一种鸽源新城疫病毒重组疫苗株及其构建方法和应用与流程

1.本发明属于兽用生物制品领域，具体涉及一种鸽源新城疫病毒重组疫苗株及其构建方法和应用。


背景技术：

2.新城疫(newcastle disease，nd)是由新城疫病毒(newcastle disease virus，ndv)强毒株感染禽类引起的一种重要的传染病。该病是以呼吸道、消化道损伤为典型特征的高度接触性、急性败血性传染病，传播速度快，病死率高，给世界养禽业造成巨大的经济损失。世界动物卫生组织(oie)将新城疫列为法定报告的动物疫病，我国农业农村部将其列为一类动物疫病。
3.新城疫病毒ndv为单股、负链、不分节段的rna病毒，属于副黏病毒科，基因组结构为3
′‑
np
‑
p
‑
m
‑
f
‑
hn
‑
l
‑5′
。该病毒可感染240多种鸟类，其中家鸡和珠鸡最易感染，但近年来新城疫病毒感染并致病的宿主范围有扩大的趋势。
4.鸽新城疫，俗称鸽瘟，是由鸽i型副黏病毒(pigeon paramyxovirus1，ppmv
‑
1，基因vi型ndv)引起的高度接触性传染病，其临床表现与鸡新城疫非常相似。鸽新城疫于上世纪60年代在德国被发现，80年代传入我国，随着我国养鸽业的蓬勃发展，鸽新城疫已经成为威胁养鸽业的一种主要疾病，严重阻碍了我国养鸽业的健康发展。
5.疫苗免疫是预防新城疫的重要手段，目前广泛使用的新城疫疫苗主要有i系苗mukuswar、ii系苗b1、iv系苗lasota、v4活疫苗以及a
‑
vii油乳剂灭活苗和lasota油乳剂灭活苗等。这些疫苗均是为防控鸡新城疫而开发的，但目前我国尚无针对鸽新城疫的疫苗产品，养鸽场只能使用lasota等鸡新城疫疫苗对鸽群进行免疫。然而鸽i型副黏病毒ppmv
‑
1属于基因vi型ndv，与上述疫苗株遗传距离较远，且与lasota株存在明显的抗原性差异，并且在生产中免疫鸽群仍会暴发鸽新城疫，说明使用鸡新城疫疫苗防控鸽新城疫存在免疫失败的风险。鉴于此，为促进我国养鸽业健康发展，研制用于鸽新城疫防控的专用疫苗具有重要的意义。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于构建并获得一种鸽源新城疫病毒重组疫苗株及其构建方法和应用，从而解决现有技术中缺乏鸽新城疫疫苗产品的问题。
7.本发明首先提供一种用于构建鸽源新城疫病毒重组弱毒疫苗株的基因片段，所述的基因片段包含了毒性致弱的鸽源新城疫病毒的囊膜糖蛋白f蛋白基因和hn蛋白基因；
8.所述的毒性致弱的鸽源新城疫病毒的囊膜糖蛋白f蛋白基因，是将氨基酸序列为seq id no:1的f基因的位点112r
‑
r
‑
q
‑
k
‑
r
‑
f117突变为112g
‑
r
‑
q
‑
g
‑
r
‑
l117；
9.所述的hn蛋白基因，其氨基酸序列为seq id no:2；
10.更进一步的，是将hn蛋白的长度从571aa延长至577aa，其氨基酸序列为seq id no:3；
11.作为实施例的具体记载，所述的含了毒性致弱的鸽源新城疫病毒的囊膜糖蛋白f蛋白基因和hn蛋白基因的基因片段，其序列为seq id no:4；
12.更进一步的，所述的lasota株基因组是根据lasota株的全长cdna序列特点，将全长基因组分为5个片段进行扩增，并对引物对的部分片段进行相应的突变修饰，以保证克隆所使用的酶切位点的单一性，突变的碱基序列可以作为拯救病毒的分子标签，并在第一个扩增片段的5
′
上游引入t7启动子序列，在t7启动子的后面引入三个连续的g碱基来加强其转录活性，在最后一个扩增片段的3
′
端引入丁肝核酶(hdvrz)序列和t7终止子序列，将各个片段依次连接获得，其一种具体的核苷酸序列为seq id no:5；
13.本发明还提供了一种鸽源新城疫病毒重组弱毒疫苗株，其构建方法包括以下步骤：
14.1)构建包含基因ii型新城疫病毒lasota株基因组全长cdna的重组质粒；
15.2)在1)中构建的重组质粒上，用所述的用于构建鸽源新城疫病毒重组弱毒疫苗株的基因片段替换lasota株基因组的对应部分片段获得全长重组质粒；
16.3)将2)中构建的全长重组质粒与表达新城疫病毒lasota毒株np、p和l基因的真核表达质粒共转染能够表达t7聚合酶的细胞，即获得表达基因vi型f和hn蛋白的重组新城疫病毒弱毒疫苗株；
17.所述的细胞为bsr
‑
t7/5细胞；
18.作为优选，所述的鸽源新城疫病毒重组弱毒疫苗株，为新城疫病毒rla
‑
vi
‑
qh17株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为：2021年7月9日，保藏编号为：cgmcc no.21900。
19.本发明的再一个目的是提供所述的鸽源新城疫病毒重组疫苗株在制备疫苗中的应用；
20.所述的疫苗为灭活疫苗，是通过甲醛对弱毒株进行灭活。
21.本发明提供的鸽源新城疫病毒重组疫苗株是在已建立的基因ii型新城疫病毒lasota株的反向遗传操作平台基础上，将进行了致弱突变的鸽源新城疫病毒的囊膜糖蛋白f蛋白基因和hn蛋白基因片段与lasota株基因组的对应部分基因进行替换，拯救获得了鸽源新城疫病毒重组致弱疫苗株。该重组疫苗株在鸡胚中具有高生长滴度和低致病力的生物学特性，遗传稳定，对鸽源新城病毒具有良好的免疫保护效果，并能有效抑制排毒，能够用于防控目前流行的鸽源新城疫病毒，填补了我国缺少鸽新城疫防控专用疫苗产品的空白。
附图说明
22.图1为pok
‑
rlasota全长质粒构建示意图，图中倒三角形状所示为有别于野生型毒株序列而引入的分子标记(突变的单一酶切位点)；
23.图2为拯救病毒rlasota株全长cdna的突变位置的测序结果图；
24.图3为全长基因组质粒pok
‑
rla
‑
vi
‑
qh17和pok
‑
rla
‑
vi
‑
571
‑
qh17构建示意图；
25.图4为鸽源新城疫病毒重组疫苗候选株rla
‑
vi
‑
qh17和rla
‑
vi
‑
571
‑
qh17第1代、第5代、第10代、第15代与鸽源新城疫病毒qh1344/2017株f基因裂解位点测序比对结果；
26.图5为鸽源新城疫病毒重组疫苗株rla
‑
vi
‑
qh17与lasota株免疫鸽后的鸽新城疫
抗体消长曲线图；*表示该组抗体水平与rla
‑
vi
‑
qh17免疫组差异显著；**表示该组抗体水平与rla
‑
vi
‑
qh17免疫组差异非常显著；***表示该组抗体水平与rla
‑
vi
‑
qh17免疫组差异极其显著；
27.图6为鸽源新城疫病毒重组疫苗株rla
‑
vi
‑
qh17与lasota株免疫鸽后28日和35日的hi抗体检测结果；*表示该组抗体水平与rla
‑
vi
‑
qh17免疫组差异显著；**表示该组抗体水平与rla
‑
vi
‑
qh17免疫组差异非常显著；***表示该组抗体水平与rla
‑
vi
‑
qh17免疫组差异极其显著。
具体实施方式
28.本发明设计了一种表达鸽源新城疫病毒f和hn基因重组弱毒疫苗rla
‑
vi
‑
qh17的构建方法，在建立基因ii型新城疫病毒lasota株的反向遗传操作平台基础上，将中国主要流行的鸽源新城疫病毒基因vi.2.1.2.2亚型分离株qh1344/2017的囊膜糖蛋白f蛋白基因和hn蛋白基因片段与lasota株基因组的对应部分基因进行替换，同时将f蛋白的强毒裂解位点(112r
‑
r
‑
q
‑
k
‑
r
‑
f117)突变为弱毒株lasota的f蛋白裂解位点(112g
‑
r
‑
q
‑
g
‑
r
‑
l117)，并将hn蛋白的长度从571aa延长至577aa，构建出致弱的表达鸽源新城疫病毒基因vi.2.1.2.2亚型f和hn基因的全长cdna克隆质粒pok
‑
rla
‑
vi
‑
qh17，与辅助质粒共转染bsr
‑
t7/5细胞后拯救出重组鸽源新城疫病毒弱毒疫苗株rla
‑
vi
‑
qh17。
29.本发明还提供了一种所述的鸽源新城疫病毒重组弱毒疫苗株rla
‑
vi
‑
qh17的构建方法，包括如下步骤：
30.(1)构建基因ii型新城疫病毒lasota株基因组全长cdna质粒pok
‑
rlasota；
31.(2)构建重组质粒pok
‑
rla
‑
vi
‑
qh17，在pok
‑
rlasota基础上，用bgl ii和hind iii限制性内切酶切割b片段与c片段，结合同源重组的方法，将鸽源新城疫病毒qh1344/2017株的f基因和hn基因片段与lasota株基因组的对应部分基因进行替换，同时将f蛋白的强毒裂解位点(112r
‑
r
‑
q
‑
k
‑
r
‑
f117)突变为弱毒株lasota的f蛋白裂解位点(112g
‑
r
‑
q
‑
g
‑
r
‑
l117)，并将hn蛋白的长度从571aa延长至577aa，获得重组质粒pok
‑
rla
‑
vi
‑
qh17；
32.(3)重组致弱毒株rla
‑
vi
‑
qh17的拯救，将全长质粒pok
‑
rla
‑
vi
‑
qh17与表达ndv lasota毒株np、p和l基因的pci
‑
np、pci
‑
p和pci
‑
l三个真核表达质粒共转染表达t7聚合酶的bsr
‑
t7/5细胞，转染6h后添加tpck胰酶，孵育72h，将转染样品反复冻融后接种9～11日龄spf鸡胚，即获得表达基因vi型f和hn蛋白的重组新城疫病毒弱毒疫苗株rla
‑
vi
‑
qh17。
33.上述方法中，步骤(1)的pok
‑
rlasota通过以下方法构建得到：根据lasota株的全长cdna序列特点，将全长基因组分为a、b、c、d、e共5个片段。根据克隆需要设计引物对部分片段进行相应的突变修饰，以保证克隆所使用的酶切位点的单一性，突变的碱基序列可以作为拯救病毒的分子标签，并在a片段的5’上游引入t7启动子序列，在t7启动子的后面引入三个连续的g碱基来加强其转录活性，在e片段的3’端引入丁肝核酶(hdvrz)序列和t7终止子序列。随后将各个片段依次克隆到pok12载体中，构建完成基因组全长质粒命名为pok
‑
rlasota。
34.本发明的再一个目的是提供所述的鸽源新城疫病毒重组疫苗株rla
‑
vi
‑
qh17的应用。
35.含有上述表达鸽源新城疫病毒f和延长的hn蛋白基因重组弱毒疫苗株rla
‑
vi
‑
qh17的生物制品属于本发明的保护范围。
36.对重组疫苗株rla
‑
vi
‑
qh17遗传稳定性进行分析，结果表明rla
‑
vi
‑
qh17株在9～11日龄spf鸡胚中连续传代至第15代，其第1代(f1)、第5代(f5)和第10代(f10)和第15代(f15)病毒经序列测定均含有鸽源新城疫病毒的f(突变裂解位点)和hn序列，并含有构建时引入的分子标签，病毒遗传稳定性好。
37.本发明设计的鸽源新城疫病毒重组疫苗株rla
‑
vi
‑
qh17，是将鸽源新城疫病毒f蛋白的强毒裂解位点112r
‑
r
‑
q
‑
k
‑
r
‑
f117突变为弱毒株lasota的f蛋白裂解位点112g
‑
r
‑
q
‑
g
‑
r
‑
l117，并将hn蛋白的长度从571aa延长至577aa，该突变后序列能够使其毒力降低，毒株的安全性更好。
38.本发明设计的鸽源新城疫病毒重组疫苗株rla
‑
vi
‑
qh17使用鸡新城疫基因ii型经典疫苗株lasota株的np、p、m和l基因作为骨架，其保留了lasota毒株高繁殖滴度的特性，该重组疫苗株在鸡胚上表现出了优异的生长特性。
39.所述的疫苗为灭活疫苗，是通过甲醛对弱毒株进行灭活。
40.免疫保护实验结果表明，重组疫苗株rla
‑
vi
‑
qh17制备的灭活疫苗对鸽只安全且无副反应；免疫4周龄雏鸽5周后可诱导高水平的保护性抗体。免疫5周后用鸽新城疫病毒qh1344/2017强毒株进行攻毒，免疫rla
‑
vi
‑
qh17鸽只未出现任何发病症状或者死亡，免疫保护率达到100％。免疫攻毒后第3、5、7、10天，免疫rla
‑
vi
‑
qh17组鸽只的口咽及泄殖腔拭子均未检测出排毒，而免疫lasota组与攻毒对照组则出现不同程度的发病率、死亡率以及拭子病毒排毒检出率。
41.下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。
42.实施例中所记载的具体实验方法，若未特别指明，均为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂公司购买得到的。
43.实施例1：lasota株的拯救
44.1、病毒纯化
45.病毒的纯化是为了获得单一的病毒克隆，采用有限稀释法对lasota株进行了纯化，详细步骤如下：对病毒液进行10倍倍比稀释，稀释后分别取各滴度病毒液接种9～11日龄spf鸡胚(100μl/枚)，每个稀释度接种5枚。4d后收获鸡胚尿囊液测定ha活性。选取具有ha活性的最高稀释倍数的尿囊液作为下一代纯化的病毒液。用同样的方法进行倍比稀释和鸡胚接种，对病毒连续纯化5代，分装保存第5代病毒液，将其作为原始种毒用于下一步试验。
46.2、病毒序列测定
47.以纯化后的病毒反转录基因组cdna为模板，利用设计的扩增lasota株全长序列的13对引物(表1)，对lasota基因组进行pcr扩增，同时使用3
′‑
race和5
′‑
race试剂盒测定了病毒基因组两个末端序列。通过dna star生物学软件对所测得的序列进行拼接。结果表明，ndv lasota株基因组全长为15186bp。
48.表1：lasota株ndv全基因组测序用引物表
[0049][0050][0051]
3、lasota全长cdna克隆质粒的构建
[0052]
根据lasota基因组的序列特点，通过酶切位点的筛选，将全长基因组分为5个片段
(片段a
‑
e)。设计引物扩增这5个片段(表2)，并对p基因、m基因和l基因上的三个酶切位点进行突变，以保证bgl ii和hind iii酶切位点的单一性，突变的碱基序列可以作为拯救病毒的分子标签。在a片段的5’上游引入t7启动子序列，在t7启动子的后面引入三个连续的g碱基来加强其转录活性，在e片段的3’端引入丁肝核酶(hdvrz)序列和t7终止子序列。随后将各个片段依次连接到pok12克隆载体中，构建策略如图1。在完成全长基因组克隆后进行序列测定，其核苷酸序列为seq id no:5；将构建完成且测序正确的病毒基因组质粒命名为pok
‑
rlasota。
[0053]
表2：lasota毒株基因组全长cdna克隆构建所用引物表
[0054][0055][0056]
4、辅助质粒的构建
[0057]
根据测定的lasota株基因组序列，设计引物分别扩增其编码核衣壳蛋白np、磷蛋白p和聚合酶蛋白l的开放阅读框(表3)，并将3个orf分别克隆至真核表达载体pci
‑
neo的cma启动子下游，构建3个辅助质粒pci
‑
np、pci
‑
p和pci
‑
l，经测序验证无基因突变产生。
[0058]
表3：lasota辅助质粒构建所用引物表
[0059][0060]
5、病毒的拯救
[0061]
将已构建好的全长质粒(pok
‑
rlasota)和3个辅助质粒(pci
‑
np、pci
‑
p和pci
‑
l)共同转染bsr
‑
t7/5细胞。转染6h后，更换成含2％血清、1％抗生素、5μg/ml的tpck
‑
trypsin的dmem培养基。转染72h后收获培养液及细胞，接种9～11日龄spf鸡胚(200μl/枚)，37℃孵育，3～4d后收获鸡胚尿囊液，并进行血凝(ha)试验。结果显示为ha阳性，初步表明病毒拯救成功。
[0062]
6、拯救病毒rlasota的鉴定及生物学特性分析
[0063]
提取ha阳性的病毒液rna，对拯救病毒进行全基因组序列测定。序列比对结果显示拯救病毒基因组中含有构建时引入的分子标签(突变的酶切位点，图2)，表明lasota株基因组cdna克隆成功拯救，将拯救的病毒命名为rlasota。将其继续在9～11日龄spf鸡胚中连续传至5代。检测每代的血凝效价其可达2
10
～2
11
之间。对f5代病毒液进行序列测定，结果显示，分子标签未发生回复突变，表明拯救的rlasota具有较好的稳定性。测定拯救病毒与亲本毒的鸡胚半数感染量(eid
50
)、鸡胚平均致死时间(mdt)和1日龄雏鸡脑内接种致病指数(icpi)，表4显示了拯救病毒与亲本病毒具有相同的生物学特性和致病性。
[0064]
表4：拯救病毒与亲本毒株的生物学特性表
[0065][0066]
[0067]
综上所述，本发明的新城疫病毒lasota株的反向遗传操作平台构建成功，其可作为良好的疫苗载体使用。
[0068]
实施例2重组鸽用疫苗候选种毒的拯救
[0069]
1、病毒的筛选及纯化
[0070]
选取实验室分离保存的当前中国鸽群主要流行的基因vi.2.1.2.2亚型鸽源新城疫病毒进行繁殖复壮，进而采用有限稀释法对5株毒株进行纯化，各毒株不同代次的血凝效价见表5。最终选取纯化5代后的qh1344/2017毒株，作为原始种毒用于全长cdna克隆的构建。
[0071]
表5：鸽源新城疫病毒不同毒株各代次血凝效价表
[0072][0073]
2、qh1344/2017株全长基因组序列的测定和分析
[0074]
以纯化后的qh1344/2017病毒反转录基因组cdna为模板，利用设计的扩增vi型ndv全长序列的13对引物(表6)，对qh1344/2017基因组进行pcr扩增，同时使用3’race和5’race试剂盒测定了病毒基因组两个末端序列。通过dna star生物学软件对所测得的序列进行拼接。结果表明，qh1344/2017株基因组全长为15192bp。
[0075]
表6：vi型ndv全基因组测序用引物表
[0076][0077]
3、疫苗候选株基因组全长cdna构建
[0078]
以pok
‑
lasota全长质粒为平台，设计合成该全长序列中从bgl ii酶切位点到hind iii酶切位点中间的新基因序列qh17
‑
571hn
‑
bc，共6539bp，其包含将鸽源新城疫病毒
qh1344/2017株的囊膜糖蛋白f蛋白基因和hn蛋白基因片段与lasota株基因组的对应部分基因进行替换，同时将f蛋白(seq id no:1)的强毒裂解位点(112r
‑
r
‑
q
‑
k
‑
r
‑
f117)突变为弱毒株lasota的f蛋白裂解位(112g
‑
r
‑
q
‑
g
‑
r
‑
l117)，其他序列保持不变，设计重组病毒rla
‑
vi
‑
571
‑
qh17株。
[0079]
在上述突变基础上，并同时设计合成包含将hn蛋白的长度从571aa(seq id no:2)延长至577aa(seq id no:3)的另一个新基因序列qh17
‑
577hn
‑
bc(seq id no:4)，共6539bp，设计重组病毒rla
‑
vi
‑
qh17株。
[0080]
使用bgl ii和hind iii两个限制性内切酶对pok
‑
rlasota全长质粒进行双酶切，剪切掉原来的b、c两个片段。设计引物扩增合成的目的基因qh17
‑
571hn
‑
bc和qh17
‑
577hn
‑
bc片段(表7)，将胶回收的目的片段qh17
‑
571hn
‑
bc和qh17
‑
577hn
‑
bc片段分别与酶切后的载体进行连接，构建策略如图3。在完成全长基因组克隆后进行序列测定，将构建完成且测序正确的病毒基因组质粒分别命名为pok
‑
rla
‑
vi
‑
571
‑
qh17和pok
‑
rla
‑
vi
‑
qh17。
[0081]
表7:用于扩增qh17
‑
571hn
‑
bc和qh17
‑
577hn
‑
bc片段的引物表
[0082][0083][0084]
4、疫苗候选株的拯救
[0085]
将已构建好的两个全长重组质粒(pok
‑
rla
‑
vi
‑
571
‑
qh17和pok
‑
rla
‑
vi
‑
qh17)分别和lasota病毒的3个辅助质粒(pci
‑
np、pci
‑
p和pci
‑
l)共同转染bsr
‑
t7/5细胞。转染6h后，更换成含2％血清、1％抗生素、5μg/ml的tpck
‑
trypsin的dmem培养基。转染后72h收获培养液及细胞，接种9～11日龄spf鸡胚(200μl/枚)，37℃孵育，3～4d后收获鸡胚尿囊液，并进行血凝(ha)试验。结果都显示为ha阳性，初步表明病毒拯救成功。
[0086]
5、疫苗候选株的序列鉴定和遗传稳定性
[0087]
选取ha阳性的病毒液提取rna并进行反转录后，进行全基因组序列测定。序列比对结果显示拯救病毒rla
‑
vi
‑
571
‑
qh17基因组为以lasota株为骨架，嵌合qh1344/2017株的f和hn基因，并且f基因裂解位点已突变；拯救病毒rla
‑
vi
‑
qh17基因组为以lasota株为骨架，嵌合qh1344/2017株的f和hn基因，并且f基因裂解位点已突变，hn蛋白的长度从571aa延长至577aa，表明两株病毒均获得成功拯救。
[0088]
将拯救病毒继续在9～11日龄spf鸡胚中连续传代15次。每代病毒的血凝效价均在2
10
～2
11
之间。选取第1代、第5代、第10代和第15代重组病毒的f和hn基因进行序列测定。测序结果表明，第1代、第5代、第10代和第15代重组病毒的f和hn基因均与插入的序列一致，f蛋白裂解位点也未发生回复突变(图4)，表明两株重组病毒传代过程中遗传稳定。
[0089]
6、疫苗候选株的生物学特性
[0090]
选取第15代rla
‑
vi
‑
qh17和rla
‑
vi
‑
571
‑
qh17疫苗候选株测定其eid
50
、mdt和icpi，
并以病毒lasota株和qh1344/2017株作为对照，比较病毒的毒力变化情况。表8的试验数据表明，本发明拯救的rla
‑
vi
‑
qh17和rla
‑
vi
‑
571
‑
qh17疫苗候选株毒力都明显降低，具有hn蛋白长度延长的rla
‑
vi
‑
qh17疫苗候选株相较于rla
‑
vi
‑
571
‑
qh17疫苗候选株在鸡胚中具有更高生长滴度以及对1日龄雏鸡有更低致病力的生物学特性。因此，本发明构建的rla
‑
vi
‑
qh17疫苗候选株可作为优选疫苗株用于疫苗生产。
[0091]
表8：拯救病毒与亲本毒株的生物学特性表
[0092][0093]
实施例3 rla
‑
vi
‑
qh17疫苗株对非免疫鸽安全性试验和免疫效果试验
[0094]
1、灭活疫苗的制备
[0095]
rla
‑
vi
‑
qh17疫苗株用灭菌生理盐水稀释10 000倍，接种9～11日龄spf鸡胚，每胚接0.1ml，置37℃继续孵育。将接种后24h内死胚弃去，24h～120h死胚及时放4℃，收混合样，测定制苗毒的ha为2
10.5
，病毒滴度为10
9.48
eid
50
/0.1ml。将测定好效价的新城疫病毒液导入灭活罐内，加入终浓度为0.1％的甲醛溶液使其充分混合，4℃灭活48h，期间每隔2h摇晃一次。灭活后的病毒原液按常规方法制备油佐剂灭活疫苗。按同样的方法同时制备相同剂量的lasota灭活疫苗。
[0096]
2、灭活疫苗的安全性试验
[0097]
为测定本发明实施例2拯救的rla
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vi
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qh17疫苗株对非免疫鸽的安全性，将制备的rla
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vi
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qh17灭活疫苗免疫4周龄非免疫鸽10只，每只肌肉注射疫苗0.2ml，同时设对照5只，在相同的条件下饲养，连续观察14日，记录试验鸽采食、饮水及临床情况。结果显示，鸽只免疫后疫苗吸收效果良好，免疫鸽没有出现任何局部和全身的不良反应，鸽的状态完全正常。
[0098]
3、灭活疫苗的抗体监测
[0099]
为测定本发明实施例2拯救的rla
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vi
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qh17疫苗株在非免疫鸽体内产生的抗体消长规律，将饲养于隔离器内的非免疫鸽随机分成两组，每组5只，一组为实施例3步骤1所制备的rla
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vi
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qh17灭活疫苗免疫组，一组为实施例3步骤1所制备的lasota灭活疫苗免疫组。每只鸽子肌肉注射疫苗0.2ml，分别于免疫后第1、3、5、7、9、11、13周对鸽子进行翅静脉采血分离血清，测定抗体。结果显示，两组免疫组在免疫后至13周监测期结束均可产生一定效价的抗体，rla
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vi
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qh17灭活疫苗免疫组的抗体效价明显高于lasota灭活疫苗免疫组，并且差异显著(图5)。rla
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qh17灭活疫苗免疫组在免疫后第9周免疫鸽的抗体水平达到最高，hi抗体滴度平均值为8.5log2，且其在免疫后第3周至13周均产生较高的抗体水平，说明其免
疫抗体保护期至少可达3个多月。
[0100]
4、灭活疫苗的免疫保护性试验
[0101]
为测定本发明实施例2拯救的rla
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vi
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qh17疫苗株对非免疫鸽的免疫保护效果，将饲养于隔离器内的非免疫鸽随机分成三组，每组10只，一组为实施例3步骤1所制备的rla
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vi
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qh17灭活疫苗免疫组，一组为实施例3步骤1所制备的lasota灭活疫苗免疫组，一组为对照组。免疫组每只鸽子肌肉注射疫苗0.2ml，对照组注射相同剂量的pbs。分别于免疫后28天、35天翅静脉采血分离血清，测定抗体。35天采血后，用临床分离的基因vi型野毒株强毒qh1344/2017株攻毒，每只鸽以106eid
50
剂量经肌肉注射途径进行攻毒，隔离器饲养，观察14天，每天记录鸽的发病和死亡情况，攻毒后第3、5、7、10天，采集鸽子的口咽拭子和泄殖腔拭子接种鸡胚进行病毒分离，检测排毒情况。
[0102]
结果显示，免疫组免疫28天后均可产生一定效价的抗体，免疫35天后，抗体效价明显的提高，rla
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vi
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qh17灭活疫苗免疫组的抗体效价明显高于lasota灭活疫苗免疫组，并且差异显著(图6)。
[0103]
免疫35天攻毒后，rla
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vi
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qh17灭活疫苗免疫组所有鸽子未出现任何发病或死亡，免疫保护率达到100％；lasota灭活疫苗免疫组有两只鸽子表现出歪脖、垂翅等新城疫感染症状，未有鸽子死亡；pbs组所有鸽子均发病，有一只鸽子死亡(表9)。
[0104]
表9：疫苗株的攻毒保护性试验结果表
[0105][0106]
排毒情况显示，免疫rla
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vi
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qh17灭活疫苗组的鸽子在攻毒后第3、5、7、10天均未出现排毒现象，而免疫lasota灭活疫苗组的鸽子仍有部分排毒现象，空白攻毒对照组排毒率为100％(表10)。
[0107]
表10：攻毒后各组试验鸽排毒检测结果表
[0108][0109]
综上所述，本发明所制备的灭活的鸽源新城疫病毒重组疫苗株rla
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vi
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qh17，对免疫鸽只具有良好的安全性和保护效果，具有广阔的应用前景。
[0110]
上述内容仅为本发明创造的优选实施例，不能以此限定本发明创造的实施范围，即凡是未脱离本发明技术方案的内容，依本发明创造权利要求及发明创造说明内容对以上实施例所做出的简单变化、等效变化与修饰，均仍属于本发明技术方案涵盖的范围。