一种肠道病毒通用型核酸检测试剂盒及使用方法与流程

1.本发明涉及肠道病毒核酸检测技术领域，尤指一种肠道病毒通用型核酸检测试剂盒及使用方法。


背景技术：

2.肠道病毒属于小rna病毒科肠道病毒属，能引起人类致病的肠道病毒有多种，引起的主要疾病有手足口病、无菌性脑膜炎等。手足口病5岁以下儿童为主，尤以3岁以下儿童发病率最高，该病流行无明显的地区性，全年均可发生，一般5
‑
7月为发病高峰。引起手足口病的肠道病毒包括柯萨奇病毒a组的2、4、5、6、7、9、10、16型等，b组的1、2、3、4、5型等，肠道病毒71型及埃可病毒等。由于这些病毒引起的症状和流行特点相似，仅靠临床症状对病原进行区分非常不可靠，实验室诊断方法有病毒分离、抗原检测与核酸检测等。
3.经过检索，中国发明专利：一种肠道病毒通用型核酸检测试剂盒及其检测方法(申请号为201010105091.7，申请日为2010.02.02)，该申请案试剂盒含有：pcr反应酶，其中包括热启动taq酶、mlv逆转录酶、rna酶抑制剂；pcr反应液，其中包括depc处理水、dntps、10
×
pcrbuffer、肠道病毒通用型正向引物、肠道病毒通用型反向引物、肠道病毒通用型探针；肠道病毒通用型正向引物序列为：5
’‑
ctagggtgtccgtgtatcc
‑3’
，肠道病毒通用型反向引物序列为：5
’‑
ggcctatccaatagctatatcg
‑3’
，肠道病毒通用型探针序列为：5
’‑
aattctttaattgtgaccataagcagcgaata
‑3’
；阴性质控品，为depc处理水；阳性质控品，为制备的体外转录rna。采用实时荧光定量pcr技术检测总肠道病毒核酸序列的方法，具有特异、灵敏、快速、操作简便的优点。但是该申请案的不足之处在于没有设置内参，对于反应的质量难以把控。


技术实现要素：

4.本发明提供一种肠道病毒通用型核酸检测试剂盒及使用方法，解决现有的肠道病毒核酸检测试剂盒没有设置内参，对于反应的质量难以把控的问题。
5.本发明提供的技术方案如下：一种肠道病毒通用型核酸检测试剂盒，包括肠道病毒反应液、阳性对照液和阴性对照液。
6.优选地，所述肠道病毒反应液包括酶混合物、核苷酸混合液、10xbuffer、增强剂、冻干保护剂、肠道病毒通用型上游引物、肠道病毒通用型下游引物、肠道病毒通用型探针、内参β
‑
actin上游引物、内参β
‑
actin下游引物和内参β
‑
actin探针。
7.优选地，所述阳性对照液为肠道病毒通用型病毒样颗粒、内参β
‑
actin病毒样颗粒的混合液，所述阴性对照液为0.9％的氯化钠溶液。
8.优选地，所述肠道病毒通用型上游引物序列为ctagggtgtccgtgtatcc；
9.所述肠道病毒通用型下游引物序列为ggcctatccaatagctatatcg；
10.所述肠道病毒通用型探针序列为：
11.aattctttaattgtgaccataagcagcgaata。
12.优选地，所述肠道病毒通用型上游引物序列中的第8位碱基g为锁核酸修饰碱；
13.所述肠道病毒通用型下游引物序列中的第15位碱基c为锁核酸修饰碱基；
14.所述肠道病毒通用型探针序列中的第8为碱基t为修饰荧光基团，第23位碱基g修饰淬灭基团，第32位a碱基为磷酸化碱基。
15.优选地，所述肠道病毒通用型探中的t碱基修饰的荧光基团为fam、vic、rox、cy5、tet、joe、cy3、hex中的一种；
16.所述肠道病毒通用型探中的g碱基修饰的荧光淬灭基团为bhq1、bhq2、bhq3、tamra、dabcyl、nfq中的一种。
17.优选地，所述内参上游引物的序列为ctggcaccacaccttctacaa；
18.所述内参下游引物的序列为aaacatgatctgggtcatcttct；
19.所述内参探针的序列为ccgtgctgctgaccgaggccc，其中，第6位碱基g修饰荧光基团，第15位碱基g修饰为淬灭基团，第21位碱基c为磷酸化碱基。
20.优选地，所述肠道病毒反应液中所包含的酶混合物如下：所述肠道病毒反应液中的所包含的酶混合物如下：ung酶1
‑
10u/μl、tth dna聚合酶0.5
‑
2u/μl，vent dna聚合酶1
‑
2u/μl、taq酶2
‑
5u/μl、逆转录酶100
‑
400u/μl、rna酶抑制剂30
‑
50u/μl；
21.和/或；
22.所述肠道病毒反应液中的所包含的增强剂组合如下，mncl21.0
‑
3.0g/l，ssb单链结合蛋白0.4
‑
1.2g/l，焦磷酸酶0.2
‑
0.8g/l，氯化四甲氨0.1
‑
0.5g/l，叠氮钠0.06
‑
0.1g/l；
23.和/或；
24.所述肠道病毒反应液中的所包含的冻干保护剂组合如下如下，bsa 0.6
‑
1。0g/l，明胶0.5％
‑
2％，山梨醇糖0.5％
‑
2％，精氨酸0.8
‑
1.2g/l，葡聚糖0.5
‑
1.5g/l，海藻糖0.5
‑
1.5g/l；
25.和/或；
26.所述肠道病毒反应液中所包含的10xbuffer包括tris
‑
hcl10
‑
50mm，kcl100
‑
1000mm，mg2so420
‑
80mm；
27.和/或；
28.所述肠道病毒反应液中所包含的核苷酸混合液包括datp、dgtp、dutp和dctp，且datp、dgtp、dutp和dctp分别为0.1
‑
0.5mm。
29.本发明还公开了一种肠道病毒通用型核酸检测试剂盒非诊断方式的使用方法，使用上述所述所述的试剂盒，包括如下步骤：
30.s100、预处理，分别取出阳性对照和阴性对照，并在室温下融化，充分振荡混匀后瞬间离心；
31.s200、核酸提取：待测样本与阳性对照、阴性对照同步进行核酸提取；
32.s300、加样：取出装有肠道病毒反应液的预分装冻干八连管，加入待测样本、阳性对照和阴性对照核酸各25μl，盖紧管盖，振荡均匀后瞬时离心；
33.s400、扩增和荧光信号检测，将步骤s400得到的pcr反应管放置在荧光定量pcr仪中进行扩增和荧光信号检测；
34.s500、结合内参检测结果判断样本检测结果。
[0035][0036]
优选地，所述步骤s300中的肠道病毒反应液预分装冻干八连管包含了荧光pcr扩增所需的全部组分。
[0037]
优选地，所述步骤s400中的荧光定量pcr仪的扩增和荧光信号检测循环参数如下：
[0038][0039]
与现有技术相比，本发明提供的一种肠道病毒通用型核酸检测试剂盒及使用方法具有以下有益效果：
[0040]
1、本发明的试剂盒包括肠道病毒反应液、阳性对照液和阴性对照液。组分简单，试剂盒仅含有3部分；使用方便，反应程序快速简单，仅需35min即可完成扩增，加上提取10min，从获得样本到得到检测结果，45min内即可完成全部检测。
[0041]
2、本发明的引物探针中含有多条不同修饰方式、不同荧光标记的探针、引物，引物中个别碱基通过锁核酸的修饰，即将核糖的2
′‑
o位和4
′‑
c位通过特定的的缩水作用形成氧亚甲基桥、硫亚甲基桥或胺亚甲基桥,并连接成环形,这个环形桥锁定了呋喃糖c3
′‑
内型的n构型,降低了核糖结构的柔韧性，降低与互补碱基的结合自由能，从而稳定互补结构。通过该技术，人为调整引物探针结合自由能分布使得结合自由能呈正弦分布，不仅提高引物与模板结合的稳定性，同时大大提高了特异性。本发明中的探针有多种修饰方式，多种修饰的目的在于尽可能降低探针自身的本底信号值，提高检测的灵敏度。
[0042]
3、本发明的肠道病毒反应液中的酶混合液含有逆转录酶，tth dna聚合酶，vent dna聚合酶，taq酶，vent酶扩增效率明显高于taq酶，有利于在扩增初始阶段快速累积pcr产物，并在此基础上有taq酶进一步发挥taqman探针切割作用，给出扩增信号，从而提高反应灵敏度，tth dna聚合酶兼有逆转录酶和dna聚合酶的活性，且热稳定性好，tth酶因高温变性而失活，且本反应体系含有mn
2
离子，tth酶在延伸过程中可继续进行逆转录，从而在扩增过程中适当引入逆转录，充分利用rna模板，从而提高逆转录和扩增效率。经过大量配比及浓度优化后，试剂检测肠道病毒的灵敏度得到显著提升。
[0043]
4、本发明的肠道病毒反应液中的增强剂含有mncl21.0
‑
3.0g/l，ssb单链结合蛋白0.4
‑
1.2g/l，焦磷酸酶0.2
‑
0.8g/l，氯化四甲氨0.1
‑
0.5g/l，叠氮钠0.06
‑
0.1g/l，其中，mncl2和氯化四甲氨有助于提高扩增效率，ssb单链结合蛋白有助于稳定单链结构，焦磷酸酶有助于消除pcr过程生成的焦磷酸，从而提高pcr的持续性，bsa有助于提高酶热稳定性，增强pcr的持续性。经过大量配比及浓度优化后，试剂检测肠道病毒的信号值及灵敏度得到
显著提升。
[0044]
5、本发明的肠道病毒反应液中含有冻干保护剂，其成为含有bsa0.6
‑
1.0g/l，明胶0.5％
‑
2％，山梨醇糖0.5％
‑
2％，精氨酸0.8
‑
1.2g/l，葡聚糖0.5
‑
1.5g/l，海藻糖0.5
‑
1.5g/l。其中，bsa和明胶有助于提高酶热稳定性和冻融稳定性，增强pcr的持续性，精氨酸，山梨糖醇，葡聚糖和海藻糖有助于提高酶的冻融稳定性和构象。
[0045]
6、本发明的肠道病毒反应液为预分装冻干八连管，开封后可直接加入提取好的核酸进行上机检测。省事，省时，省力，由于加入核酸体积量大，故灵敏度高。
[0046]
7、本发明试剂盒为内源性内参，可对对样本采集、核酸提取、扩增和检测整个过程进行监控，避免因假阴性结果而导致的误判。探针为包括荧光报告基团和淬灭基团的寡核苷酸。当探针完整时，由于淬灭基团空间位置上靠近报告基团从而抑制报告基团发出荧光。引物延伸时，与模板结合的探针被taq酶(5
’→3’
外切核酸酶活性)切断，报告基团与淬灭基团分离，产生荧光信号，从而实现对肠道病毒在核酸水平上的检测。
[0047]
8、本发明通过酶混合物和增强剂组合，使得试剂盒灵敏度显著提高，各靶标灵敏度均可达75copies/ml，且检测时间大大缩短，整个检测过程仅需35分钟；通过冻干保护剂，使得试剂盒热稳定性显著增加，可于37℃稳定储存1个月，从而减少对低温运输和储存的依赖。
附图说明
[0048]
下面将以明确易懂的方式，结合附图说明优选实施方式，对一种肠道病毒通用型核酸检测试剂盒及其使用方法的上述特性、技术特征、优点及其实现方式予以进一步说明。
[0049]
图1为高低不同浓度肠道病毒样本检测的精密度效果图；
[0050]
图2为不同浓度ung酶检测含dutp产物的对比效果图；
[0051]
图3为不同聚合酶组合检测阳性样本的对比效果图；
[0052]
图4不同引物探针的修饰方法检测对比效果图；
[0053]
图5肠道病毒反应液是否含有增强剂的对比效果图；
[0054]
图6肠道病毒(ev71型)检测限检测结果图；
[0055]
图7肠道病毒(ca6型)检测限检测结果图。
具体实施方式
[0056]
本发明提供一种肠道病毒通用型核酸检测试剂盒，包括肠道病毒反应液、阳性对照液和阴性对照液。
[0057]
其中，肠道病毒反应液包括酶混合物、dntps、buffer、mg2so4、增强剂、冻干保护剂、肠道病毒通用型上游引物、肠道病毒通用型下游引物、肠道病毒通用型探针、内参β
‑
actin上游引物、内参β
‑
actin下游引物和内参β
‑
actin探针。
[0058]
具体的，肠道病毒反应液中的所包含的酶混合物如下：ung酶1
‑
10u/μl、tth dna聚合酶0.5
‑
2u/μl，vent dna聚合酶1
‑
2u/μl、taq酶2
‑
5u/μl、逆转录酶100
‑
400u/μl、rna酶抑制剂30
‑
50u/μl；
[0059]
肠道病毒反应液中的所包含的增强剂组合如下，mncl21.0
‑
3.0g/l，ssb单链结合蛋白0.4
‑
1.2g/l，焦磷酸酶0.2
‑
0.8g/l，氯化四甲氨0.1
‑
0.5g/l，叠氮钠0.06
‑
0.1g/l；
[0060]
肠道病毒反应液中的所包含的冻干保护剂组合如下如下，bsa 0.6
‑
1。0g/l，明胶0.5％
‑
2％，山梨醇糖0.5％
‑
2％，精氨酸0.8
‑
1.2g/l，葡聚糖0.5
‑
1.5g/l，海藻糖0.5
‑
1.5g/l；
[0061]
10xbuffer如下，tris
‑
hcl10
‑
50mm，kcl 100
‑
1000mm，mg2so420
‑
80mm；
[0062]
核苷酸混合液如下，datp，dgtp，dutp和dctp分别为0.1
‑
0.5mm。
[0063]
具体实施时，肠道病毒反应液的具体配方具体如表1所示：
[0064][0065]
表1
[0066]
其中，阳性对照液为肠道病毒通用型病毒样颗粒、内参β
‑
actin病毒样颗粒的混合液，阴性对照液为0.9％的氯化钠溶液。
[0067]
其中，肠道病毒通用型的引物探针序列如下：
[0068]
肠道病毒通用型上游引物序列为ctagggtgtccgtgtatcc；
[0069]
肠道病毒通用型下游引物序列为ggcctatccaatagctatatcg；
[0070]
肠道病毒通用型探针序列为：
[0071]
aattctttaattgtgaccataagcagcgaata。
[0072]
肠道病毒通用型上游引物序列中的第8位碱基g为锁核酸修饰碱；肠道病毒通用型下游引物序列中的第15位碱基c为锁核酸修饰碱基；肠道病毒通用型探针序列中的第8为碱基t为修饰荧光基团，第23位碱基g修饰淬灭基团，第32位a碱基为磷酸化碱基。肠道病毒通用型探中的t碱基修饰的荧光基团为fam、vic、rox、cy5、tet、joe、cy3、hex中的一种；肠道病毒通用型探中的g碱基修饰的荧光淬灭基团为bhq1、bhq2、bhq3、tamra、dabcyl、nfq中的一种。
[0073]
内参上游引物的序列为ctggcaccacaccttctacaa；
[0074]
内参下游引物的序列为aaacatgatctgggtcatcttct；
[0075]
内参探针的序列为ccgtgctgctgaccgaggccc，其中，第6位碱基g修饰荧光基团，第15位碱基g修饰为淬灭基团，第21位碱基c为磷酸化碱基。
[0076]
内参引物的tm值在55
‑
60℃之间，gc含量在30
‑
80％，两条引物的tm值差异小于5℃；扩增长度50
‑
150bp之间；引物3’末端自身错配小于3bp；引物在非靶标序列中，无特异结合位点，或特异结合区域大于1000bp。探针的tm值在60
‑
70℃之间，gc含量在30
‑
80％；探针的5’端第一个碱基不能为g；探针无大于3bp的发夹结构。
[0077]
本实施例修饰的的内参是对样本本身内参的检测，在样本中含有天然的人脱落细胞，因此含有大量的内参基因，由于内参基因独立于诺如病毒，因此无论样本中是否含有诺如病毒，其内参均为阳性。本实施例修饰的内参会参与样本采集到rt
‑
pcr的过程，可用于对样本采集、保存和运输以及核酸提取过程和扩增过程进行监控，避免假阴性判读结果的出现，而现有的呼吸道病毒检测试剂中的内参为外源的含有内参基因片段的慢病毒，不参与提取，只参与扩增，这样只能指示扩增的结果是否正常，完全不能避免样品采集，保存运输和核酸提取过程有误而导致的阴性结果的出现。
[0078]
一种肠道病毒通用型核酸检测试剂盒非诊断方式的使用方法，包括如下步骤：
[0079]
s100、预处理，分别取出阳性对照和阴性对照，并在室温下融化，充分振荡混匀后瞬间离心；
[0080]
s200、核酸提取：待测样本与阳性对照、阴性对照同步进行核酸提取；
[0081]
s300、加样：取出装有肠道病毒反应液的预分装冻干八连管，加入待测样本、阳性对照和阴性对照核酸各25μl，盖紧管盖，振荡均匀后瞬时离心；
[0082]
s400、扩增和荧光信号检测，将步骤s400得到的pcr反应管放置在荧光定量pcr仪中进行扩增和荧光信号检测；
[0083]
s500、结合内参检测结果判断样本检测结果。
[0084]
具体判断步骤如下表：
[0085]
[0086]
具体的，步骤s300中的肠道病毒反应液为预分装冻干粉。
[0087]
具体的，步骤s400中的荧光定量pcr仪的扩增和荧光信号检测循环参数如下：
[0088][0089][0090]
阈值设定：根据分析后图像调节baseline的start值、end值以及threshold的value值(start值建议设在3～15、end值建议设在5～20，同时调整阴性对照的扩增曲线平直或低于阈值线)，点击analysis自动获得分析结果，在report界面察看结果。
[0091]
检测结果的判定标准如下：
[0092]
1、质控标准
[0093]
以下要求需在同一实验中同时满足，否则本次实验无效。
[0094] fam通道(肠道病毒)rox通道(内参)阴性对照undetundet阳性对照ct≤35ct≤35
[0095]
2、结果判读
[0096]
①
在仪器正常，阳性对照、阴性对照和内标对照检测结果符合
[0097]
质控标准的情况下，进行待测样本检测结果的分析与判读。
[0098] fam通道rox通道结果判读1ct≤40ct≤40肠道病毒阳性2undetct≤40阴性
[0099]
②
复测：如果fam通道ct＞40，内标ct≤40，则判定结果位于
[0100]
实验灰区，应对样本进行复检。复检结果若一致，结果为阳性；
[0101]
若无ct值，内标ct≤40，则判定结果为阴性。
[0102]
本实施案例的试剂盒包括有双色荧光、内参、肠道病毒fam、内参rox通道。阴形参考品为氯化钠，阳性参考品为含肠道病毒通用和rnase p基因特异性片段的病毒样颗粒。明确可检测柯萨奇病毒a组的2、4、5、6、7、9、10、16型等，b组的1、2、3、4、5型等，肠道病毒71型及埃可病毒。
[0103]
针对肠道病毒的探针标记fam，针对内参基因的探针标记rox，可以在同一反应体系中检测是否感染肠道病毒以及通过内参对样本整个过程进行监控，避免假阴性判读结果的出现。探针为包括5’端报告基团和3’端淬灭基团的寡核苷酸。当探针完整时，由于淬灭基团靠近报告基团而极大降低了报告基团发出的荧光。引物延伸时，与模板结合的探针被taq酶(5
’→3’
外切核酸酶活性)切断，报告基团与淬灭基团分离，产生荧光信号，从而实现对肠道病毒在核酸水平上的检测。
[0104]
pcr反应过程中，若待检样本包含肠道病毒，则标记fam的探针产生荧光信号。另
外，每个反应中含有内参基因，则标记的rox的探针应产生荧光信号，用于监控样本采样、样本运输、核酸提取、pcr扩增等，避免出现假阴性的检测结果。具体的，当检测结果为阴性时，可能是采样没成功、核酸提取失败、运输不当、pcr扩增中配液或加样等操作过程出错导致的假阴性，如果此时的试剂中包括内参，内参通道扩增曲线正常，那么以上这些可能的原因均可以排除，进而避免了从采样到检测中可能的出现的因操作不当导致的假阴性结果的判读。
[0105]
实施例1
[0106]
取107copies/ml和5
×
103copies/ml浓度的ev71型肠道病毒，分别采用本发明专利重复检测10次，结果如图1所示，表明本试剂盒精密度效果良好。
[0107]
实施例2
[0108]
取来自不同地区临床肠道病毒71型病毒、柯萨奇病毒a16型病毒、柯萨奇病毒a2型病毒、柯萨奇病毒a4型病毒、柯萨奇病毒a5型病毒、柯萨奇病毒a6型病毒、柯萨奇病毒a7型病毒、柯萨奇病毒a12型病毒、柯萨奇病毒a9型病毒、柯萨奇病毒a10型病毒、柯萨奇病毒b1型病毒、柯萨奇病毒b2型病毒、柯萨奇病毒b3型病毒、柯萨奇病毒b4型病毒、柯萨奇病毒b5型病毒、埃可病毒30型病毒阳性样本各3例，经阴性临床样本保存液稀释至50copies/ml其检出率均为90
‑
100％，结果如下表2所示，表明本发明专利检测不同型别的肠道病毒均可满足最低检测限要求的检出率，其中以ev71型与ca6型病毒检测限重复20次扩增效果如图6和图7所示，而对于其病毒的检测效果扩增图由于篇幅问题，就不在此一一附上。
[0109][0110]
表2
[0111]
实施例3
[0112]
本实施例检测其他病原体的特异性检测效果如下表3所示。检测其他常见病原体均为阴性，表明本发明特异性良好。
[0113][0114][0115]
表3
[0116]
试剂盒通过检测添加了内源性干扰物质血红蛋白、粘蛋白、白细胞、乳铁蛋白和外
源性干扰物质布洛芬、肾上腺素、地塞米松、利巴韦林的临床临界阳性样本中均无干扰，如下表4所示。
[0117][0118][0119]
表4
[0120]
实施例4
[0121]
在本实施例中，通过在体系中加入不同浓度的ung酶：浓度1(4.0u//μl)、浓度2(6.0u//μl)、最佳浓度(5.0u/μl)，以1
×
104copies/ml的含du的产物为模板进行扩增，结果显示，最佳浓度ung酶无扩增曲线，表明5u/μl的ung酶能够消除不高于1
×
104copies/ml的产物的污染，起到防污染的效果，检测结果如图2所示。
[0122]
实施例5
[0123]
本实施例中通过设置4种不同的dna聚合酶组合方式，分别为体系中加入taq酶 tth酶(组合1)、taq酶 vent酶 tth酶(组合2)、taq酶 vent酶(组合3)、仅含taq酶(组合4)4种组合，对比检测肠道阳性样本，对比检测结果如下图。从图3中可知，体系中同时加入taq酶、vent酶和tth酶时，反应体系扩增效果最佳，其扩增曲线荧光强度和ct值明显优于其他组合。
[0124]
实施例6
[0125]
本实施例中设置3种不同引物探针的修饰方法组合，进行对比评价，以肠道病毒通用型引物探针的修饰组合为例进行案例实施，修饰组合方法如下表5所示。
[0126]
[0127][0128]
表5
[0129]
3种修饰组合对比来看，修饰1的引物探针信号值及扩增曲线均明显好于其他修饰方法，以肠道病毒通用型引物探针的不同修饰方式下的检测结果见图4。本实施例的修饰方法极大改善了体系扩增的效率问题，提升检测灵敏度和信号值，其扩增曲线荧光强度明显优于其他组合。
[0130]
实施例7
[0131]
本实施例中含有稳定增强剂，具有增强肠道病毒反应液稳定性的效果，同时也可显著提高灵敏度及信号值。具体实施步骤见图5所示的去除稳定增强剂和加入稳定增强剂的对比效果图，可明显看到无论高浓度样本还是低浓度样本，稳定增强剂均有显著提升效果，其扩增曲线荧光强度和ct值明显优于其他组合。
[0132]
实施例8
[0133]
本实施例中将肠道病毒反应液为预分装在冻干八连管中的冻干粉的操作方式，具有操作简便，上样量大的效果，稳定性更强，置于37℃条件下可稳定保存30天。实施方案中将预分装在冻干八连管中的冻干粉置于37℃条件下储存30天，与正常冻存于
‑
20℃条件保存的冻干粉的检测效果对比如图7所示，由图7可知，其扩增曲线荧光强度和ct值无明显延后，在该储存条件下的试剂稳定性良好。
[0134]
预分装在八连管中的冻干肠道病毒反应液分别在37℃和
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20℃下保存30天，对比检测3例临床样本的检测效果对比，从下表6的结果中可以看出，检测冻干粉在37℃条件下放置30天与第0天无差异，与
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20℃条件下放置30天也无差异。表明预分装在八连管中的冻干肠道病毒反应液37℃条件下储存的稳定性良好。
[0135][0136]
表6
[0137]
应当说明的是，上述实施例均可根据需要自由组合。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。