一种小地老虎Nora病毒及其应用的制作方法

一种小地老虎nora病毒及其应用
技术领域
1.本发明涉及病毒基因组学领域。更具体地，本发明涉及一种小地老虎nora病毒及其应用。


背景技术：

2.草地贪夜蛾在农业上属于害虫，其幼虫可大量啃食禾本科如水稻、甘蔗和玉米之类细粒禾谷及菊科、十字花科等多种农作物，造成严重的经济损失，其发育的速度会随着气温的提升而变快，一年可繁衍数代，一只雌蛾即可产下超过1000颗卵。
3.昆虫病毒是指能引起昆虫病害的病毒。在昆虫体内增殖，但不引起昆虫发病死亡，而只是以昆虫作为传染媒介的某些动植物病毒，一般不包括在昆虫病毒的范畴内。昆虫病毒作为生物防治的重要手段之一，其优点在于特异性强、毒力高、稳定性好、安全无害，用后能引起害虫群体病毒疾病的流行传播，在相当长时间内可自然控制害虫消长，导致相继世代害虫持续带毒，感染死亡。
4.由于草地贪夜蛾可以带来的灾害，以及通过昆虫病毒在防治昆虫病害方面的优势，因此，存在着一种发现更多有效防治草地贪夜蛾的昆虫病毒的不断需求。


技术实现要素：

5.针对现有技术的不足，本发明提供了一种小地老虎nora病毒及其应用。
6.本发明的第一个方面，提供一种小地老虎nora病毒，其全基因组序列如seq id no.1所示。
7.本发明的第二个方面，提供所述的一种小地老虎nora病毒在降低草地贪夜蛾适合度中的应用。
8.进一步的，所述降低草地贪夜蛾适合度表现在减轻蛹重，增加蛹期，降低化蛹率，并增加草地贪夜蛾幼虫期和降低了成虫的羽化率。
9.本发明的第三个方面，提供一种降低草地贪夜蛾适合度的方法，用所述小地老虎nora病毒感染草地贪夜蛾。
10.本发明的第三个方面，提供一种用于降低地贪夜蛾适合度的防治剂，包括所述的小地老虎nora病毒。
11.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
12.本发明首次在小地老虎(agrotis ipsilon)中发现了一种新型的正链rna病毒。我们进一步通过高通量测序，pcr扩增获得了其全基因组序列，系统发育分析显示，该病毒是一种新型的nora病毒，我们将其命名为小地老虎nora病毒(agrotis ipsilon nora virus)，简称ainv。nora病毒隶属于小rna病毒目(picornavirales)，在多种节肢动物中均有报道。草地贪夜蛾是我国近年来爆发的重要农业害虫，为了探讨ainv在草地贪夜蛾防治中的作用，我们将ainv转染进了草地贪夜蛾种群，分析了ainv对草地贪夜蛾适合度的影响。结果显示，ainv感染降低了草地贪夜蛾的适合度，主要表现在减轻蛹重，增加蛹期，降低化
蛹率，并显着增加草地贪夜蛾幼虫期和降低了成虫的羽化率。这些结果都表明，ainv是一种潜在的可用于草地贪夜蛾生物防治的病毒资源。
附图说明
13.图1为ainv全长cdna序列基因结构域预测。
14.图2为小核糖核酸病毒目rdrp蛋白质序列系统发育树。
15.图3为ainv对草地贪夜蛾适合度的影响。
具体实施方式
16.下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。如未特殊说明，下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
17.实施例1：ainv的获得和鉴定
18.采集小地老虎野外种群，通过rna提取，高通量测序，生物信息分析筛选获得了ainv的基因组信息，进一步通过系统发育分析对其进行了物种鉴定。
19.具体方法如下：
20.1、rna提取
21.使用trizol试剂(invitrogen,carlsbad,ca,usa)从小地老虎种群不同发育时期中提取总rna，卵和幼虫(n＝30)、蛹(n＝30)和成虫(n＝30)。利用agilent2100生物分析仪(agilent technologies，palo alto，ca，usa)和无rnase的琼脂糖凝胶电泳上评估rna的质量。使用ribo
‑
zerotm磁性试剂盒(epicentre，madison,wi,usa)去除rrna来富集rna样品中的mrna。
22.2、高通量测序和分析
23.mrna文库随后由bgi(中国深圳)制备，并在illumina hiseq 2000平台上测序。使用soapdenovo软件进行从转录组组装。srna 病毒(txid 439488)、dsrna病毒(txid 35325)和delta病毒(txid 39759)的蛋白质序列是从ncbi refseq数据库中获得，构建本地blast数据库，序列比对使用阈值为1
×
10
‑5。
24.3、ainv全基因组组装和物种鉴定
25.使用3'和5'cdna末端快速扩增(race)系统(life technologies,carlsbad,ca,usa)获得ainv的全长cdna序列(如seq id no.1所示)，并对其基因结构域进行了预测(图1)。进一步通过序列比对，利用iq
‑
tree 1.6.6软件构建了小核糖核酸病毒目rdrp(rna依赖性rna聚合酶)蛋白质序列系统发育树，结果显示ainv和已知的nora病毒聚在一支(图2)，并且和亲缘关系最近的物种在核苷酸水平上仅有85.69％的相似性，表明ainv是一个在昆虫中发现的新型nora病毒。
26.实施例2：ainv降低草地贪夜蛾适合度中的应用
27.1、ainv的富集
28.通过在野外采集(玉米田)，室内分子鉴定，我们成功建立了ainv感染的小地老虎室内种群。进一步收集ainv感染小地老虎种群4龄幼虫(1
‑
2头)，在液氮中进行研磨，然后用1ml pbs缓冲液(0.01m，ph 7.4)进行匀浆，随后在4℃，6500g，离心15分钟，上清液通过0.2μ
m注射器过滤器(pall corporation，new york，usa)过滤，在
‑
20℃进行保存。
29.2、草地贪夜蛾转染
30.使用hamilton microliter注射器(705n)将上述过滤液，约10μl，注射到3龄草地贪夜蛾幼虫中，并使用特异引物对检测ainv在草地贪夜蛾种群中的转染效果(ainv_72f:tgaccggtaccgattttctc，如seq id no.2所示；ainv_44r:cctggtatcgaccgtctgtt，如seq id no.3所示；扩增片段大小为572bp)，选择ainv阳性个体观测ainv对草地贪夜蛾适合度的影响。对照组，选择注射等体积的无菌水。结果显示(图3)，ainv感染降低了草地贪夜蛾的适合度，主要表现在减轻蛹重，增加蛹期，降低化蛹率，并显着增加草地贪夜蛾幼虫期和降低了成虫的羽化率。
31.尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
32.显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。