一种超长效稳定的FSH及其的表达重组方法及辅助生殖技术与流程

一种超长效稳定的fsh及其的表达重组方法及辅助生殖技术
技术领域
1.本发明涉及生物制药技术领域，尤其涉及一种超长效稳定的fsh及其的表达重组方法及辅助生殖技术。
2.

背景技术：

[0003][0004]
重组人卵泡刺激素是辅助生殖技术不可缺少的工具。fsh是一种由脑垂体前叶嗜喊性细胞合成与分泌的高度糖基化蛋白，通过与受体（fshr）结合，传导下游信号实现其生物学功能。
[0005]
在国际市场上，fsh相关生物制剂以重组类产品为主导。目前主要是德国默克雪兰诺（merck serono）的gonal
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f以及美国默克（merck & co.）的puregon占据着主要地位。传统的fsh产品在人体内半衰期较短（约2小时），进行辅助生殖治疗的患者需要在8
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12天的疗程中每天皮下注射1次fsh。这种相对比较频繁的给药方案。美国默克公司生产的fsh
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ctp长效fsh，其将体内半衰期约69小时，但仍不能满足ivf等辅助生殖治疗一个疗程（8~12天）的需要。国产的fsh则主要由丽珠集团的尿源产品占据市场，该产品价格较为便宜，且临床疗效与重组产品相当，但存在原材料来源不稳定、尿液供体带来的安全风险等问题。
[0006]


技术实现要素：

[0007]
本发明的目的是为了解决现有技术中传统的fsh产品在人体内半衰期较短的技术问题。
[0008]
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：一种超长效稳定的fsh，所述fsh的α链的氨基端及β链的羧基端分别融合了ctp，所述ctp为马或者斑马的ctp。
[0009]
优选的，所述fsh的α链的氨基端及β链的羧基端还融合了fc。
[0010]
优选的，所述fc通过hibit及lgbit的组合融入在所述fsh上α链和fsh上β链中。
[0011]
本技术还提供了一种超长效稳定的fsh的表达重组方法，用于上述所述的超长效稳定的fsh的表达重组方法，利用ecgctp糖基化保护药物蛋白免于蛋白酶的快速降解；利用fc增大分子量免于体内的快速滤过，利用荧光素酶大小亚基的极高亲和力提高异源二极体的产量，利用荧光素酶大小亚基的极高亲和力提高异源二极体的稳定性。
[0012]
上述所述的超长效稳定的fsh，其在小鼠体内实验过程中的半衰期大于96小时，可以满足在8
‑
12天的在体外生殖治疗过程中只注射1
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2次的要求，降低了给药复杂性，避免了由于药物反复注射引起的副作用，实现了真正的长效。
[0013]
附图说明
[0014]
图1为fsh与fshr的晶体结构；图中显示了fshα，fshβ和fshr三者的相对空间位置。
[0015]
图2为本技术中ecgctp融入fshα链的氨基端及α链的羧基端的生物学活性比较，其中
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表示ecgctp融入fshα链的氨基端,
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表示ecgctp融入fshα链的羧基端；图3为本发明一实施方式中一种超长效稳定的fsh的结构示意图；结构图中具体显示了ecgctp融入fshα链的具体位置图4为本发明另一实施方式中一种超长效稳定的fsh的结构示意图；该结构中含有fc和ecgctp。
[0016]
图5为本发明再一实施方式中一种超长效稳定的fsh的结构示意图；该结构中在结构三的基础上添加了高亲和力荧光素酶大小亚基hibit和lgbit。
[0017]
图6为本发明中一实施方式中一种超长效稳定的fsh的效率及效能比较图；
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为标准品，
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为含有fc和ecgctp的fsh，具体结构为图4结构三。
[0018]
图7为本发明中结构三与结构四的fsh的回收效率柱状图；图8 为本发明一实施方式中一种超长效稳定的fsh的半衰期折线图。具体为表达纯化的结构四，体内的半衰期测定。
[0019]
部分英文释义：fsh：卵泡刺激素，是垂体前叶嗜碱性细胞分泌的一种激素，成分为糖蛋白；fshr：fsh受体ecg：孕马血清促性腺激素ctp：人绒毛膜促性腺激素β亚基羧基末端肽fc: 人免疫球蛋白igg重链fc段hibit：荧光素酶高亲和力小亚基；lgbit：荧光素酶大亚基。
[0020]
具体实施方式
[0021]
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，以下结合具体实施例，对本发明作进一步地详细说明。
[0022]
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是，本发明还可以采用不同于在此描述的其他方式来实施，因此，本发明并不限于下面公开说明书的具体实施例的限制。
[0023]
鉴于fsh与fshr的晶体结构已经解析，请参阅图1，从图中可见，fshα的羧基端深入fshr的结构里，若在羧基端再加入融合蛋白，很明显会推开fshr，降低fsh与fshr的亲和力。而fshα的氨基端则是自由延伸到整个结构外的。在这个方向上添加基团明现会对三聚体结构影响较小。根据分子设计发现在在fshα链的氨基端的自由空间比羧基端的更大，融合标签对fsh与其受体fshr的结合产生的影响更小。fsh β链的氨基端和羧基端的自由空间都比较大，任一方向融入其它标签对fsh结合fshr影响都不大。请参阅图2，可以看出，在fshα链的氨基端融入蛋白其生物学活性比在fshα链的羧基端融入蛋白要好。
[0024]
因此本技术提供了一种超长效稳定的fsh，请参阅图3，所述fsh 的α链的氨基端及β链的羧基端分别融合了ctp，所述ctp为马或者斑马的ctp，形成如结构一及结构二所示的
fsh。根据文献报导，fsh的半衰期约为2小时，人绒毛膜促性腺激素（hcg）半衰期约35小时，但是孕马血清促性腺激素（ecg）半衰期高达4天。比对发现人，马和斑马的绒毛膜促性腺激素的β亚基，在羧基端含有更丰富的可被糖基化的氨基酸，马和斑马的绒毛膜促性腺激素β亚基上可被糖基化的氨基酸是人的绒毛膜促性腺激素β亚基上可被糖基化的氨基酸的两倍，使用马或者斑马绒毛膜促性腺激素β的亚基的羧基端极大的提高了fsh体内的半衰期。
[0025]
在一实施方式中，请参阅图4，所述fsh 的α链的氨基端及β链的羧基端分别融合fc，形成如结构三所示的fsh，在fshα和fshβ链中接入fc用于延长fsh的半衰期。
[0026]
由于fc与fc之间的亲和力很强，这样，在实际生产过程种，理论上可以有fshαfc
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fshαfc，fshβfc
‑ꢀ
fshβfc和fshαfc
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fshβfc三种组合。约有一半的二聚体为同源二聚体，同源二聚体是没有功能的。在实际生产过程中，将导致生产效率下降；在一实施方式中，请参阅图5，所述fc通过hibit及lgbit的组合融入在所述fsh上α链和fsh上β链中，形成如结构四所述的fsh，通过在二聚体结构中，加入亲和力高的荧光素酶hibit和lgbit大小亚基组合，极大的提高异源二聚体的聚合效率，减少了同源二聚体的无效生产（图7）；具体的，请参阅图7，在都有fc融入fshα和fshβ链时，结构三中有功能的异源二聚体的产量约为60%，其它40%为α
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α，β
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β没有功能的同源二聚体。但是，在结构三的基础上进一步引入高亲和力荧光素酶大小亚基hibit和lgbit后，得到结构四，这时细胞表达的有功能的异源二聚体的产量高于90%，α
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α，β
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β没有功能的同源二聚体将为10%以下。同时，fshα和fshβ链之间的结合不涉及二硫键，主要依赖于弱键结合，相对松散。通过应用荧光素酶hibit和lgbit大小亚基分别融入fcα链和fcβ链，荧光素酶hibit和lgbit大小亚基的亲和力极强。因此可以增加异源二聚体的稳定性。
[0027]
本技术还提供了一种超长效稳定的fsh的表达重组方法，用于上述所述的超长效稳定的fsh的表达重组方法，利用ecgctp糖基化保护药物蛋白免于蛋白酶的快速降解；利用fc增大分子量免于体内的快速滤过，利用荧光素酶大小亚基的极高亲和力提高异源二极体的产量，利用荧光素酶大小亚基的极高亲和力提高异源二极体的稳定性。
[0028]
验证实验：1 蛋白表达纯化hek 293 细胞共转染fshα和fshβ链表达质粒，培养48小时候，取培养上清，加入2m咪唑溶液使终浓度为20mm。0.45μm的滤膜简单过滤去杂质。取1ml镍琼脂糖凝胶镍nta琼脂糖凝胶装柱，平衡，上样，洗脱分部收集。elisa his标签抗体确定目标蛋白收集液，用生理盐水超滤换液去咪唑。进一步用elisa his标签抗体确定目标蛋白浓度备用。部分表达的fsh蛋白结构见图3，4和5。fsh蛋白的效果见图2，6，7和8。
[0029]
2 体外fsh活性实验首先构建稳定fsh受体内表达细胞株，利用fsh诱导fsh受体内在化，进而染色fsh受体，利用高内涵图像分析计算细胞内fsh受体颗粒数确定fsh的活性。结构三和标准品活性比较实验结果如图6所示。
[0030]
3 小鼠体内给药测量半衰期小鼠约30克每只，每组6只，皮下注射约200μl 稀释好的fsh，终浓度约为33
µ
g/kg。
[0031]
4 血液采集与体内血液中fsh浓度半衰期的测定注射前设为0小时，注射后间隔 2, 4, 6, 24, 48, 72, 96, and 120 h 尾静脉
采血40 μl。
[0032]
应用hibit荧光素检测试剂盒根据其说明书完成。化学发光荧光值值越高，对应样品中fsh含量越多。
[0033]
通过图8可以看出在小鼠体内实验过程中，结构四所述的fsh的半衰期大于96小时。是目前已知长效fsh中表现最优异的。可以满足在8
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12天的在体外生殖治疗（如ivf）过程中只注射1
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2次的要求，降低了给药复杂性，避免了由于药物反复注射引起的副作用，实现真正的“长效”。
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以上所述仅为本发明的实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的权利要求范围。