一种花生几丁质酶及其应用的制作方法

1.本发明涉及一种花生几丁质酶及其应用，属于生物技术领域。


背景技术：

2.植物在生长发育过程中会受到许多生物和非生物因子的胁迫，如干旱、寒冷、uv射线、创伤、病原物(真菌、细菌、病毒)侵染等，为此生物进化出一系列防御机制来抵御逆境胁迫，病程相关蛋白(pathogenesis
‑
related protein,pr)的激活和积累是植物防御反应的重要组成部分(singh a,et al.,heterologous expression of new antifungal chitinase from wheat.protein expr purif.2007,56(1):100
‑
109)。植物表达多种病程相关蛋白基因以应对病原菌等多种逆境因子的危害，其中pr3基因家族编码的几丁质酶(chitinase)在植物抗病防卫反应中备受关注。
3.几丁质为n
‑
乙酰
‑
d
‑
葡萄糖胺以β
‑
1,4
‑
糖苷键连接起来的直链多聚化合物，是构成真菌细胞壁骨架的主要成分，而植物细胞的细胞壁中不含几丁质。几丁质酶是以几丁质为底物并将其水解为n
‑
乙酰寡糖和葡萄糖的酶系。几丁质酶广泛存在于高等植物中，在植物的各组织部位中均有几丁质酶的分布。典型的几丁质酶具有一个n端信号肽(signal peptide)、一个催化结构域(catalytic domain)和只存在于液泡几丁质酶中的c端结构域(c
‑
terminal extension)。有些几丁质酶n端信号肽含有一个或者多个富含半胱甘酸的几丁质结合域(chitin
‑
blinding domains,chbd)。chbd结构域可以增强对不同几丁质的结合能力和活性，同时对几丁质酶抗真菌的作用有显著影响，而花生几丁质酶不含有chbd的结构域。通过基因工程的方法，改良抗菌蛋白的催化功能，是当前抗菌蛋白研究的重点之一。


技术实现要素：

4.本发明针对现有技术的不足，本发明提供了一种花生几丁质酶基因的克隆方法，其n端融合了chbd结构域，增加了对几丁质的结合能力和活性。同时chbd结构域序列后增加了一段含有5个氨基酸的铰链区序列，增加了花生几丁质酶的三维结构的柔性。铰链区序列作为柔性linker(glu
68
‑
lys
72
)，一方面可以增强chbd结构域的摆动性，另一方面可以降低和催化构域之间的距离，提高催化效率。本发明提供了一种新型花生几丁质酶基因的克隆方法，明确了花生几丁质酶chi
‑
chbd
‑
hinge对于提高烟草对胶孢炭疽菌抗性、提高西瓜对枯萎病和花生抗黄曲霉抗性中的作用。基于此，本发明提供了一种花生几丁质酶及其编码基因chi
‑
chbd
‑
hinge的序列及其应用。
5.一方面，本发明提供一种新型花生几丁质酶chi
‑
chbd
‑
hinge，其氨基酸序列如seq id no.1所示。
6.seq id no.1：
7.masnksssthqpltlllfflltlssahakggiaiydcgctadlccsrfgycgngtdycgtgcqggpceaaakwgqnngdgnltstcdtgnyeivllaflytfgcgrtpdwnfaghcgswspcdklqpeiehcqrngvkvflslggavgpyslcspedaksvsdylynnfltgqkgplgsvyldgidfdieggsnlywddlareldtrrkqdryfylsaapqcf
ftdyyldtairtwlfdylfvqfynnppcqysngdaslllsswntwtsyvkinntvfmglpaapdaapsggyispqdlctkvlptikhtpnyggvmlwdrfrdvtnhysdqikdcvivddsvrvsqtvmatlsntvsqcvsaafnriipklrpf
8.另一方面，本发明还提供一种花生几丁质酶chi
‑
chbd
‑
hinge对应的核酸序列，如seq id no.2所示。
9.seq id no.2：
10.atggcttccaacaagagtagtagtactcatcaaccattaacattgctcctcttcttcctcctcaccctctcctctgcacatgccaaaggtggcatagccatctacttgccggagaattgataacagctcaagattgtggttgcaccgccgacctatgttgtagtcggtttggttattgtggcaacggcacagattactgtggaagcggcggcgaaatggggccagaacaatggcgacggcaacttaacctccacatgtgacaccggaaactacgagattgtgcttctcgcctttctctacactttcggttgtggcagaactccagattggaactttgctggccactgtggttcatggtccccttgtgacaaactacaaccagaaatcgaacattgccaaagaaacggtgtgaaggtgttcctctcccttggaggagccgttgggccctactccttatgctcgccggaagatgccaagagcgtctccgactacctttacaacaacttcctcactggccaaaagggtccattagggagtgtgtaccttgatggcattgatttcgacattgaaggtggttcaaacctttattgggatgacttagctagagaactcgatacacgcagaaagcaagacaggtacttttacttgtcggcagcaccacaatgtttcttcacagattactaccttgataccgccattagaacttggcttttcgattacctcttcgtccagttctacaacaaccctccatgccaatatagtaacggcgacgcgtctctgctcttatcttcttggaatacatggacctcctatgtgaagatcaacaacacggtgtttatggggctacccgctgcacctgatgcagctcccagcggtggctatatttcaccgcaagatctgtgtactaaggttcttccaaccatcaagcacactcctaactatggaggcgtcatgctatgggataggttccgcgatgttactaaccactacagcgatcaaatcaaggattgtgttatagttgatgatagtgttagggtgtcacagactgtgatggcaacgttatcaaacactgtatctcaatgtgtatctgcagctttcaaccgcatcataccaaaactaagacccttt
11.另一方面，本发明还提供一种花生几丁质酶chi
‑
chbd
‑
hinge基因的克隆方法。所述方法包括：
12.(1)花生几丁质酶chi的获得：植株幼苗进行低温、干旱和盐胁迫后，收获前接种黄曲霉诱导表达相关基因的表达，包括几丁质酶。提取总rna后，通过rt
‑
pcr扩增出几丁质酶chi编码区。产物连接到pgem
‑
t easy载体，经过测向获得花生几丁质酶序列；
13.(2)n段chbd结构域和铰链区的融合：设计n端融合chbd结构域和铰链区的花生几丁质酶的序列，然后进行模拟分析和三位建模；
14.(3)重组载体构建：体外合成序列，将序列基因与植物表达载体pcambia2300s连接，构建植物超表达载体；
15.(4)植物的介导转入、表达：将构建的植物超表达载体通过根癌农杆菌接到转入烟草中表达。
16.取2
‑
5株花生植株在田间栽培环境下培育，在培育过程中，对所述花生植株采用nacl溶液和peg6000溶液对该花生植株进行胁迫处理，并在收获前24天分三次对所述花生植株接种黄曲霉菌，其中，所述花生植株为生长2周的三叶期花生幼苗；
17.获取所述花生植株的花生种子的花生种皮2
‑
10克，研磨之后提取所述花生种皮的总rna，并采用所述rna进行cdna的合成；
18.以合成的第一链cdna为模板，扩增目的基因j11
‑
ahhevamine
‑
a。采用的引物为forword:5
’‑
ccaatatagtaacggcgacgcg
‑3’
和reverse：5
’‑
cataaacaccgtgttgttgatc
‑3’
；pcr反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1min，共30个循
环；72℃延伸5min；4℃稳定15min。pcr反应所用dna聚合酶为primerstar hs购自大连宝生物公司。pcr结束后，取5μl用于琼脂糖凝胶电泳，以检测扩增产物的特异性以及大小。纯化产物连接pgem
‑
t easy载体并转化至感受态大肠杆菌，然后在lb培养基中培养预设时间，培养预设时间之后随机挑选预设数量的培养产物进行扩大培养，并对扩大培养的产物进行pcr扩增检测和测序；
19.测序得到序列后，得到其氨基酸序列，n段融合一个chbd结构域的同时增加铰链区序列，然后对融合后的花生几丁质酶序列进行三维模建，结合几丁质的底物口袋构象，通过计算模拟底物与酶分子相互作用，经过分析，融合的chbd序列具有增强几丁质结合的作用。铰链区序列作为柔性linker，一方面可以增强chbd结构域的摆动性，另一方面可以降低和花生几丁质酶催化构域之间的距离，提高催化效率；
20.合成花生几丁质酶chi
‑
chbd
‑
hinge的核酸序列，获得基因片段与植物表达载体pcambia2300s连接，构建植物超表达载体，之后将所构建的重组载体通过根癌农杆菌介导转入烟草中表达。
21.另一方面，本发明还提供了携带所述花生几丁质酶基因的载体。载体由植物pcambia2300s等构建。
22.另一方面，本发明还提供了所述花生几丁质酶chi
‑
chbd
‑
hinge在植物抗菌中的应用。进一步的，所述植物选自烟草、西瓜或花生；所述菌选自胶孢炭疽菌、枯萎病菌、黄曲霉。优选的：所述的花生几丁质酶在提高烟草对胶孢炭疽菌抗性中的应用。优选的：所述的花生几丁质酶在提高西瓜对枯萎病和花生抗黄曲霉抗性中的作用。
23.有益效果：
24.本发明所述的花生几丁质酶chi
‑
chbd
‑
hinge，n端具有融合的chbd结构域及其铰链区。融合的结构域在未破坏几丁质酶的结构基础上，增加了几丁质酶的组装速率，从而表现出了更好的几丁质结合活性；融合铰链区序列作为柔性linker，一方面可以增强chbd结构域的摆动性，进一步增加chbd结合几丁质的结合能力；另一方面可以降低和催化构域之间的距离，提高催化效率。对结合能力和催化活性统筹考虑，融合chbd结构域和铰链区协同作用，提高了花生几丁质酶的催化活性，可以增强植物对病原真菌的抗性。
附图说明
25.图1是本发明中花生几丁质酶chi
‑
chbd
‑
hinge的模拟3d结构；
26.图2是本发明中阳性转基因烟草中花生几丁质酶chi
‑
chbd
‑
hinge的转录水平表达分析结果图，其中marker为dl2000 dna marker(大连宝生物)；wt为非转基因烟草总rna逆转录cdna为模板的pcr产物；
27.图3是本发明中花生几丁质酶chi
‑
chbd
‑
hinge的转基因烟草体外抗真菌活性的抑菌效果。
具体实施方式
28.实施例1花生几丁质酶全长cdna克隆以及序列分析
29.取2
‑
5株花生植株在田间栽培环境下培育，在培育过程中，对所述花生植株进行胁迫处理。具体为采用nacl溶液和peg6000溶液对该花生植株进行胁迫处理。也即将该三叶期
花生幼苗放置在4℃的低温光照培养箱中进行低温处理，以实现从该三叶期花生幼苗中选择抗低温基因，然后在采用nacl溶液对该三叶期花生幼苗进行耐盐处理，即将该三叶期花生幼苗的根部去除土壤之后放置在250mm nacl溶液中浸泡6小时；最后在采用peg6000溶液对该三叶期花生幼苗进行抗旱处理，即将该三叶期花生幼苗的根部去除土壤之后放置在20％peg6000溶液中浸泡6小时，并在收获前24天分三次对所述花生植株接种黄曲霉菌。选取预先培育的花生植株幼苗2
‑
5株，在肥沃的田间土地中进行自然环境下的培育，其中，优选的，采用生长2周的三叶期花生幼苗植株进行田间培育。在花生植株收获前24天，在花生垄间设置深度为3
‑
4cm的垄沟，且设置的垄沟不能触及花生植株的根部。垄沟设置好之后，将黄曲霉撒施在该垄沟内，并在黄曲霉的上部覆盖3
‑
4cm的土层；然后采用喷水壶按照100
‑
150g/m2在黄曲霉的上部覆盖的土层上均匀喷洒水，以便于营造适合黄曲霉菌生长的潮湿温暖环境，在该过程的执行过程中，需要保持黄曲霉的上部覆盖的土层的温度在15
‑
30℃的范围内，优选的，保持黄曲霉的上部覆盖的土层的温度为25℃，黄曲霉的部覆盖的土层的相对湿度大于50％，在该温度和该湿度下的土层是最适宜黄曲霉菌繁殖的温湿度环境，可以保证黄曲霉菌的快速繁殖。
30.进一步的，完成上述步骤的第一次黄曲霉菌的接种之后，按照8天为一个周期，再次按照上述步骤进行第二次的黄曲霉菌接种，也即，分别间隔8天之后，按照上述步骤进行第二次和第三次的黄曲霉菌接种。
31.获取所述花生植株的花生种子的花生种皮2
‑
10克，研磨之后提取所述花生种皮的rna，并采用所述rna进行cdna的合成。
32.具体的，培育的花生植株生长成熟之后，选取该花生植株的花生种子的花生种皮2
‑
10克，采用研砵研磨之后，用takara的minibest universal rna extraction kit试剂盒方法分离提取研磨之后的该花生种皮的rna；将提取的该花生种皮的rna去除dna污染后，用smart
‑
race试剂盒方法进行cdna合成，并将cdna合成产物存储在零下20℃低温冰箱中保存备用，其中，rna提取和cdna合成过程中使用的器皿采用0.1％的depc浸泡12小时并采用高温灭菌。
33.具体的，采用minibest universal rna extraction kit试剂盒和smart
‑
race试剂盒分别进行花生种皮的rna的提取和cdna的合成，可以保证最终得到的cdna合成产物具有较好的基因完整度和基因长度，有利于提高最终克隆得到的花生几丁质酶基因的抗霉菌特性。
34.以合成的第一链cdna为模板，扩增目的基因j11
‑
ahhevamine
‑
a。采用的引物为forword:5
’‑
ccaatatagtaacggcgacgcg
‑3’
和reverse：5
’‑
cataaaca ccgtgttgttgatc
‑3’
；pcr反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1min，共30个循环；72℃延伸5min；4℃稳定15min。pcr反应所用dna聚合酶为primerstar hs购自大连宝生物公司。pcr结束后，取5μl用于琼脂糖凝胶电泳，以检测扩增产物的特异性以及大小。纯化产物连接pgem
‑
t easy载体并转化至感受态大肠杆菌，然后在lb培养基中培养预设时间，培养预设时间之后随机挑选预设数量的培养产物进行扩大培养，并对扩大培养的产物进行pcr扩增检测和测序。
35.进一步的，本发明实施例的花生几丁质酶基因的克隆方法克隆得到的花生几丁质酶基因的开放阅读框为1020bp，并且该花生几丁质酶基因编码有339个氨基酸序列。
36.实施例2花生几丁质酶chi
‑
chbd
‑
hinge的合成及植物超表达载体的构建
37.将实施例1得到的花生几丁质酶的n端融合chbd结构域和铰链区序列，然后进行模拟分析。融合的结构域在未破坏几丁质酶的结构基础上，增加了几丁质酶的组装速率，从而表现出了更好的几丁质结合活性；融合铰链区序列作为柔性linker，一方面可以增强chbd结构域的摆动性，进一步增加chbd结合几丁质的结合能力；另一方面可以降低和催化构域之间的距离，提高催化效率(图1)。
38.体外合成融合chbd结构域和铰链区的花生几丁质酶序列chi
‑
chbd
‑
hinge，同时合成融合chbd结构域但不带铰链区的chi
‑
chbd，以及融合铰链区序列但不带chbd结构域的chi
‑
hinge，然后将合成的序列以及实施例1所得野生型花生几丁质酶(chi
‑
wt)利用t4 dna ligase(takara)连接到植物表达载体pcambia2300s(用限制性内切酶bam hi(takara)和eco ri(takara)对质粒pcambia2300s进行双酶切)。接着采用热激转化法将连接产物转入大肠杆菌dh5α中，用含有50mg/l卡那霉素(kanamycin，km)的固体培养基筛选阳性克隆。挑选单菌落摇菌，以菌液为模板用扩增chi
‑
chbd
‑
hinge的特异引物进行pcr，挑选出chi
‑
wt，chi
‑
chbd，chi
‑
hinge和chi
‑
chbd
‑
hinge与pcambia2300s成功连接的克隆，所检测的菌株若为阳性，加入甘油并置于
‑
80℃保存备用。
39.本发明实施例2得到的新型花生几丁质酶基因chi
‑
chbd
‑
hinge的氨基酸序列如seq id no.1所示，其对应的核苷酸序列如seq id no.2所示。
40.采用sanprep柱式质粒抽提试剂盒(上海生工)提取并纯化上述大肠杆菌中的四种质粒，分别为pcambia2300s
‑
chi
‑
wt，pcambia2300s
‑
chi
‑
chbd，pcambia2300s
‑
chi
‑
hinge和pcambia2300s
‑
chi
‑
chbd
‑
hinge。随后用液氮冻融法将上述构建的上述四种植物表达载体转入根癌农杆菌lba4404感受态细胞中。操作步骤为：分别取2μg的上述四种质粒加入含有200μl感受态细胞的离心管中，轻轻混匀后冰浴5min，随后转入液氮中冷冻1min，然后迅速置于37℃水浴5min，之后立即冰浴2min，加入800μl lb液体培养基于28℃振荡培养4h。将活化后的农杆菌涂于含有50mg/l km的lb固体培养基上，28℃静止培养。挑选单菌落摇菌，再用扩增chi
‑
chbd
‑
hinge的特异性引物进行pcr，分别检测四种质粒pcambia2300s
‑
chi
‑
wt，pcambia2300s
‑
chi
‑
chbd，pcambia2300s
‑
chi
‑
hinge和pcambia2300s
‑
chi
‑
chbd
‑
hinge是否转入农杆菌中，对于阳性克隆，加入甘油后置于
‑
80℃保存备用。
41.实施例3农杆菌介导的植物遗传转化以及转基因植物筛选
42.本实验的转基因受体是烟草，将烟草种子用75％的酒精浸泡30s，用无菌水洗涤后用0.1％的hgcl2浸泡8min，然后再用无菌水洗涤若干次，播种于1/2ms培养基上，28℃暗培养6d，发芽后转至光照培养箱(25℃，16h/d光照)，以后每月用1/2ms培养基继代一次。
43.从
‑
80℃冰箱中取出保存的分别含有pcambia2300s
‑
chi
‑
wt，pcambia2300s
‑
chi
‑
chbd，pcambia2300s
‑
chi
‑
hinge和pcambia2300s
‑
chi
‑
chbd
‑
hinge质粒的农杆菌lba4404菌种，接种于5ml含有50mg/l km和20mg/l利福平的lb液体培养基中，28℃培养至培养基浑浊。吸取1ml浑浊的菌液至含有50mg/l km的lb固体培养基上，28℃培养48h；随后将lb固体培养基上的农杆菌刮下适量接种于附加有20mg/l的乙酰丁香酮的mgl液体培养基中，28℃振荡培养2
‑
3h以活化农杆菌。取烟草无菌苗叶子切成1cm2左右的叶盘，完全浸泡于上述含有活化农杆菌的mgl液体培养基中，浸染时间为15min，用无菌滤纸吸干叶片表面的菌液，将叶盘置于共培养基上进行室温培养，烟草转化的共培养基为ms 0.02mg/l 6
‑
ba 2.1mg/l naa
30g/l sucrose 6g/l琼脂，22℃黑暗条件下共培养2天。将共培养后的叶盘转到加有抗生素的ms筛选培养基中分化成苗，同时筛选转基因植株。烟草筛选培养基为ms 0.5mg/l6
‑
ba 0.1mg/l naa 30g/l sucrose 6g/l琼脂 50mg/l km 200mg/l头孢霉素(cefotaxime sodium salt，cef)；筛选培养时将培养瓶转移至光照培养箱培养(25℃，16h/d光照，8h/d黑暗)，待烟草长出芽后用含有50mg/l km和200mg/l cef的ms培养基继代培养，因烟草愈伤分化率较高，故需要对再生植株进行进一步筛选，将烟草再生苗移至含有50mg/l km的ms培养基上使其生根，最后选用生根较好的再生苗做进一步的检测。
44.采用ctab法提取转基因烟草植株叶片的基因组dna，将提取的基因组dna取1μl通过琼脂糖凝胶电泳检测其完整性和浓度，以转基因植株的基因组dna为模板用扩增chi
‑
chbd
‑
hinge的特异引物进行pcr，pcr结束后，取8μl产物用于琼脂糖凝胶电泳以检测上述基因的阳性转基因植株。
45.实施例4转基因烟草中chi
‑
chbd
‑
hinge的表达分析以及转基因植株抗真菌活性分析
46.取阳性chi
‑
wt，chi
‑
chbd，chi
‑
hinge和chi
‑
chbd
‑
hinge转基因单株以及非转基因烟草(野生型)的嫩叶提取总rna，逆转录生成cdna第一链，并以此为模板用扩增chi
‑
chbd
‑
hinge(包括chi
‑
wt，chi
‑
chibd和chi
‑
hinge)的特异引物进行pcr，根据pcr结果分析各转基因单株中chi
‑
chbd(包括chi
‑
wt，chi
‑
chibd和chi
‑
hinge)转录水平的表达，总rna提取以及rt
‑
pcr的方法与实施例1中相同，pcr结束之后，取5μl用于琼脂糖凝胶电泳，部分单株的检测结果如图2所示，检测到转基因单株中chi
‑
chbd
‑
hinge(包括chi
‑
wt，chi
‑
chibd和chi
‑
hinge)在转录水平大量表达。
47.将实验室保存的胶孢炭疽菌接种于pda固体培养基(200g/l马铃薯，15g/l琼脂，20g/l葡萄糖)上，28℃暗培养，待菌落生长至直径约为2
‑
3cm时添加蛋白，分析转基因植株体外抗真菌活性。为了防止其它杂菌污染所提取的蛋白，整个植物蛋白提取过程均是无菌操作，首先取1g转基因烟草单株及野生型叶片放入研钵中，加入1ml蛋白提取液(1m nacl，0.1m乙酸钠，1％pvp，ph6)，充分研磨；转入1.5ml离心管中，混匀后4℃静置过夜，4℃离心30min(12,000g/min)，取上清于新的1.5ml离心管中，并取适量用紫外分光光度仪测定总蛋白浓度。将转基因和野生型植株的总蛋白浓度调整至0.2μg/μl，然后取20μl滴于各真菌培养基的无菌滤纸上，在真菌的平板上添加转基因烟草植株的总蛋白，同时平行添加空白对照(提取蛋白所用的溶液)，28℃培养几天后观察各处理真菌生长的情况，并据此来评价chi
‑
wt，chi
‑
chbd，chi
‑
hinge和chi
‑
chbd
‑
hinge转基因烟草的体外抗真菌活性，结果如图3所示，chi
‑
wt，chi
‑
chbd，chi
‑
hinge和chi
‑
chbd
‑
hinge转基因烟草都具有体外抗真菌活性；与chi
‑
wt，chi
‑
chbd和chi
‑
hinge相比，chi
‑
chbd
‑
hinge转基因烟草蛋白对胶孢炭疽菌的生长具有增强的抑制作用。
48.本发明提取到具有抗霉菌和抗逆境的花生几丁质酶基因，并用于进一步的改良，得到一种新型花生几丁质酶chi
‑
chbd
‑
hinge，其n端具有融合的chbd结构域和铰链区序列。融合的结构域在未破坏几丁质酶的结构基础上，增加了几丁质酶的组装速率，从而表现出了更好的几丁质结合活性；融合的铰链区序列作为柔性linker，一方面可以增强chbd结构域的摆动性，进一步增加chbd结合几丁质的结合能力；另一方面可以降低和催化构域之间的距离，提高催化效率，同时提高作物(烟草，花生和西瓜等)的抗霉菌特性，进而提高其抗
逆境能力，增强抗霉菌的侵染能力。