一种促进油茶钾素吸收的内生真菌AM8.2的制作方法

一种促进油茶钾素吸收的内生真菌am8.2
技术领域
1.本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种促进油茶钾元素吸收的内生真菌am8.2。


背景技术：

2.钾是作物生长发育必需的元素，植物体内的含钾量一般占干物质量的0.2%～4.1%，仅比氮少。它不仅能调控植株代谢过程，促进碳水化合物合成和氮代谢，而且能提高作物产量，改善果实品质，增强植物叶片光合性能。也可促进光合产物向块茎运输，且能提高叶片中蔗糖的合成能力。钾素能增强作物的抗逆境能力，对作物良好品质的形成有促进作用。
3.油茶（camellia oleifera abel.）隶属山茶科山茶属，与油棕、油橄榄和椰子并称为世界四大木本油料树种。油茶是我国南方丘陵地区重要的木本食用油料作物，年产值1160多亿，在林业产业和丘陵山区经济发展中占有非常重要的地位。同时油茶叶片能吸附空气中的有害物质，具有一定的生态价值。从我国油茶的实际种植情况来看，我国大部分油茶产量不高，极大地打击了种植户的生产积极性。低产低收是油茶产业目前面临的主要问题，提高油茶产量，才能促进油茶产业的健康和可持续发展。矿质营养元素对油茶的生长和产量影响显著，在我国有近四分之一的土地缺钾，经营者对于钾肥的重视程度不够，钾素已成为影响作物生长和品质的主要因子，为促进油茶的生长和增产，要提高油茶的钾素吸收率。
4.国内外学者已从植物体内筛选出多种具有促生的内生真菌，但目前的研究主要集中于禾木科植物相关菌株的筛选，有关于木本植物，尤其是对油茶内生真菌筛选鉴定的研究鲜见报道。从油茶根筛选出对油茶生长和抗逆性有益的内生真菌，建立油茶
‑
内生真菌共生体系，以期获得可促进油茶生长，提高油茶吸收钾素的内生真菌，为丰富木本植物内生真菌的菌种信息以及为油茶林经营制造生物菌肥提供数据基础和参考依据。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于针对木本植物油茶缺乏油茶
‑
内生真菌共生体系的问题，提供一种促进油茶钾元素吸收的内生真菌am8.2。
6.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种促进油茶钾元素吸收的内生真菌am8.2，该内生真菌am8.2的分类命名为棘炭疽菌（colletotrichum spinosum.）am8.2，已于2021年09月01日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为cgmcc no. 23245，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
7.上述促进油茶钾元素吸收的内生真菌am8.2在促进油茶生长中的应用。
8.上述内生真菌am8.2是从油茶的根中分离纯化得到的，其可制备成菌液，其可制备成菌液，通过与有机肥混合沟施的方式促进油茶苗木的生长。
9.一种含有内生真菌am8.2菌液的菌肥，其组成为：内生真菌am8.2菌液与有机肥按 1升：10公斤的比例混合而成。所述内生真菌am8.2菌液的制备方法为：将内生真菌am8.2接入液体培养基中，28℃、220 r/min摇床恒温培养72h后，将所得培养液用无菌水稀释至孢子浓度为0.6
×
10
9 cfu/ml。所述液体培养基配方为：蛋白胨20.0g，酵母浸膏10.0g，葡萄糖20.0g，腺嘌呤硫酸盐0.03g，超纯水1000ml，ph 5.6
±
0.2。
10.上述含有内生真菌am8.2菌液的菌肥在油茶种植中的应用。
11.本发明的优点在于：本发明从木本植物油茶的根部筛选获得一株内生真菌am8.2，该菌株能够促进油茶吸收钾元素和氮元素，从而能促进植株生长。内生真菌am8.2制成的菌肥可减少化学肥料的使用、提高土壤微生物活性，影响油茶的土壤理化性质，从而影响油茶的内源激素以及钾、氮元素的吸收。从而促进植物生长发育。
12.附图说明：图1为内生真菌am8.2菌落形态图。左：正面；右：背面。
具体实施方式
13.为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。
14.实施例1 油茶根内生真菌的分离培养基：（1）液体培养基ypda：蛋白胨20.0g，酵母浸膏10.0g，葡萄糖（c6h
12
o6•
h2o）20.0g，腺嘌呤硫酸盐0.03g，超纯水1000ml，ph 5.6
±
0.2。
15.（2）pda培养基（马铃薯葡萄糖琼脂培养基）：马铃薯浸粉6.0g，琼脂20.0 g，葡萄糖20.0g，ph 5.6
±
0.2。
16.内生真菌的分离（1）采用组织分离法，将油茶的根经流水冲洗干净后于超净台内吹干进行组织表面消毒，其操作流程为：75vol%无水乙醇消毒
→
无菌水清洗2~3遍
→
15vol%次氯酸钠消毒
→
无菌水清洗2~3遍。将消毒后的根用无菌刀片切去韧皮部再切成2mm
×
2mm大小，置于pda培养基上，28℃恒温避光培养。
17.（2）消毒效果的验证：将消毒最后一步清洗样品的无菌水涂布于未使用的pda培养基上，28℃恒温培养4~7d，若无菌体长出则为消毒干净。采用组织印迹法，将消毒后的样本组织于未使用的pda培养基上轻轻滚动或紧贴培养基放置5min后取走做对照，28℃恒温培养4~7d，如无菌体长出则为消毒干净。各对照重复3次。
18.内生真菌的纯化待组织材料培养3~5d后，用接种针挑取组织周围菌落生长良好的菌丝，分别于pda培养基上采用划线法进行菌株纯化，倒置于恒温培养箱内，28℃恒温避光培养4~7d。反复纯化3~4次，得到纯化菌株am8.2 。将纯化后的菌株接入pda斜面培养基，于4℃保存。
19.3 内生真菌am8.2的形态特征：
4内生真菌的dna鉴定利用真菌18s rdna通用正、反引物（ its1：tccgtaggtgaacctgcgg，its4：tcctccgcttattgatatgc），扩增内生真菌am8.2 的18s rdna基因序列（seq id no.1）；将所测的18s rdna序列与genbank数据库中的序列比对，结果表明:am8.2 菌株与棘炭疽菌（colletotrichum spinosum.）同处于一个分支上；结合菌落形态，生理生化特征和18s rdna序列分析，初步鉴定为为棘炭疽菌（colletotrichum spinosum.）。
20.>am8.2 seq id no.1：tcttccgtaagggtgacctgcggagggatcattactgagtttacgctctataaccctttgtgaacatacctaaccgttgcttcggcgggcgggaggtccgcctcccccccggccccgctcgcggggcgcccgccggaggaaaaacccaactcttattttaacgacgtctcttctgagtggcacaagcaaataatcaaaacttttaacaacggatctcttggttctggcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataagtaatgtgaattgcagaattcagtgaatcatcgaatctttgaacgcacattgcgcccgccagcattctggcgggcatgcctgttcgagcgtcatttcaaccctcaagcaccgcttggcgttggggcttccacggctgacgtgggccctcaaagacagtggcggaccctcgcggagcctcctttgcgtagtaacataccacctcgcaccgggacccgcagggcactcctgccgtaaaaccccccaatttttacaaggttgacctcggatcaggtaggaatacccgctgaacttaagcatatctaaagccggaagaaaaaataac实施例2菌液制备：将活化后的内生真菌am8.2接入20ml马铃薯葡萄糖液体培养基中，置于恒温摇床上培养72h（28℃、220 r/min），再吸取1ml接入2个500mlypda培养基中，用血球计数板计算孢子数量，将培养后的菌液用无菌水按十倍稀释法稀释至孢子浓度为0.6
×
10
9 cfu/ml。
21.菌肥制备：混合固体菌肥成分为：内生真菌am8.2 菌液：有机肥= 1升：10公斤。所述有机肥为由烟沫、米糠、牛粪、花生渣、草木灰、腐植酸、羊粪等发酵而来，有机质质量分数大于46%、n p2o5 k2o质量分数大于5%。
22.实验方案：本试验采用室外试验，试验所选油茶林场地由福建省三明市清流县清流国有林场提供。在菌肥实验区内和1个空白对照区内选择生长状态良好的油茶林为采样区。以浇灌方式施用在菌肥试验区，1月份将制备好的固体菌肥在油茶林地投影区下方40公分的位置沟施，因为7月份为雨季，所以在6月底采集土样和叶样。设置随机选取三个采样点进行叶、根、土壤取样，每个采样点取5份样品混成1个待测样。
23.菌肥对土壤理化性质的影响对土壤样品进行了含水率、电导率与ph值等三种理化性质的测定，结果如表1所示：表1 土壤含水率、电导率与ph
不同小写字母表示在同一处理水平上差异显著（t test, p < 0.05）由表1可得，由am8.2菌株制成的菌肥与对照处理组相比较，含水率，电导率，ph值都与对照组有显著性差异。
24.菌肥对油茶叶内源激素的影响分别以plant ga elisa kit（ml072782，mlbio，shanghai）、plant iaa elisa kit（ml022829，mlbio，shanghai）、plant aba elisa kit（ml064270，mlbio，shanghai）与plant br elisa kit（ml036309，mlbio，shanghai）试剂盒内标准物的浓度为横坐标，测得的od值为纵坐标，绘制标准曲线，得到直线回归方程式，计算得出样品含量（表2）。
25.表2 ga、iaa、aba、br含量不同小写字母表示在同一处理水平上差异显著（t test, p < 0.05）由表2可得，由am8.2菌株制成的菌肥与对照处理组相比较，ga(pmol/ml)的含量为211.30
±
11.92，aba(ng/ml)为140.26
±
4.51，与对照组有显著性差异。
26.菌肥对油茶吸收氮磷钾元素的影响对油茶叶片内源的n、p、k等三种元素的相对含量进行了测定，结果如表3所示：表3 内源的n、p、k等三种元素的相对含量不同小写字母表示在同一处理水平上差异显著（t test, p < 0.05）由表3可得，由am8.2菌株制成的菌肥与对照处理组相比较，k的相对含量为1.39
±
0.10，与对照组有显著性差异，表明菌株am8.2能显著促进油茶吸收钾素（k）；同时，n的相对含量为1.56
±
0.21，与对照组相比也具有显著提升。
27.土壤是植物生长发育、营养物质汲取的必要条件，土壤理化性质是气候、植被、地形和土壤结构的综合反映，通过施加微生物菌肥可减少化学肥料的使用、提高土壤微生物活性，从而影响植物的生长发育。本实验从上述结果可得由内生真菌am8.2制成的有机菌肥号对油茶的土壤生长环境是有积极的影响的，在一定程度上可影响油茶的土壤理化性质，从而影响油茶的内源激素以及钾素的吸收。
28.以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。