一种果上叶DNA的提取方法与流程

一种果上叶dna的提取方法
技术领域
1.本发明属于植物dna提取的技术领域，具体涉及一种果上叶dna的提取方法。


背景技术：

2.果上叶为《贵州省中药材、民族药材质量标准》(2003版)收载品种，来源于兰科植物云南石仙桃pholidota yunnanensis rolfe的干燥根状茎和假鳞茎，具有养阴清肺，化痰止咳，行气止痛之功效，用于肺结核咳嗽、咯血，慢性气管炎，慢性咽炎，疝气疼痛，疮疡肿痛等症。
3.目前从收集的果上叶野生资源来看，其具有复杂的多样性，仅从形态鉴定来说，难以对其准确鉴定，因此，采用生物学鉴定能够提高鉴定的准确性，而现有的dna提取方法，所得的dna质量不优，难以满足后续鉴定。


技术实现要素：

4.本发明针对现有技术的不足，提出了一种果上叶dna的提取方法。
5.具体是通过以下技术方案来实现的：
6.一种果上叶dna的提取方法，包括如下步骤：
7.(1)按照1：(1.3
‑
1.8)的料液质量比将果上叶置于聚丙烯酰胺溶液中搅拌10
‑
20min，取出冲洗1
‑
2次后，表面喷洒果上叶质量0.1
‑
0.5％的非离子表面活性剂溶液，再经液氮速冻后，研磨成粉末；
8.(2)将果上叶粉末倒入冷的ep管内，并加入预热至水浴温度的dna提取溶液，摇匀后水浴30
‑
60min，在水浴期间来回颠倒3
‑
5次；
9.(3)取出ep管冷却至室温后，加入抽提溶液充分颠倒混匀，12000
×
g离心5min，取上清液a；所述抽提溶液与dna提取溶液的体积比为1:1；
10.(4)将上清液a转入新ep管中，加入氯仿/异戊醇混合物充分颠倒混匀，12000
×
g离心5min，取上清液b；所述氯仿/异戊醇混合物与上清液a的体积比为1:1；
11.(5)取上清液b转移到新离心管中，加入0.8
‑
1倍体积的预冷无水乙醇充分颠倒混匀，再静置于
‑
20℃下10
‑
20min，再12000
×
g离心10min，使dna充分析出得到dna沉淀；
12.(6)水洗dna沉淀1
‑
2次。
13.所述聚丙烯酰胺溶液的体积浓度为10
‑
30％。
14.所述非离子表面活性剂溶液的体积浓度为40
‑
50％。
15.所述非离子表面活性剂选吐温20、吐温40、吐温60、吐温80、司盘
‑
20、司盘
‑
80中任一种。
16.所述dna提取溶液为2
‑
3％ctab，0.08％
‑
0.1％(v/v)β
‑
巯基乙醇，0.01％
‑
0.04％阴离子表面活性剂，1.1
‑
1.3mol/lnacl。
17.所述阴离子表面活性剂为十二烷基苯磺酸钠。
18.所述抽提溶液为苯酚:氯仿:异戊醇的体积比为25:24:1的混合物。
19.所述水浴温度为55
‑
60℃。
20.所述氯仿/异戊醇混合物为按体积比为氯仿:异戊醇＝24:1的混合物。
21.所述预冷无水乙醇的温度为5
‑
10℃。
22.有益效果：
23.本发明方法具有dna提取率高、杂质少的特点，符合后续dna分子学鉴定的要求。
24.本发明根据果上叶化学成分含量的特点，研究出了适合果上叶组dna的提取方法，降低了多糖、多酚等次生代谢产物对完整dna提取步骤的干扰，同时降低了提取温度，避免了温度对dna的破坏，提高了dna完整率，具体体现在：
25.1)本发明利用聚丙烯酰胺，对表面杂质进行脱除。
26.2)本发明利用非离子表面活性剂以及液氮速冷的手段，改善了果上叶的孔隙结构，使得dna易于溶出。
27.3)本发明通过优化dna提取溶液配方，尤其加入阴离子表面活性剂后，极大改善了蛋白质、多糖、纤维等物质的水解和结合情况，同时改善了dna等成分的增溶效果，降低了提取温度，进而避免了较高温度对dna的分解破坏。
28.4)由于高盐存在下，ctab与蛋白质、多糖等物质结合，而不与dna结合，进一步确保了dna的完整性。
29.5)本发明使用无水乙醇，避免了异丙醇沉淀dna的同时，与盐类、糖类等发生共沉淀，并且由于乙醇易于挥发，因此通过水洗即可，避免了乙醇清洗，减少了化学试剂的使用。
具体实施方式
30.下面对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明，但本发明并不局限于这些实施方式，任何在本实施例基本精神上的改进或代替，仍属于本发明权利要求所要求保护的范围。
31.实施例1
32.一种果上叶dna的提取方法，包括如下步骤：
33.(1)按照1：1.3的料液质量比将果上叶置于体积浓度为10％的聚丙烯酰胺溶液中搅拌10min，取出冲洗1次后，表面喷洒果上叶质量0.1％的吐温20溶液，再经液氮速冻后，研磨成粉末；所述吐温20溶液的体积浓度为40％；
34.(2)将果上叶粉末倒入冷的ep管内，并加入温度55℃的dna提取溶液，摇匀后55℃条件下水浴30min，在水浴期间来回颠倒3次；所述dna提取溶液为2％ctab，0.08％(v/v)β
‑
巯基乙醇，0.01％十二烷基苯磺酸钠，1.1mol/lnacl；
35.(3)取出ep管冷却至室温后，加入抽提溶液充分颠倒混匀，12000
×
g离心5min，取上清液a；所述抽提溶液与dna提取溶液的体积比为1:1；所述抽提溶液为苯酚:氯仿:异戊醇的体积比为25:24:1的混合物；
36.(4)将上清液a转入新ep管中，加入氯仿/异戊醇混合物充分颠倒混匀，12000
×
g离心5min，取上清液b；所述氯仿/异戊醇混合物与上清液a的体积比为1:1；所述氯仿/异戊醇混合物按体积比为氯仿:异戊醇＝24:1的混合物；
37.(5)取上清液b转移到新离心管中，加入0.8倍体积的5℃无水乙醇充分颠倒混匀，再静置于
‑
20℃下10min，再12000
×
g离心10min，使dna充分析出得到dna沉淀；
38.(6)水洗dna沉淀1次。
39.实施例2
40.一种果上叶dna的提取方法，包括如下步骤：
41.(1)按照1：1.8的料液质量比将果上叶置于体积浓度为30％的聚丙烯酰胺溶液中搅拌20min，取出冲洗2次后，表面喷洒果上叶质量0.5％的吐温40溶液，再经液氮速冻后，研磨成粉末；所述吐温40溶液的体积浓度为50％；
42.(2)将果上叶粉末倒入冷的ep管内，并加入温度60℃的dna提取溶液，摇匀后60℃条件下水浴60min，在水浴期间来回颠倒5次；所述dna提取溶液为3％ctab，0.1％(v/v)β
‑
巯基乙醇，0.04％十二烷基苯磺酸钠，1.3mol/lnacl；
43.(3)取出ep管冷却至室温后，加入抽提溶液充分颠倒混匀，12000
×
g离心5min，取上清液a；所述抽提溶液与dna提取溶液的体积比为1:1；所述抽提溶液为苯酚:氯仿:异戊醇的体积比为25:24:1的混合物；
44.(4)将上清液a转入新ep管中，加入氯仿/异戊醇混合物充分颠倒混匀，12000
×
g离心5min，取上清液b；所述氯仿/异戊醇混合物与上清液a的体积比为1:1；所述氯仿/异戊醇混合物按体积比为氯仿:异戊醇＝24:1的混合物；
45.(5)取上清液b转移到新离心管中，加入1倍体积的10℃无水乙醇充分颠倒混匀，再静置于
‑
20℃下20min，再12000
×
g离心10min，使dna充分析出得到dna沉淀；
46.(6)水洗dna沉淀2次。
47.实施例3
48.一种果上叶dna的提取方法，包括如下步骤：
49.(1)按照1：1.4的料液质量比将果上叶置于体积浓度为15％的聚丙烯酰胺溶液中搅拌18min，取出冲洗2次后，表面喷洒果上叶质量0.4％的司盘
‑
20溶液，再经液氮速冻后，研磨成粉末；所述司盘
‑
20溶液的体积浓度为48％；
50.(2)将果上叶粉末倒入冷的ep管内，并加入温度58℃的dna提取溶液，摇匀后58℃条件下水浴50min，在水浴期间来回颠倒4次；所述dna提取溶液为2.5％ctab，0.08％(v/v)β
‑
巯基乙醇，0.04％十二烷基苯磺酸钠，1.2mol/lnacl；
51.(3)取出ep管冷却至室温后，加入抽提溶液充分颠倒混匀，12000
×
g离心5min，取上清液a；所述抽提溶液与dna提取溶液的体积比为1:1；所述抽提溶液为苯酚:氯仿:异戊醇的体积比为25:24:1的混合物；
52.(4)将上清液a转入新ep管中，加入氯仿/异戊醇混合物充分颠倒混匀，12000
×
g离心5min，取上清液b；所述氯仿/异戊醇混合物与上清液a的体积比为1:1；所述氯仿/异戊醇混合物按体积比为氯仿:异戊醇＝24:1的混合物；
53.(5)取上清液b转移到新离心管中，加入0.9倍体积的8℃无水乙醇充分颠倒混匀，再静置于
‑
20℃下15min，再12000
×
g离心10min，使dna充分析出得到dna沉淀；
54.(6)水洗dna沉淀1次。
55.实施例4
56.一种果上叶dna的提取方法，包括如下步骤：
57.(1)按照1：1.5的料液质量比将果上叶置于体积浓度为20％的聚丙烯酰胺溶液中搅拌15min，取出冲洗1次后，表面喷洒果上叶质量0.3％的司盘
‑
80溶液，再经液氮速冻后，
研磨成粉末；所述司盘
‑
80溶液的体积浓度为45％；
58.(2)将果上叶粉末倒入冷的ep管内，并加入温度57℃的dna提取溶液，摇匀后57℃条件下水浴45min，在水浴期间来回颠倒4次；所述dna提取溶液为2.5％ctab，0.09％(v/v)β
‑
巯基乙醇，0.02％十二烷基苯磺酸钠，1.2mol/lnacl；
59.(3)取出ep管冷却至室温后，加入抽提溶液充分颠倒混匀，12000
×
g离心5min，取上清液a；所述抽提溶液与dna提取溶液的体积比为1:1；所述抽提溶液为苯酚:氯仿:异戊醇的体积比为25:24:1的混合物；
60.(4)将上清液a转入新ep管中，加入氯仿/异戊醇混合物充分颠倒混匀，12000
×
g离心5min，取上清液b；所述氯仿/异戊醇混合物与上清液a的体积比为1:1；所述氯仿/异戊醇混合物按体积比为氯仿:异戊醇＝24:1的混合物；
61.(5)取上清液b转移到新离心管中，加入0.9倍体积的8℃无水乙醇充分颠倒混匀，再静置于
‑
20℃下15min，再12000
×
g离心10min，使dna充分析出得到dna沉淀；
62.(6)水洗dna沉淀2次。
63.实施例5
64.一种果上叶dna的提取方法，包括如下步骤：
65.(1)按照1：1.6的料液质量比将果上叶置于体积浓度为25％的聚丙烯酰胺溶液中搅拌13min，取出冲洗2次后，表面喷洒果上叶质量0.2％的吐温80溶液，再经液氮速冻后，研磨成粉末；所述吐温80溶液的体积浓度为45％；
66.(2)将果上叶粉末倒入冷的ep管内，并加入温度59℃的dna提取溶液，摇匀后59℃条件下水浴32min，在水浴期间来回颠倒3次；所述dna提取溶液为2％ctab，0.1％(v/v)β
‑
巯基乙醇，0.01％十二烷基苯磺酸钠，1.1mol/lnacl；
67.(3)取出ep管冷却至室温后，加入抽提溶液充分颠倒混匀，12000
×
g离心5min，取上清液a；所述抽提溶液与dna提取溶液的体积比为1:1；所述抽提溶液为苯酚:氯仿:异戊醇的体积比为25:24:1的混合物；
68.(4)将上清液a转入新ep管中，加入氯仿/异戊醇混合物充分颠倒混匀，12000
×
g离心5min，取上清液b；所述氯仿/异戊醇混合物与上清液a的体积比为1:1；所述氯仿/异戊醇混合物按体积比为氯仿:异戊醇＝24:1的混合物；
69.(5)取上清液b转移到新离心管中，加入0.8倍体积的7℃无水乙醇充分颠倒混匀，再静置于
‑
20℃下12min，再12000
×
g离心10min，使dna充分析出得到dna沉淀；
70.(6)水洗dna沉淀1次。
71.实验例1
72.将实施例1、3所得dna沉淀挥干后用100μlte溶解并用凝胶电泳检查dna提取情况，经电泳检测的条带明亮、清晰、无脱带；同时利用紫外吸收方法检测显示：实施例1和实施例3所得dna沉淀中均无蛋白质、多糖等杂质残留；一般按照果上叶粉末0.04g用dna提取溶液600μl进行处理，用1.00g果上叶提取后，实施例1获得约32.10μg的dna，实施例3获得约31.06μg的dna，其他实施例组经过相同的方法检测，情况一致，且每1.00g果上叶的dna提取量在31.00
‑
32.10μg之间，各实施例组的dna提取量结果无显著差异。
73.实验例2
74.采用实施例2的方法对以下果上叶样品进行鉴定；样品情况如下：
75.样品1：根状茎匍匐，粗壮，粗2
‑
6毫米，被杯状膜质鞘或鞘腐烂后残存的纤维。假鳞茎在根状茎上，卵状圆锥形或狭卵形，顶生1枚叶，干后灰褐色。叶革质，长圆形。花葶黄绿色带紫红色条斑，从假鳞茎基部抽出，直立。假鳞茎在根状茎上聚生或紧靠，近圆柱形，顶生1枚叶，基部被鞘腐烂后残存的纤维。叶革质，狭长圆形，近无柄，在背面中肋隆起。
76.样品2：根状茎匍匐，每相距3
‑
6个节间发出1个茎。茎黄色或黄褐色，通常下垂，多分枝。假鳞茎金黄色，稍扁纺锤形，具1个节间，顶生1枚叶。叶革质，长圆形或长圆状披针形。
77.样品3：假鳞茎密集，卵形，略扁，叶椭圆状长圆形，革质，稍带肉质，花葶长10
‑
20厘米；花序柄近圆柱形，无明显的翅，亦无不育苞片；总状花序通常具10余朵花，淡橘红色，稍疏离，花期10
‑
11月。
78.样品4：根状茎匍匐，假鳞茎密集，近长圆形，顶端或近顶端具1叶。
79.样品5：根状茎较细长，匍匐。假鳞茎狭卵形至近圆柱形，顶端生2枚叶。叶长圆形或长圆状披针形，纸质。
80.样品6：根状茎较细长，匍匐。假鳞茎狭卵形至近圆柱形，顶端生2枚叶。叶长圆形或长圆状披针形，纸质。花葶从已长成的假鳞茎顶端发出，长5
‑
10厘米；总状花序通常具1
‑
2朵花，花淡黄色，仅唇瓣上有红色斑纹；花瓣丝状或狭线形，与萼片近等长；唇瓣卵形，3裂。
81.样品7：根状茎匍匐，常分枝，假鳞茎细长梭形，顶端生1枚叶，较小。须根较多。
82.样品8：根状茎较细长，匍匐。假鳞茎狭卵形至近圆柱形，顶端生2枚叶。叶长圆形或长圆状披针形，纸质。花葶从已长成的假鳞茎顶端发出，长5
‑
10厘米；总状花序通常具1
‑
2朵花，花淡黄色，仅唇瓣上有红色斑纹；花瓣丝状或狭线形，与萼片近等长；唇瓣卵形，3裂。
83.样品9：假鳞茎密集，近狭卵形或卵形，叶倒披针形或狭椭圆状倒披针形，坚纸质，花葶长11
‑
25厘米；
84.样品10：根状茎匍匐，常分枝，假鳞茎卵形，叶披针形，厚革质，花葶生于幼嫩的假鳞茎顶端，连同幼叶从靠近老假鳞茎基部的根状茎上发出。
85.样品11，根状茎匍匐，分枝，密被鳞片状鞘，节上疏生根；假鳞茎狭卵形至卵状长圆形，顶端生2叶。叶线形或线状披针形，纸质。花葶生于幼嫩假鳞茎顶端，发出时其基部连同幼叶均为鞘所包。
86.样品12：根状茎匍匐，幼时被鞘，老的在节上被鞘残留下来的纤维，根出自生有假鳞茎的根状茎节上。假鳞茎卵形，基部被鞘腐烂后残留的硬直纤维，干后黄色，具纵棱，叶厚革质，狭长圆形，叶柄对折。
87.对以上样品提取的dna做its1
‑
5.8srdna
‑
its2序列pcr反应，以通用引物its1(5
’‑
tccgtaggtgaacctgcgg
‑3’
)和its4(5
’‑
tcctccgcttattgatatgc
‑3’
)为引物按照表1的反应体系以如下反应条件扩增真菌的its1
‑
5.8srrna
‑
its4序列。
[0088][0089]
然后，利用1％(w/v)琼脂糖凝胶在100v电压下对电泳扩增产物30min，以检查扩增
是否成功。
[0090]
表1 pcr反应体系
[0091][0092][0093]
序列分析：将所得pcr电泳检测后送交invitrogen(上海，中国)或擎科生物技术有限公司(北京，中国)公司测序，将所测序列提交到ncbi genebank数据库上进行blast比对，根据比对结果选取相似度最大且具有代表性的菌种利用mega5.10软件采用邻
‑
接(neighbor
‑
joining，nj)法进行聚类分析。
[0094]
结果显示：
[0095]
样品1：将其扩增得到的its1
‑
5.8srdna
‑
its2序列在ncbi genbank数据库数据上进行blast比对后发现其与bulbophyllum andersonii isolate smsdlits(accession no.jn619417.1)相似度最大，达到98％。同时，采用mega 5.10软件用n
‑
j构建系统进化树，自展值设为1000，得到系统发育树。根据blast比对结果和系统发育树分析结果，以及其形态特征，将样品1鉴定为梳帽卷瓣兰b.andersonii。
[0096]
样品2：将其扩增得到的its1
‑
5.8srdna
‑
its2序列在ncbi genbank数据库数据上进行blast比对后发现其与dendrobium albopurpureum isolate ct2(accession no.:mk483264.1)相似度最大，达到97％。同时，采用mega 5.10软件用n
‑
j构建系统进化树，自展值设为1000，得到系统发育树。根据blast比对结果和系统发育树分析结果，以及其形态特征，将样品2鉴定为d.albopurpureum。
[0097]
样品3：将其扩增得到的its1
‑
5.8srdna
‑
its2序列在ncbi genbank数据库数据上进行blast比对后发现其liparis guangxiensis voucher l.li 153(accession no.kf589875.1)相似度最大，达到99％。同时，采用mega 5.10软件用n
‑
j构建系统进化树，自展值设为1000，得到系统发育树。根据blast比对结果和系统发育树分析结果，以及其形态特征，将样品3鉴定为广西羊耳蒜l.guangxiensis。
[0098]
样品4和样品5中植物为形态完全相同，为同一种植物：将其扩增得到的its1
‑
5.8srdna
‑
its2序列在ncbi genbank数据库数据上进行blast比对后发现其与l.balansae voucher l.li 152(accession no.kf589874.1)和l.latilabris voucher z.j.liu 4770
(accession no.kj459291.1)相似度最大，均达到98％。同时，采用mega 5.10软件用n
‑
j构建系统进化树，自展值设为1000，得到系统发育树。根据blast比对结果和系统发育树分析结果，样品4和样品5未能与某一个序列单独聚类在一起，同时参考其形态特征，将样品4和样品5初步鉴定为羊耳蒜liparis sp.属植物。
[0099]
样品6：将其扩增得到的its1
‑
5.8srdna
‑
its2序列在ncbi genbank数据库数据上进行blast比对后发现其与coelogyne fimbriata voucher l.li 11(ibsc)(accession no.kr857330.1)和c.fimbriata var.leungiana voucher kfbg260(accession no.ky966507.1)相似度最大，均达到99％。同时，采用mega 5.10软件用n
‑
j构建系统进化树，自展值设为1000，得到系统发育树。根据blast比对结果和系统发育树分析结果，同时参考其形态特征，将样品6初步鉴定为流苏贝母兰c.fimbriata。
[0100]
样品7：将其扩增得到的its1
‑
5.8srdna
‑
its2序列在ncbi genbank数据库数据上进行blast比对后发现其与bulbophyllum shweliense voucher jian
‑
wu_li1636(accession no.mk164507.1)相似度最大，达到99％。同时，采用mega 5.10软件用n
‑
j构建系统进化树，自展值设为1000，得到系统发育树。根据blast比对结果和系统发育树分析结果，以及其形态特征，将样品7鉴定为伞花石豆兰b.shweliense w.w.sm.。
[0101]
样品8：将其扩增得到的its1
‑
5.8srdna
‑
its2序列在ncbi genbank数据库数据上进行blast比对后发现其与coelogyne fimbriata voucher kfbg712(accession no.ky966506.1)和c.fimbriata voucher l.li 11(ibsc)(accession no.kr857330.1)相似度最大，达到99％。同时，采用mega 5.10软件用n
‑
j构建系统进化树，自展值设为1000，得到系统发育树。根据blast比对结果和系统发育树分析结果，以及其形态特征，将样品8鉴定为流苏贝母兰c.fimbriata。
[0102]
样品9：将其扩增得到的its1
‑
5.8srdna
‑
its2序列在ncbigenbank数据库数据上进行blast比对后发现其与l.balansae voucher l.li 152(accession no.kf589874.1)相似度最大，达到97％。同时，采用mega 5.10软件用n
‑
j构建系统进化树，自展值设为1000，得到系统发育树。根据blast比对结果和系统发育树分析结果，以及其形态特征，将样品9鉴定为羊耳蒜liparis sp.属植物。
[0103]
样品10：将其扩增得到的its1
‑
5.8srdna
‑
its2序列在ncbi genbank数据库数据上进行blast比对后发现其与pholidota missionariorum voucher kfbg225(accession no.ky966652.1)相似度最大，达到99％。同时，采用mega 5.10软件用n
‑
j构建系统进化树，自展值设为1000，得到系统发育树。根据blast比对结果和系统发育树分析结果，以及其形态特征，将样品10鉴定为尖叶石仙桃p.missionariorum。
[0104]
样品11：将其扩增得到的its1
‑
5.8srdna
‑
its2序列在ncbi genbank数据库数据上进行blast比对后发现其与p.cantonensis voucher kfbg658a(accession no.ky966649.1)相似度最大，达到96％。同时，采用mega 5.10软件用n
‑
j构建系统进化树，自展值设为1000，得到系统发育树。根据blast比对结果和系统发育树分析结果，以及其形态特征，将样品11鉴定为细叶石仙桃p.cantonensis。
[0105]
样品12：将其扩增得到的its1
‑
5.8srdna
‑
its2序列在ncbi genbank数据库数据上进行blast比对后发现其与bulbophyllum tianguii isolate tgsdlits(accession no.jn619415.1)相似度最大，达到99％。同时，采用mega 5.10软件用n
‑
j构建系统进化树，
自展值设为1000，得到系统发育树。根据blast比对结果和系统发育树分析结果，以及其形态特征，将样品12鉴定为天贵卷瓣兰b.tianguii。
[0106]
以上鉴定中，除了样品4、样品5和样品9仅鉴定到属外，其它所有植物均鉴定到种，且其余9种材料分属8个不同种。