海藻糖衍生物及其冷冻保护剂和应用的制作方法

1.本发明涉及一种多糖衍生物，特别涉及一种多糖的共价衍生物，在细胞深度冷冻中具有保护细胞的作用，作为dmso的替代。


背景技术：

2.组织工程和再生医学被认为是修复受损组织和维持生物功能的一种很有前途的方法。在组织工程和再生医学的治疗方法中，以细胞为基础的治疗方法是最近的热点之一。这些疗法已被关注到可以用来再生受损的组织，并提供许多有益的细胞因子。特别是，在支架中植入干细胞可使干细胞维持干性。在之前的研究中，我们建立了以没食子酸接枝壳聚糖支架和间充质干细胞为基础的组织工程结构。此外，支架制造的难点是将细胞封装到支架中，以制备有活性复合生物材料；然而，采购、生长和封装的过程是非常繁琐和耗时的，难以应用于急性疾病。因此，开发一种有效的冻存保存策略，以维持组织工程结构的生物活性和功能，是现代组织工程和再生医学最重要的研究领域之一。能够保存的完整性组织工程结构不仅可以节省捐助者和接受者时间,而且也有可能建立全球高质量的组织工程结构细胞生物信息库。在准备用于临床应用的工程组织时，低温保存策略有可能实现组织工程结构的现货供应。
3.冷冻保护剂的选择是低温保存的关键。常用的冻存保护剂如二甲亚砜(dmso)对组织工程结构的低温保存有作用。然而，dmso固有的细胞毒性导致低温保存组织工程结构的风险增加，这对现有的生物活性组织工程结构在临床运用构成了重大挑战。因此，寻找生物相容性的冻存保护剂代替dmso具有重要的意义。
4.海藻糖是一种非还原性双糖，作为生物相容性冻存保护剂用于低温保存组织工程结构。但是海藻糖的细胞渗透性较低，导致其低温保存效果较差。


技术实现要素：

5.本发明的一个目的在于提供一种海藻糖衍生物，改善海藻糖作为冷冻保护剂的低温保存效果。
6.本发明的另一个目的在于提供一种冷冻保护剂，作为dmso的替代。
7.本发明的再一个目的在于提供一种冷冻保护剂用于对含有活细胞的组织工程支架实施低温保存。
8.一种海藻糖衍生物，包括海藻糖和环氧氯丙烷，海藻糖和环氧氯丙烷共价结合。
9.另一种海藻糖衍生物，按重量份，包括：
10.4～12海藻糖和3～10环氧氯丙烷，海藻糖和环氧氯丙烷共价结合。
11.另一种海藻糖衍生物，按重量份，包括：
12.4～12海藻糖和3～10环氧氯丙烷，并按如下方法制得：
13.重量份4～12海藻糖和naoh溶解在去离子水中，在65℃～75℃下反应并搅拌15分钟～45分钟，ph 11～12，得到透明粘稠的液体。然后加入重量份3～10环氧氯丙烷，静置36
小时～72小时后，用盐酸调节溶液的ph值至中性(如：ph7
±
0.2)，在去离子水中透析3天～5天，再冷冻干燥得到海藻糖衍生物。
14.本发明的海藻糖衍生物，能够进入细胞，用于细胞的冷冻保护剂，用量如：但不限于25mg/ml～100mg/ml，对冷冻细胞起到保护作用，提高细胞的存活率和复苏率，能保持干细胞的干性和分化潜能。
15.将本发明的海藻糖衍生物制成冷冻保护剂，适用于含活细胞的组织工程结构(如：支架)的低温冷冻保存，作为dmso的替代品，减少dmso的使用，将细胞的存活率和复苏率维持在较高水平，并能使冷冻的干细胞在复苏后继续保持干性和分化潜能。
16.一种冷冻保护剂，包括海藻糖衍生物、胎牛血清和dmem培养基。
17.另一种冷冻保护剂，包括25mg/ml～100mg/ml海藻糖衍生物、胎牛血清和dmem培养基。
18.另一种冷冻保护剂，包括25mg/ml～100mg/ml海藻糖衍生物、10％v/v胎牛血清和dmem培养基。
19.另一种冷冻保护剂，包括25mg/ml～100mg/ml海藻糖衍生物、10％v/v胎牛血清和90％v/v dmem培养基。
20.另一种冷冻保护剂，包括50mg/ml海藻糖衍生物、胎牛血清和dmem培养基。
21.另一种冷冻保护剂，包括50mg/ml海藻糖衍生物、10％v/v胎牛血清和dmem培养基。
22.另一种冷冻保护剂，包括50mg/ml海藻糖衍生物、10％v/v胎牛血清和90％v/vdmem培养基。
附图说明
23.图1为低温冻存的组织工程结构中间充质干细胞的存活率；
24.图2为低温冻存的组织工程结构中间充质干细胞的复苏率；
25.图3为低温冻存的组织工程结构中间充质干细胞的增殖能力；
26.图4为低温冻存的组织工程结构中间充质干细胞的集落形成能力；
27.图5为低温冻存的组织工程结构中间充质干细胞的成脂肪、成骨和成软骨三项分化能力染色和数据统计图。
具体实施方式
28.以下结合附图详细描述本发明的技术方案。本发明实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。
29.本发明没食子酸接枝壳聚糖支架的制备方法如下：
30.首先将28mmol没食子酸和2.8mmol edc溶解在40ml 70％乙醇中，并向溶液中加入2.8mmol nhs。将所得溶液在冰浴中搅拌，然后在1小时后加入分散在110ml 70％乙醇中的1.5g壳聚糖。将溶液在冰浴中进一步搅拌30分钟，最后在室温下搅拌24小时。过滤收集沉淀物，并用乙醇洗涤。用去离子水透析3天以除去可能残留的试剂后，通过真空冷冻干燥获得没食子酸接枝壳聚糖。利用没食子酸接枝壳聚糖在酸性溶液下溶解在碱性条件下不溶的物
理性质制备多孔的没食子酸接枝壳聚糖支架。首先将1g没食子酸接枝壳聚糖溶解在50ml的0.1v/v％的冰醋酸中。然后再聚四氟乙烯板每孔加入250μl没食子酸接枝壳聚糖溶液，并在
‑
20℃的冰箱中保持24小时。然后将样品在冷冻干燥器中冻干。将样品用2w/v％naoh溶液脱酸4小时，并在冷冻干燥器中冻干。最后获得没食子酸接枝壳聚糖支架。
31.本发明以下实施例采用的含间充质干细胞的组织工程结构按如下方法制得：
32.将没食子酸接枝壳聚糖支架浸泡在70％v/v的乙醇中过夜，然后在紫外线下照射12小时。之后，将没食子酸接枝壳聚糖支架与间充质干细胞(2
×
104个细胞)在24孔培养板中培养。每2天换液，培养7天后，形成组织工程结构。
33.组织工程结构中间充质干细胞的存活率的实验方法如下：
34.对制得的组织工程结构用pbs缓冲液冲洗两次，用0.25％胰蛋白酶和1mm edta消化间充质干细胞。然后将细胞离心，所得细胞悬液:台盼蓝＝1:1混合，并用血球计数板计数。细胞的存活率＝(活细胞/总细胞)
×
100。
35.对冻存的组织工程结构中间充质干细胞的存活率(survival rate,％)和复苏率(cell recovery rate,％)的实验方法如下：
36.对冻存的组织工程结构用pbs缓冲液冲洗两次。用0.25％胰蛋白酶和1mm edta消化间充质干细胞。然后将细胞离心。然后细胞悬液:台盼蓝＝1:1混合，并用血球计数板计数。细胞的存活率＝(冻存后的活细胞/冻存后的总细胞)
×
100，细胞的复苏率＝(冻存后的活细胞/冻存前的活细胞)
×
100。
37.采用cck
‑
8测定组织工程结构中间充质干细胞的再增殖能力(cell proliferation)。具体方法为：从组织工程结构中消化间充质干细胞，然后将间充质干细胞以10,000个/孔的密度接种于24孔细胞培养板中，37℃5％co2培养。用α
‑
mem培养基与cck
‑
8溶液按体积9:1混合得到cck
‑
8工作液，然后加入200μl cck
‑
8工作液与细胞孵育2小时后取出100μl的样品溶液并在450nm处测定吸光度。
38.组织工程结构中间充质干细胞的干性和三项分化能力的实验方法如下：
39.用结晶紫染色法检测组织工程结构中间充质干细胞集落形成能力。从组织工程结构上消化间充质干细胞。然后将间充质干细胞接种于6孔细胞培养板中，密度为200个/孔，37℃，5％co2培养14天。结晶紫染色前，用pbs冲洗2次，室温下4％多聚甲醛固定15分钟。加入结晶紫染色液，孵育30分钟。
40.通过成脂、成骨和软骨分化检测组织工程结构上间充质干细胞的三项分化潜能。根据制造商的说明。采用成脂培养基、成骨培养基和成软骨培养基分别介导mscgo
tm
的三项分化，研究组织工程结构冷冻后间充质干细胞的分化能力。培养21天后，用成脂、成骨和软骨染色试剂盒对细胞进行染色。用pbs冲洗2次，室温下4％多聚甲醛固定15分钟。用油红o(oil red o)、茜素红s(alzarin red s)和阿利新蓝(alcian blue)对细胞进行染色，用于成脂、成骨和软骨分化。然后用洗涤液冲洗细胞三次以去除多余的染料。然后用光学显微镜观察分化的细胞。最后，在500nm、550nm和600nm波长下分析油红o、茜素红s和阿利新蓝染色细胞的成脂、成骨和成软骨。
41.实施例1
42.组织工程结构中的间充质干细胞的存活率情况参见图1所示。
43.组织工程结构中间充质干细胞的增殖能力参见图3所示。
44.组织工程结构中间充质干细胞的集落形成能力参见图4所示，组织工程结构中间充质干细胞的三项分化能力参见图5所示。
45.实施例2
46.将组织工程结构放在含有10％dmso的胎牛血清(90％fbs)冻存管中冻存。然后将冻存管依次存放在4℃30分钟，
‑
20℃60分钟，
‑
80℃过夜，最后在液氮下存放30天。
47.冻存后的组织工程结构中的间充质干细胞的存活率情况参见图1所示。冻存后的组织工程结构中的间充质干细胞的存活率情况参见图2所示。
48.冻存后的组织工程结构中间充质干细胞的增殖能力参见图3所示，间充质干细胞的集落形成能力参见图4所示，间充质干细胞的三项分化能力参见图5所示。
49.实施例3干扰细胞共存条件下乳腺癌干细胞的电化学分析
50.4.00g海藻糖和1.82g naoh溶解在10ml去离子水中，在75℃下反应并搅拌30分钟，得到透明粘稠的液体。然后加入3.23g环氧氯丙烷。将此溶液静置，使得粘度增加。48小时后，用盐酸调节溶液的ph为7.00。在去离子水中透析3天，然后在真空中冷冻干燥得到海藻糖聚合物。
51.将制得的组织工程结构浸没在上述合成的海藻糖衍生物(25mg/ml)冻存液中并在培养箱中孵育12小时。随后将每个组织工程结构转移到无菌的1.5ml冻存管中，加入0.75ml海藻糖衍生物冻存液(25mg/ml)。然后将冻存管依次存放在4℃30分钟，
‑
20℃60分钟，
‑
80℃过夜，最后在液氮下存放30天。
52.冻存后的组织工程结构中的间充质干细胞的存活率情况参见图1所示，间充质干细胞的复苏率情况参见图2所示。
53.实施例4
54.将制得的组织工程结构浸没在实施例3制得的海藻糖衍生物(50mg/ml)冻存液中并在培养箱中孵育12小时。随后将每个组织工程结构转移到无菌的1.5ml冻存管中，加入0.75ml海藻糖衍生物冻存液(25mg/ml)。然后将冻存管依次存放在4℃30分钟，
‑
20℃60分钟，
‑
80℃过夜，最后在液氮下存放30天。
55.冻存后的组织工程结构中的间充质干细胞的存活率情况参见图1所示，间充质干细胞的复苏率情况参见图2所示。
56.冻存后的组织工程结构中间充质干细胞的增殖能力参见图3所示，间充质干细胞的集落形成能力参见图4所示，间充质干细胞的脂肪、成骨和成软骨三项分化能力参见图5中实施例4。
57.实施例5
58.将制得的组织工程结构浸没在实施例3的海藻糖衍生物(100mg/ml)冻存液中并在培养箱中孵育12小时。随后将每个组织工程结构手动转移到无菌的1.5ml冻存管中，加入0.75ml海藻糖衍生物冻存液(25mg/ml)。然后将冻存管依次存放在4℃30分钟，
‑
20℃60分钟，
‑
80℃过夜，最后在液氮下存放30天。
59.冻存后的组织工程结构中的间充质干细胞的存活率情况参见图1所示，间充质干细胞的复苏率情况参见图2所示。
60.由上述实施例比对可见，本技术提供的海藻糖衍生物对于保持冻存的组织工程支架具有高的细胞复苏率(39.56
±
2.95％～52.02
±
4.01％)和存活率(60.75
±
5.02％～
85.38
±
2.39％)，冷冻后的组织工程支架中的间充质干细胞具有干性和三项分化能力，因此，海藻糖衍生物可以作为dmso的替代品，用于低温冷冻含有细胞的组织工程支架。
61.冷冻保存液中加入50mg/ml海藻糖衍生物能将细胞的细胞复苏率和存活率维持在高水平，且经济效益也更好。