一种用于化疗药物敏感性和耐药性测试的微流控装置的制作方法

1.本实用新型属于生物微流控芯片技术领域，基于流体力学原理、物质传输原理及微加工技术，具体涉及一种用于化疗药物敏感性和耐药性测试的微流控装置。


背景技术：

2.癌症是威胁人类生命健康的主要杀手。化疗是目前治疗癌症最有效的手段之一。相比于手术和放疗两种局部治疗手段，化疗是一种全身治疗的手段，化疗药物通过血液循环触及全身绝大部分器官和组织。对于有全身传播倾向的肿瘤及已经转移的中晚期肿瘤，化疗时主要的治疗手段。然而，由于患者个体特异性，同样的药物治疗可能得到完全不同的效果，且患者还需承受化疗药物毒性威胁，给患者带来痛苦和经济负担，增加了治疗成本。因此，在开展化疗前针对个体患者进行相应癌症的化疗药物敏感性和耐药性测试至关重要。
3.现有化疗药物敏感性和耐药性测试方法主要有三种，即临床试验、动物模型实验和体外肿瘤药敏实验。临床试验以患者本身作为试验对象，研究进展缓慢，在体影响因素极多，存在伦理和技术上诸多限制。动物模型可以一定程度上排序影响因素，但操作复杂，实验周期长、成本高，且也存在伦理上的争论；并且小鼠、猴及其他动物等均有别于人类，不能充分反映人体情况。近年来，体外肿瘤药敏试验方法得到了一定发展，常用方法有人体肿瘤细胞集落形成实验(htca)、四唑蓝比色法(mtt)、三磷酸腺苷生物发光法(atp
‑
tca)、微组织块培养法(hdra)以及胶原凝胶液滴包埋培养药物敏感性实验法(cd
‑
dst)等。体外肿瘤药敏试验结果确实对肿瘤化疗药物的耐药性具一定参考价值，可指导临床用药、提高化疗药物的疗效，减少副作用。然而，这些方法仍依托于二维细胞静态培养模式，与在体的三维动态培养环境有明显差异。同时，肿瘤体外药敏试验具有费时、费力、操作复杂的限制，并具有较高实验技术门槛。此外，体外药敏试验产品难以进行标准化生产，不同实验室的测试结果差异性较大，不易推广应用。
4.近二十年来，微流控芯片技术不断发展，已广泛应用于生物，医学，化学和环境等领域。因结构微型化，样本微量化、流量控制精准化、加工成本低等特点，微流控芯片技术具有构建肿瘤化疗药物药敏性和耐药性测试提供理想平台。近年来，研究人员已经着手构建基于微流控芯片技术的肿瘤化疗药物评估装置，比如一种用于药物筛选的集成化微流控芯片及其应用(专利号：2019101900749)、一种用于药物筛选的集成化微流控芯片及其应用方法(专利号：2015105237836)和一种实现细胞三维培养以及药物筛选的微流控芯片及应用(专利号：2018116276397)等。但这些已有的装置中所涉及的加载方法一般采用有源压力泵及外部控制系统实现流量控制，装置和系统体积庞大，不便整体放置于培养箱中进行长时间的细胞培养。由于肿瘤细胞对药物浓度特别敏感，需要构建片上浓度生成器以实现多肿瘤细胞群的多浓度同步加载，且耐药性测试周期可达至十数天，这意味着细胞培养的同时需同步进行长时间化疗药物加载。此外，虽然目前市面上已出现了高度集成的片上细胞培养系统，如用于肝癌化疗药物筛选的三维培养系统(专利号：2014100123980)和一种膀胱肿
瘤化疗药物筛选的芯片器官模型及制作方法(专利号：2019112035095)，但其加工成本较高，不易推广。有鉴于此，亟需开发一种成本低廉、可拆卸安装、操作简便且易标准化生产的卵巢癌化疗药物敏感性和耐药性测试微流控装置。


技术实现要素：

5.本实用新型旨在提供一种成本低廉、操作简便且易标准化生产的化疗药物敏感性和耐药性测试微流控装置。本发明将小型医用输液器、浓度梯度生成器及独立的细胞培养装置三者组合，构建可置于常用细胞培养箱的体积小、无源、操作简便的细胞培养与药物同步加载系统。可以结合三磷酸腺苷生物发光法(atp
‑
tca)技术，可用于化疗药物敏感性和耐药性的定量研究。
6.本实用新型的技术方案如下：
7.一种用于化疗药物敏感性和耐药性测试的微流控装置，该微流控装置包括输液装置a、浓度梯度生成器b和细胞培养装置c；
8.所述的输液装置a包括两个小型医疗输液器，每个小型医疗输液器包括进气管、输液管和输液瓶；
9.所述的浓度梯度生成器b为塔状结构，多级传输；浓度梯度生成器b的入口端设置两个入口，分别与输液装置a的两个输液管出口相连通，用于灌注细胞培养基和化疗药物溶液；浓度梯度生成器b的出口端设有多个出口，出口数量与细胞培养装置c的细胞入口数量一致；
10.所述的细胞培养装置c，其入口端的细胞入口与浓度梯度生成器b的出口相连通，将浓度梯度生成器b中的细胞培养基和化疗药物溶液注入到细胞培养装置c的各个细胞入口中；所述的细胞培养装置c的出口端设置一个溶液出口。
11.本实用新型的有益效果：本实用新型可成功实现在体外进行不同药物浓度梯度下的培养后对卵巢癌细胞生长抑制，并以此来判定各化疗药物对卵巢癌细胞的敏感性和耐药性；本实用新型无需外接昂贵复杂且体积大的注射泵、成本低廉、操作简便、可拆卸连接且易标准化生产，结合荧光显微镜成像系统可实现对共培养细胞的实时监测；体外模型可以观察到体内无法观察到的现象，对实现个性化、精准化治疗方案及纳米医学的发展都有很大的帮助。
附图说明
12.图1是输液装置a的结构示意图。
13.图2是微流控芯片结构图，由浓度梯度生成器b和细胞培养装置c两部分组成。
14.图3是浓度梯度生成器b，以及局部放大图。
15.图4是细胞培养装置c结构图。
16.图5是用于化疗药物敏感性和耐药性测试的微流控装置示意图(包含细胞状态检测装置d)。
17.图中：a输液装置；b浓度梯度生成器；c细胞培养装置；d细胞状态监测装置；a点为输液瓶内液面所处位置；b点为输液管针头所处位置；c点为滴注管液体流出位置；q小型医用输液器进气管口；1
‑
1、1
‑
2分别为两个小型医用输液器的输液管出口；2
‑
1、2
‑
2浓度梯度
生成器第一、二入口；2
‑
3、2
‑
4、2
‑
5、2
‑
6、2
‑
7、2
‑
8、2
‑
9、2
‑
10、2
‑
11浓度梯度生成器第一、二、三、四、五、六、七、八、九出口；3
‑
1、3
‑
2、3
‑
3、3
‑
4、3
‑
5、3
‑
6、3
‑
7、3
‑
8、3
‑
9细胞培养装置第一、二、三、四、五、六、七、八、九细胞入口；3
‑
10溶液出口。
具体实施方式
18.下面将结合具体实施例和附图对本实用新型的技术方案进行进一步的说明。
19.本实用新型的一种用于化疗药物敏感性和耐药性测试的微流控装置包括输液装置a和微流控制芯片(浓度梯度生成器b和细胞培养装置c)。
20.如图1和图5所示，输液装置a包括进气管、输液管和输液瓶，输液管出口1
‑
1和1
‑
2和浓度梯度生成器b中“圣诞树”型微通道“树顶”端的两个入口2
‑
1和2
‑
2相通，用于灌注细胞培养基和化疗药物溶液。
21.如图2和图3所示，浓度梯度生成器b是微流控芯片的前半部分，是一个结构上下对称的“圣诞树”结构，包括2个入口2
‑
1和2
‑
2，9个出口2
‑
3到2
‑
11。
22.如图2和图4所示，细胞培养装置c是微流控芯片的后半部分，由9个细胞入口3
‑
1到3
‑
9和一个溶液出口3
‑
10构成，浓度梯度生成器b和细胞培养装置c之间用微通道管相连。
23.所述的小型医用输液器进气管口q处的压强始终保持与外界大气压相同，又因输液管针头所处位置与q点的高度相差不大，所以也可以认为针头处的压强亦始终等于大气压强；往输液瓶中加入液体，液体下方滴注管部会封闭一段空气柱，满足气体状态方程：
24.p1v1＝c1(1)
25.其中，p1为气体压强，v1为气体体积，c1是常数。设a点为输液瓶内液面所处位置；b点为输液管针头所处位置；c点为滴注管液体流出位置；若液面高度高于输液管针头所处位置，则由于重力作用液体从b点流出，输液瓶中的水面下降，水面上方密闭的气体体积增大，气体压强减少，液体下流的速度就会减慢，导致容器内c点的水平面压力小于外界大气压，外界气体会在大气压的作用下通过q口补气。
26.设c点的高度为h
c
＝0，b点的高度为h
b
，a和b两点之间的距离为δh，液体从c点流出的速度大小根据伯努利方程进行求解：
[0027][0028]
其中，c2为常数，v2为流体中某点的流速，h2为流体中该点的高度，p2为该点的压强，ρ为流体密度，g为重力加速度；
[0029]
设c点的压强为p
c
，c点流速为v
c
，b点的压强为p
b
，b点流速为v
b
，则根据用伯努利方程(2)得：
[0030][0031]
其中b点处与c点处均与大气接触，所以p
b
＝p
c
＝p
atm
。p
atm
为大气压强。由于整个容器的横截面面积远大于c点的面积，根据连续性方程，v
b
＜＜v
c
，故认为v
b
＝0。将前述条件代入公式(3)，即求得c点处液体流动速度为：
[0032][0033]
由公式(4)得：当δh>0时，h
b
是恒定的，此时溶液从c孔流出的速度是恒定的，其大
小取决于h
b
的大小。
[0034]
当液体由输液瓶b点流出经过滴注管口c点时，由于滴注管口顶部的接头被液体封闭，因此封闭在滴注管内的空气由于其弹性作用，可将输液瓶因加气循环所产生的波动流转变为定常流，起到类似滤波的作用，如需要调节滴注管内空气柱的高度，则可通过打开接头进行调节。滴注管的顺应性可以通过如下的公式进行计算：
[0035][0036]
其中，v
a
‑2是滴注管内空气柱的体积，p
a
‑2是滴注管内空气柱的压力，n是一个多方指数，n≥1，由于顺应性的调节过程中温度保持不变，所以n＝1。a是滴注管的内截面积，h是滴注管内空气柱的长度，p
atm
和p0分别为大气压以及液体作用于空气柱的压力。因此，如果给定了滴注管顺应性c3的具体数值，那么在输液管内截面积已知的情况下，通过上述的公式(5)便可得到滴注管内所需空气柱的高度h。
[0037]
如图3所示，浓度梯度生成器b选用的“圣诞树”结构。该结构具有以下三个特点：第一，第一级混合通道的个数总是比入口个数多一个；第二，每一级的混合通道数量有序增加，即下一级混合通道的个数总是比这一级混合通道的个数多一个；第三，结构内所有混合通道的结构完全相同，从而具有相同的流阻。以上三种特征决定了“圣诞树”结构的重要特征：当入口2
‑
1和入口2
‑
2分别输入等流量且生化因子浓度为0和1的两种流体时，经过多级微通道的分流混合，在出口处可以产生空间线性分布的浓度梯度。
[0038]
当入口2
‑
1和入口2
‑
2分别输入等流量的浓度分别为0和1的流体时，第一级中各混合通道中的浓度值：
[0039][0040][0041][0042]
第二级中各混合通道中的浓度值为：
[0043][0044][0045][0046][0047]
以此类推，第三级各分支处浓度分别为：
[0048]
φ
31
＝0、φ
32
＝1/4、φ
33
＝2/4、φ
34
＝3/4、φ
35
＝1；
[0049]
第七级各分支处的浓度分别为：
[0050]
φ
71
＝0、φ
72
＝1/8、φ
73
＝2/8、φ
74
＝3/8、φ
75
＝4/8、φ
76
＝
[0051]
5/8、φ
77
＝6/8、φ
78
＝7/8、φ
79
＝1；
[0052]
即，最终在出口处可以产生空间上的浓度梯度，此装置采用的是7级“圣诞树”结构，其之后也可以进行扩展延伸，如果想要更加精准的浓度差异，也可选用11级、13级或更多分级。
[0053]
实施例：
[0054]
如图5所示，应用本发明的用于化疗药物敏感性和耐药性测试的微流控装置进行卵巢癌化疗药物敏感性和耐药性测试的实验，试验装置包括输液装置a、浓度梯度生成器b和细胞培养装置c和细胞状态检测装置d(包括ccd和工控机)。具体环节如下：
[0055]
(一)首先设计并制作微流控芯及输液装置a，步骤如下：
[0056]
步骤一：微流控芯片由浓度梯度生成器b、细胞培养装置c两部分组成，芯片上所有通道和腔室结构采用标准化的微加工方法用pdms制作完成，并与洁净盖玻片永久键和密封，构成透明的生物相容性良好的玻璃
‑
pdms型芯片。微通道的结构参数如下：其中“圣诞树”型浓度梯度生成器b长27.27mm，共有7级宽为0.1mm的微通道，入口处宽为5.5mm，入口2
‑
1和2
‑
2为直径1mm的圆，出口处宽为5.3mm，出口2
‑
3到2
‑
11均为直径0.5mm的圆；细胞培养装置c的长为8.5mm，宽为7.9mm，其中细胞培养腔室长为3mm，宽为0.7mm，长方形细胞培养的四个角均为直径为0.1mm的倒圆角，入口3
‑
1到3
‑
9均为直径0.5mm的圆，出口3
‑
10为直径1mm的圆；芯片高度为50nm。
[0057]
步骤二：输液装置a中的小型医用输液器可直接从医院获得，一个输液瓶上插入一个进气管和一个输液管即可；输液管出口和浓度梯度生成器的各个入口相连，用于灌注细胞培养基和化疗药物溶液。
[0058]
(二)在细胞培养装置c内进行细胞三维培养,步骤如下：
[0059]
步骤一：细胞培养装置c用紫外光灭菌2小时，然后用胶原蛋白包被4小时，用新鲜的dmem冲洗3次；
[0060]
步骤二：将卵巢癌细胞悬浮液封装在7％(w/v)的甲基丙烯酰明胶(gelma)溶液中，加入浓度为0.1％(v/v)的光引发剂(pi)，将凝胶溶液以受控的流速依次注射到细胞培养装置c中的入口3
‑
1到3
‑
9中，通过掩膜将紫外光照射到细胞培养腔室上，使凝胶形成交联。交联明胶微球将细胞封装在每个细胞培养腔室，形成三维培养的环境；将整个尾流控装置放置在含5％二氧化碳、温度为37℃的细胞培养箱中2小时，使细胞能够生长附着；使用显微镜记录培养腔室中癌细胞的初始状态作为后续对照；
[0061]
(三)在微流控芯片上进行卵巢癌化疗药物敏感性和耐药性测试的实验，步骤如下：
[0062]
步骤一：浓度梯度生成器b用紫外光灭菌2小时，然后用胶原蛋白包被4小时；
[0063]
步骤二：在两个小型医用注射器中分别装入细胞培养基和化疗药物，先每分钟60滴的流速流动2分钟，产生一个浓度梯度微环境；之后使用9个完全相同微管将浓度梯度生成器的出口2
‑
3到2
‑
11依次与细胞培养装置的入口3
‑
1到3
‑
9相连；首先用同一种化疗药物，初始浓度不同来产生浓度梯度，与细胞培养装置相连后继续流动2分钟，之后将细胞培养装置放入细胞培养箱进行化疗药物和癌细胞共培养，在不同培养时间拿出来进行atp提取和
荧光素
‑
荧光素酶表示，检测癌细胞的活/死细胞数量，计算卵巢癌细胞的生存率；其次用不同化疗药物，初始浓度相同来产生浓度梯度，与细胞培养装置相连后继续流动2分钟，之后将细胞培养装置放入细胞培养箱进行化疗药物和癌细胞共培养，在不同培养时间拿出来进行atp提取和荧光素
‑
荧光素酶表示，检测癌细胞的活/死细胞数量，计算卵巢癌细胞的生存率；最后用不同化疗药物，不同初始浓度来产生浓度梯度，与细胞培养装置相连后继续流动2分钟，之后将细胞培养装置放入细胞培养箱进行化疗药物和癌细胞共培养，在不同培养时间拿出来进行atp提取和荧光素
‑
荧光素酶表示，检测癌细胞的活/死细胞数量，计算卵巢癌细胞的生存率；
[0064]
步骤三：按照同一种化疗药物，不同初始浓度，不同培养时间；不同种化疗药物，同一初始浓度，不同培养时间；不同种化疗药物，不同初始浓度，不同培养时间得出的卵巢癌细胞生存率，用计算机绘制各筛选药物浓度梯度
‑
卵巢癌细胞生长抑制曲线，据此计算评估出体外卵巢癌细胞对各化疗药物的敏感性和耐药性。