孔板中，每孔放入30枚受精卵，正常条件下培养；放入胚胎培养液中的受精卵为对照组，放入葡萄糖溶液中的受精卵为实验组；
10.s4：培养过程中每隔12个小时更换一次培养液，实验组继续更换葡萄糖溶液，对照组继续更换胚胎培养液；第五天开始每天更换培养液时投喂斑马鱼幼鱼饲料，并对斑马鱼生长形态进行观察，对斑马鱼幼鱼脊柱畸形率和死亡率进行统计；
11.s5：对脊柱弯曲的斑马鱼幼鱼采用活性氧荧光探针进行染色，并将染色完成的斑马鱼幼鱼用pbs缓冲液冲洗干净，放在载玻片上在荧光显微镜下观察染色情况；用吖啶橙染色液对脊柱弯曲的斑马鱼幼鱼进行染色后，用ddh2o将幼鱼冲洗干净，在荧光显微镜下观察幼鱼染色情况。
12.进一步地，其包括如下步骤：
13.s1:利用胚胎培养液分别配制成质量浓度为0.5％、1.0％、1.5％、2.0％、2.5％、
3％、3.5％的葡萄糖溶液；
14.s2：利用至少3对雌雄野生型斑马鱼(ab型)交配并产卵，收集并挑选受精卵混匀在一起；
15.s3：将配制的7种浓度的葡萄糖溶液及胚胎培养液分别放入6孔板中，每孔加10ml，每孔放入30枚受精卵，每三孔为一组平行重复，正常条件下培养；放入胚胎培养液中的受精卵为对照组，放入葡萄糖溶液中的受精卵为实验组；
16.s4：培养过程中每隔12个小时更换一次培养液，实验组继续更换葡萄糖溶液，对照组继续更换胚胎培养液；第五天开始每天更换培养液时投喂斑马鱼幼鱼饲料，并对斑马鱼生长形态进行观察，对斑马鱼幼鱼脊柱畸形率和死亡率进行统计；
17.s5：对脊柱弯曲的斑马鱼幼鱼采用活性氧荧光探针进行染色，并将染色完成的斑马鱼幼鱼用pbs缓冲液冲洗干净，放在载玻片上在荧光显微镜下观察染色情况；用吖啶橙染色液对脊柱弯曲的斑马鱼幼鱼进行染色后，用ddh2o将幼鱼冲洗干净，在荧光显微镜下观察幼鱼染色情况。
18.进一步地，所述胚胎培养液的组成为：每升ddh2o中含有5g的kcl、10g的ca
2
、2.5g的nahco3及26ml甲基蓝
19.进一步地，步骤s3的正常培养条件为：温度控制在28.5℃；光周期为：光照/黑暗14/10小时。
20.进一步地，步骤s5中采用活性氧荧光探针染色的具体步骤为：对脊柱弯曲的斑马鱼先用10μm/l的活性氧荧光探针在37℃条件下染色30min,将染色完成的斑马鱼幼鱼用pbs缓冲液冲洗干净。
21.进一步地，步骤s5中采用吖啶橙染色液染色的具体步骤为：用浓度为400μg/l的吖啶橙染色液对脊柱弯曲的斑马鱼幼鱼在25℃温度下进行染色30min,用ddh2o将幼鱼冲洗干净。
22.采取上述技术方案，具有的有益效果如下：
23.本发明利用生长周期短的斑马鱼用于评价高浓度葡萄糖的发育毒性，在10天内即可完成评价，周期短，且操作简单方便，快速高效，可极大的降低成本；并且从畸形率、成活率、幼鱼的活性氧产生量及细胞凋亡程度等多方面考察高浓度葡萄糖的发育毒性，准确度高，确保评价结果；本发明不仅能对高浓度葡萄糖对斑马鱼的发育毒性进行评价，且可为高糖对其他的生物体特别是人的发育毒性的病理机制研究提供参考。
附图说明
24.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
25.图1为本发明实施例中的斑马鱼幼鱼脊柱弯曲形态。
26.图2为本发明实施例的不同浓度的葡萄糖培育斑马鱼第8天的幼鱼的脊柱畸形率及死亡率统计；
27.图3为本发明实施例经ros荧光探针染色后的斑马鱼荧光图片；
28.图4为本发明实施例经吖啶橙染色后斑马鱼荧光图片。
具体实施方式
29.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
30.下面结合附图对本发明做进一步说明。
31.实施例1：一种利用斑马鱼评价高浓度葡萄糖发育毒性的方法，其具体操作步骤如下：
32.s1:利用胚胎培养液分别配制成质量浓度为0.5％、1.0％、1.5％、2.0％、2.5％、3％、3.5％的葡萄糖溶液；
33.s2：利用至少3对雌雄野生型斑马鱼(ab型)交配并产卵，收集并挑选受精卵混匀在一起；
34.s3：将配制的7种浓度的葡萄糖溶液及胚胎培养液分别放入6孔板中，每孔加10ml，每孔放入30枚受精卵，每三孔为一组平行重复，正常条件下培养；放入胚胎培养液中的受精卵为对照组，放入葡萄糖溶液中的受精卵为实验组；正常培养条件为：温度控制在28.5℃；光周期为：光照/黑暗14/10小时。
35.s4：培养过程中每隔12个小时更换一次培养液，实验组继续更换葡萄糖溶液，对照组继续更换胚胎培养液；第五天开始每天更换培养液时投喂斑马鱼幼鱼饲料，并对斑马鱼生长形态进行观察，对斑马鱼幼鱼脊柱畸形率和死亡率进行统计；第八天的对斑马鱼幼鱼脊柱畸形率和死亡率的统计结果见图2。结合附图1为正常生长条件下斑马鱼形态和葡萄糖溶液处理条件下斑马鱼脊柱弯曲形态，可以看出随着葡萄糖溶液的糖浓度的升高，斑马鱼幼鱼的脊柱畸形率及死亡率都显著升高。
36.s5：对脊柱弯曲的斑马鱼幼鱼采用活性氧荧光探针进行染色，并将染色完成的斑马鱼幼鱼用pbs缓冲液冲洗干净，放在载玻片上在荧光显微镜下观察染色情况(见附图3)；用吖啶橙染色液对脊柱弯曲的斑马鱼幼鱼进行染色后，用ddh2o将幼鱼冲洗干净，在荧光显微镜下观察幼鱼染色情况(见附图4)。
37.步骤s5中采用活性氧荧光探针染色的具体步骤为：对脊柱弯曲的斑马鱼先用10μm/l的活性氧荧光探针在37℃条件下染色30min,将染色完成的斑马鱼幼鱼用pbs缓冲液冲洗干净。
38.步骤s5中采用吖啶橙染色液染色的具体步骤为：用浓度为400μg/l的吖啶橙染色液对脊柱弯曲的斑马鱼幼鱼在25℃温度下进行染色30min,用ddh2o将幼鱼冲洗干净。
39.附图3的处理组(即实验组)为持续暴露在3％葡萄糖溶液中6天的斑马鱼幼鱼经ros荧光探针染色后荧光图片；正常组为正常生长条件下斑马鱼幼鱼经ros荧光探针染色后荧光图片。从图3的对照组和处理组的荧光照片可以看出，处理组的照片中的荧光强度明显比对照组强，而荧光强度越强，亮度越强，则意味着ros积累越多。
40.附图4的处理组(即实验组)为持续暴露在3％葡萄糖溶液中6天的斑马鱼幼鱼经吖啶橙染色后的荧光图片；正常组为正常生长条件下斑马鱼幼鱼经吖啶橙染色后荧光图片。
吖啶橙可以将早期凋亡细胞染色，亮度越强表明细胞凋亡越严重，高糖的发育毒性也越强，从图4可以明显看出经高浓度的葡萄糖溶液培育的斑马鱼幼鱼的具有亮度的面积及其强度均明显高于对照组的，说明高浓度葡萄糖培育的斑马鱼幼鱼的细胞凋亡程度明显远高于对照组。
41.本发明利用斑马鱼来对高浓度葡萄糖的发育毒性进行评价，在评价过程中，经高浓度培养液培育的斑马鱼幼鱼的脊柱畸形为明显特征，且随着葡萄糖浓度越高，其脊柱畸形也就越高，说明葡萄糖浓度对于斑马鱼的脊柱的发育影响相关性是非常大的，而斑马鱼基因组序列与人类基因组高度相似，包括心血管系统、神经系统在内的多个重要组织器官在形态结构、生理功能及病理反应上与人类相仿，因此本发明的评价的结果与对葡萄糖浓度对于人类发育毒性具有极大的借鉴意义。
42.以上对本发明及其实施方式进行了描述，这种描述没有限制性，附图中所示的也只是本发明的实施方式之一，实际的结构并不局限于此。总而言之如果本领域的普通技术人员受其启示，在不脱离本发明创造宗旨的情况下，不经创造性的设计出与该技术方案相似的结构方式及实施例，均应属于本发明的保护范围。