溶藻弧菌噬菌体及其应用的制作方法

1.本发明涉及微生物应用技术领域，具体涉及一种溶藻弧菌噬菌体vb_vals_r12z及其应用。


背景技术：

2.随着水产品需求的上升，我国水产养殖行业规模逐年扩大，养殖方式也逐步向高密度集约化养殖转型，然而传染性病害会对高密度养殖造成更大的威胁，病害爆发会使养殖产品呈规模化减产，对养殖户造成极大的经济损失。其中，由弧菌（vibrio）引起的弧菌病（vibriosis）是水产养殖业中导致鱼、虾、贝类大量死亡的最常见疾病之一，而溶藻弧菌（vibrio alginolyticus）又是弧菌中较为常见的一种致病菌，溶藻弧菌感染会使水产动物消化道、皮肤等器官发生病变，最终导致其死亡。食用感染溶藻弧菌未煮熟的水产品，会对人产生感染，使人体产生腹泻、眩晕等症状。当前，投放抗生素是最常用且较为有效的防治细菌类水产病害的手段，但由于抗生素治疗存在药物残留、耐药性增加以及新抗生素研发周期漫长、研发成本高等问题，不久的将来水产养殖业可能面临无抗生素可用的窘境，因此寻找高效、环保的替代防治方法迫在眉睫。
3.作为应对细菌性水产病害的方法之一，噬菌体防治水产病害法近年来备受关注。噬菌体防治主要是利用烈性噬菌体对细菌的裂解作用杀灭致病细菌，以达到治疗和防御水产动物细菌性病害的效果。噬菌体是自然界中丰度和多样性最高的有机体，具有专一性程度高、自我增殖能力强的特点。一种噬菌体通常只会侵染裂解特定的一种或一类宿主菌，不会破坏水产品体内或水产环境中其他菌群结构。烈性噬菌体侵入宿主后迅速完成大量的自我增殖复制，直至宿主裂解，再去侵染裂解其他宿主菌，可以迅速有效地杀灭致病菌。所以相对而言，噬菌体防治法不仅对细菌有良好杀灭作用而且对环境友好，所以该方法完全可以作为防控细菌类病害乃至耐药菌株抗生素防治的替代品。因此，为了开发能够有效治疗溶藻弧菌类水产病害的噬菌体防治方法，首先必须筛选出能够针对溶藻弧菌且抗菌能力强或在抗菌效果其他层面具有相对优势的噬菌体方可加以利用。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种安全且有效、可用于防治溶藻弧菌感染性水产病害的噬菌体，以应对目前抗生素在防治溶藻弧菌病害面临的耐药性问题。
5.针对上述目的，本发明采用如下技术方案实现：本发明的第一个目的是提供一种溶藻弧菌噬菌体vb_vals_r12z，其保藏编号为：gdmcc no: 61738
‑
b1。
6.本发明从福建厦门第八市场废水中筛选分离得到一株新的溶藻弧菌烈性噬菌体，通过形态观察、全基因测序和系统发育分析确定了该噬菌体的形态及分类地位，并将其命名为溶藻弧菌噬菌体vibrio phage vb_vals_r12z，于2021年8月4日保藏于广东省微生物菌种保藏中心（gdmcc），保藏编号为gdmcc no：61738
‑
b1，保藏地址为：广州市先烈中路100
号大院59号楼5楼，邮编：510070。
7.进一步地，透射电子显微镜观察显示，溶藻弧菌噬菌体vb_vals_r12z为头尾形病毒，头部长100 nm、宽52 nm，尾部长145 nm，根据国际病毒分类委员会（ictv）最新病毒分类系统的标准，该噬菌体属于长尾噬菌体。
8.进一步地，所述溶藻弧菌噬菌体vb_vals_r12z对溶藻弧菌atcc 17749
t
（vibrio alginolyticus atcc 17749
t
）、jl2674（vibrio alginolyticus jl2674）、bva2（vibrio alginolyticus bva2）以及欧文斯氏弧菌3186（vibrioowensii 3186）都有裂解作用。
9.进一步地，将溶藻弧菌噬菌体vb_vals_r12z基因组分别在致病菌毒力因子数据库（vfdb）以及综合耐药性数据库（card）中进行对比分析，未检测到毒力基因与抗药性基因，表明溶藻弧菌噬菌体vb_vals_r12z侵染不会导致宿主菌毒力增强、不会造成养殖环境与周围水体环境的抗药性污染。
10.本发明的第二个目的是提供一种噬菌体组合物，其包含有溶藻弧菌噬菌体vb_vals_r12z。
11.本发明的第三个目的是提供上述的溶藻弧菌噬菌体vb_vals_r12z或噬菌体组合物在杀灭和/或预防弧菌属微生物中的应用。
12.本发明的第四个目的是提供上述的溶藻弧菌噬菌体vb_vals_r12z或噬菌体组合物在制备抗弧菌属微生物的药物中的应用。
13.本发明的第五个目的是提供上述的溶藻弧菌噬菌体vb_vals_r12z或噬菌体组合物在制备抗弧菌属微生物的水产饲料或饲料添加剂中的应用。
14.进一步地，所述的弧菌属微生物为vibrio alginolyticus atcc 17749
t
、vibrio alginolyticus jl2674、vibrio alginolyticus bva2、vibrioowensii 3186中的一种或多种。
15.本发明的第六个目的是提供一种抗弧菌属微生物的药物，其含有上述的溶藻弧菌噬菌体vb_vals_r12z或噬菌体组合物。
16.本发明的第七个目的是提供一种抗弧菌属微生物的水产饲料或饲料添加剂，其含有上述的溶藻弧菌噬菌体vb_vals_r12z或噬菌体组合物。
17.本发明的第八个目的是提供一种防治溶藻弧菌有害感染的方法，该方法是利用上述的溶藻弧菌噬菌体vb_vals_r12z或噬菌体组合物对溶藻弧菌的裂解作用杀灭溶藻弧菌。
18.本发明具备的有益效果：本发明中的溶藻弧菌噬菌体vb_vals_r12z为一株裂解性长尾噬菌体，其裂解谱广，可裂解多种溶藻弧菌及欧文斯氏弧菌3186，能够有效地杀灭、防治相关的弧菌病害，同时在该噬菌体中未检测到毒力因子基因和耐药性基因，无毒副作用、安全性高、环境友好，表明溶藻弧菌噬菌体vb_vals_r12z完全可以作为水产溶藻弧菌病害杀菌剂。
19.本发明的溶藻弧菌噬菌体vibrio phage vb_vals_r12z于 2021年8月4日保藏于广东省微生物菌种保藏中心（gdmcc），地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼，邮编：510070，保藏编号为gdmcc no：61738
‑
b1。
附图说明
20.图1为溶藻弧菌噬菌体vb_vals_r12z的噬菌斑形态。
21.图2为溶藻弧菌噬菌体vb_vals_r12z的电镜照片。
22.图3溶藻弧菌噬菌体vb_vals_r12z与相近典型噬菌体株的系统进化树。
23.图4为溶藻弧菌噬菌体vb_vals_r12z的一步生长曲线。
具体实施方式
24.以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。所用的方法及技术如无特别说明均为常规的方法及技术。
25.实施例1：溶藻弧菌噬菌体的分离与纯化采自福建厦门第八市场废水水样样品，经0.22 μm滤膜过滤后冷藏状态下（储藏于4℃冰箱中）带回实验室。
26.为增加噬菌体丰度，提高噬菌体分离成功率，在进行分离实验前，对样品中可能存在的噬菌体先进行扩大培养，具体如下：向10 ml对数生长初期的宿主菌（溶藻弧菌atcc 17749
t
）培养液中加入2 ml经0.22 μm针筒过滤器再次过滤的水样，放入摇床继续培养24 h后，回收混合培养液，经0.22 μm针筒过滤器去除体系中的细胞与杂质，得到扩培后的混合噬菌体液放入4℃冰箱保存。
27.取1ml前述混合噬菌体液，用sm缓冲液（按1 l超纯水中加入5.844 g nacl、2.4647 g mgso4
·
7h2o、6.057 g tris、0.100 g gelatin的比例配制sm缓冲液，配制完毕后将其ph调整到7.50，100℃高压灭菌30 min，冷却后使用）进行梯度稀释（稀释梯度为
×
100、
×
10
‑2、
×
10
‑4、
×
10
‑6），保证样品中的噬菌体数量适合。在已稀释的各梯度噬菌体液中，各加入1 ml处于对数生长初期的宿主菌培养液并摇匀，常温、黑暗条件下静止15 min，使噬菌体吸附感染宿主菌。
28.吸附结束后，向混合样品中加入5~6 ml融化的2216e半固体培养基（按1 l超纯水加入30 g的2216e液体培养基粉末（海博生物，青岛），煮沸1 min以溶解粉末，冷却后经0.45 μm mce水系微孔滤膜（津腾实验设备有限公司，天津）过滤，滤液即为未灭菌的液体培养基，备用，向其加入0.5%终浓度（wt/vol）琼脂粉末，121℃高压蒸汽灭菌15 min，冷却备用，此即为2216e半固体培养基，使用前再次重新加热融化，使用过程中控制温度在50℃），快速混匀后倒在准备好的单层平板2216e固体培养基上（向未灭菌的液体培养基中加入1.5%终浓度（wt/vol）琼脂粉末，121℃高压蒸汽灭菌15 min，在培养基降温凝固前倒至直径9 cm的培养皿（biosharp，中国）水平放置，冷却凝固备用，即为固体培养基）。待上层平板冷却凝固后，倒置于30℃恒温培养箱培养，3~4 h后即可定时观察是否出现噬菌斑。
29.双层平板上出现噬菌斑后，仔细观察并按形态大小分类记录噬菌斑，用灭菌的剪口枪头挑取单个噬菌斑，放于1 ml的sm缓冲液中。噬菌斑于4℃避光保存过夜，使噬菌体充分溶解于sm缓冲液中。所得噬菌体浸出液进行梯度稀释（稀释度为
×
10
‑2、
×
10
‑4、
×
10
‑6、
×
10
‑8），重复双层平板实验，纯化挑取获得的单个噬菌斑（图1），获得单类纯化噬菌体。
30.实施例2 ：溶藻弧菌噬菌体的扩培与富集取1 ml纯噬菌体液加入到10 ml对数生长初期的宿主菌（溶藻弧菌atcc 17749
t
）培养液中，30℃摇床中培养。细菌培养液出现明显裂解现象后（即培养液恢复透明且有细胞裂解残留的絮状物），回收培养液并用0.22 μm针筒过滤器过滤，保留滤液。将上述滤液加入对数生长初期的50 ml宿主菌（溶藻弧菌atcc 17749
t
）培养液中，继续培养至出现明显裂解
现象。重复过滤过程，滤液加入200 ml对数生长初期的宿主菌（溶藻弧菌atcc 17749
t
）培养液中继续培养。按此方法进一步将培养体系扩大至1 l。
31.1 l培养体系出现明显裂解现象时，加入dnase i和rnase a（takara，日本）至终浓度为1g/l，混匀后室温消化30~60 min，以降解体系中游离的宿主dna和rna。加入nacl至终浓度为1 mol/l，充分溶解后置于4℃（或冰浴）1 h，使噬菌体从细胞或碎片上脱落至液体中。离心（5000 rpm, 4℃, 5 min），取上清液经0.22 μm过滤，除去体系中的细胞和部分碎片，得到1 l噬菌体液。
32.向上述噬菌体液中，加入10%（wt/vol）的peg8000 （生工生物，上海），混匀使peg8000完全溶解，4℃下避光处理1~3 d。使peg与生物大分子充分结合聚集，形成聚合物沉降。沉淀完成的样品离心（12000
×
g, 4℃, 1 h）后弃上清，残余的沉淀物即为噬菌体沉淀。向其中加入sm缓冲液重悬沉淀，使噬菌体从peg沉淀中重新溶于sm缓冲液，转移至15 ml离心管。4℃避光放置12 h以上，使噬菌体充分重悬进于sm缓冲液。若重悬后的样品杂质较多，可加入等体积氯仿（用以除去脂类、细胞碎片以及其他杂质），轻微摇晃使两种液体充分接触混匀后，低速离心（5000
×
g, 4℃, 5 min）分相，取上清，得到噬菌体浓缩液。
33.将cscl粉末溶解至sm缓冲液中，调整溶液密度为1.65 g/ml、1.5 g/ml、1.4 g/ml、1.3 g/ml梯度溶液。向离心管中缓慢地依次加入密度梯度溶液6 ml，在密度梯度溶液之上加入全部噬菌体浓缩液，用sm缓冲液使离心管注满并配重。在200000
×
g、4℃条件下进行24 h的密度梯度离心。离心结束后，可观察到蓝色或白色的噬菌体条带即为噬菌体纯颗粒，小心取出条带于离心管中。取出的噬菌体条带至30 kda 超滤管中，离心（5000
×
g, 4℃, 5 min）透析，并加入sm缓冲液冲洗，以去除cscl。完成后将噬菌体溶液转移至1.5 ml离心管中，获得高浓度富集的噬菌体溶液样品，于4℃避光保存。
34.实施例3：溶藻弧菌噬菌体的形态观察与鉴定取20 μl浓缩后的噬菌体滴至200目覆有碳膜的铜网上，黑暗吸附10~30 min后，用1%的磷钨酸负染色约20 min，干燥30 min以上，使用jem 2100型透射电镜，在120 kv电压下对样品进行观察，图像使用gatan inc ccd图像传输系统进行采集。
35.如图2所示，溶藻弧菌噬菌体头部长度为100 nm、宽度为52 nm，尾部长145 nm，可弯曲，根据国际病毒分类委员会（ictv）最新病毒分类系统的标准，该噬菌体属于长尾噬菌体。结合噬菌体的核苷酸序列表示的基因组（如seq id no.1所示）以及图3所示其在系统发育树中的位置，将其命名为溶藻弧菌噬菌体vibrio phage vb_vals_r12z（于2021年8月4日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为gdmcc no：61738
‑
b1，保藏地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070）。
36.实施例4：溶藻弧菌噬菌体vb_vals_r12z的氯仿敏感性检测取0 μl、20 μl、200 μl氯仿分别与纯化后不同丰度的噬菌体vb_vals_r12z溶液混合，调整噬菌体丰度为103、105、107、10
9 pfu/ml，混合后振荡30 s，然后于25℃静置30 min。经低速离心（5000
×
g, 45 min）后分相后，小心取出10 μl表层上清液，滴于事先准备好的宿主菌（溶藻弧菌atcc 17749
t
）双层平板上，于30℃培养箱中静置培养，实验设置三个平行样，同时用sm缓冲液代替噬菌体液作为阴性对照，定时观察是否有噬菌斑出现。溶藻弧菌噬菌体vb_vals_r12z的氯仿敏感性检测结果见表1，氯仿处理后的噬菌体依然出现明显的噬菌斑，表明噬菌体对氯仿不敏感，噬菌体无脂质结构。
37.表1溶藻弧菌噬菌体vb_vals_r12z对氯仿敏感性检测结果注：
ꢀ“
”表示能够侵染出现噬菌斑，
“‑”
表示不能侵染未出现噬菌斑。
38.实施例5：溶藻弧菌噬菌体的一步生长曲线用sm缓冲液将纯溶藻弧菌噬菌体vb_vals_r12z的浓度调整到2
×
10
6 pfu/ml，用ro液体培养基（1 l经30 kda过滤后的海水中加1 g酵母提取物、1 g蛋白胨和1 g乙酸钠，ph调整至7.4~7.8，110℃高压蒸汽灭菌30 min后冷却备用，即为ro液体培养基）将宿主菌（溶藻弧菌atcc 17749
t
）培养至od
600
=0.2。将1000 μl宿主菌液与100 μl噬菌体样品混合后，黑暗静置5 min使噬菌体浸染细菌，离心（4 min, 8000
ꢀ×
g, 4℃）后除去1 ml上清液，然后加入1 ml的ro液体培养基重悬沉淀。这个步骤重复两次，以去除游离的噬菌体，耗时20 min。第二次重悬后，立即将1 ml混合物加入100 ml的ro培养基中摇匀，摇床培养（30℃, 160 rpm），设置3个平行样，每10 min采集1次噬菌体样品，用双层平板法测定噬菌体丰度。
39.如图4所示，溶藻弧菌噬菌体vb_vals_r12z潜伏期为10 min，裂解量为200 pfu/cell，表明该噬菌体为烈性噬菌体，且潜伏期短、裂解量大。
40.实施例6：溶藻弧菌噬菌体的宿主范围检测选用了弧菌属多个常见种的海洋浮游细菌和水产动物病原菌（表2），包括v. alginolyticus（3 株）、v. parahemolyticus（7 株）、v. owensii（4 株）、v. campbellii（2 株）、v.harveyi（2 株）、v. chagasii、v. cholerae、v.fortis、v. inhibens、v. variabilis。用2216e液体培养基将待测弧菌培养至对数生长初期，与融化的半固体培养基混合制备双层平板；将10 μl无菌的高浓度（10
8 pfu/ml）溶藻弧菌噬菌体vb_vals_r12z液滴于凝固的双层平板上，于30℃培养箱中静置培养；定时观察是否有噬菌斑出现。实验设置三个平行样，同时以溶藻弧菌atcc 17749
t
代替被试菌株作为阳性对照，用sm缓冲液代替噬菌体液作为阴性对照。
41.如表2所示，溶藻弧菌噬菌体vb_vals_r12z宿主范围较小，可裂解所述23种目标宿主菌种中的4株宿主菌株，分别是v. algynolyticus atcc 17749
t
、v. algynolyticus jl2674、v. algynolyticus bva2、v. owensii 3186。
42.表2溶藻弧菌噬菌体vb_vals_r12z宿主范围结果
注：
ꢀ“
”表示能够侵染，
“‑”
表示不能侵染； v. alginolyticus atcc 17749
t 为分离实验所用的宿主菌株实施例7：溶藻弧菌噬菌体的基因组分析首先提取dna，采用酚
‑
氯仿抽提法，具体步骤如下：向溶藻弧菌噬菌体vb_vals_r12z悬液中，分别添加1.5 μl的100 mg/ml蛋白酶k溶液，100 μl的10%（wt/vol）sds溶液，10 μl （0.5 mol/l, ph=8.0）的edta溶液，混匀后置于55℃恒温水浴中进行消化3 h。
43.向消化后的噬菌体悬液中，添加等体积的苯酚
‑
氯仿
‑
异戊醇（25:24:l，体积比）混
合液，混匀后离心（12000
ꢀ×
g, 4℃, 5 min），把上层水相转移到新的离心管中；这一步操作需重复两次。
44.向收集的上层水相溶液中，添加等体积的氯仿
‑
异戊醇（24:1，体积比）混合液，充分震荡30 s，离心（12000
ꢀ×
g, 4℃, 5 min）收集上层水相溶液。与等体积异丙醇液体进行混合，混匀，
‑
20℃静置l h，再次进行离心（12000
×
g, 4℃, 5 min），收集离心下来的噬菌体核酸沉淀，用事先预冷的70%乙醇溶液冲洗两次，风干。
45.将该核酸沉淀溶解于100 μl的te缓冲液中（10 mmol/l tris
‑
hci, 1 mmol/ledta, ph=8.0），置于
‑
20℃保存，备用。
46.噬菌体vb_vals_r12z全基因组使用illumina hiseq4000平台测序，对端读取大小为150 bp。原始数据用trimmomatic v0.32整理，并用velvet v1.2.03软件组装噬菌体基因组。
47.在致病菌毒力因子数据库（vfdb）中进行噬菌体的毒力基因检测，和在综合耐药性数据库（card）中进行抗药性基因检测。
48.溶藻弧菌噬菌体vb_vals_r12zr12z的dsdna呈环状排列，基因组大小为32827 bp（其核苷酸序列如seq id no.1所示），且在该噬菌体基因中未发现毒力基因和抗药性基因。
49.以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。