一种饲用牡丹籽粕的发酵改良方法及其发酵产物和应用与流程

1.本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种饲用牡丹籽粕的发酵改良方法及其 发酵产物和应用。


背景技术：

2.油用牡丹在我国种植范围广泛，主要油用牡丹分布于安徽省、陕西省和甘肃省秦岭 太白山一带。我国的油用牡丹达到旺产期所用时间很短，仅仅只需要4到5年，并且可 以保持旺产期超过30年。每亩地的籽产量也很客观，能达到350
‑
400斤以上，产油量 在80
‑
100斤。
3.可是我国目前对于牡丹籽粕的开发和研究并不常见，大多作为榨取牡丹籽油后的残 渣而废弃，使得资源严重浪费，生态环境也被废料污染。不妨将牡丹籽粕适当处理用作 家禽饲料以补充此方面的资源短缺。现可知牡丹籽粕内含有丰富的营养成分，28％以上 的蛋白质，其中氨基酸含量丰富，高达89％以上。还含有多糖、脂肪、粗纤维。还富含 铜、铁、锌锰等微量元素，其中铁和锌的含量是豆粕的3倍以上。不仅如此，牡丹籽粕 内还含有大量的皂甙，然而高含量的皂甙对家禽的肠道有刺激性，影响家禽的生长。
4.皂甙具有预防心血管疾病，增强免疫力。抗肿瘤抗衰抗疲劳等作用。所以人参皂苷 就是我们日常说的“种草药之王”人参的有效成分之一。牡丹作为芍药科植物，其牡丹 籽内也含有丰富的皂甙，并且主要存在于榨油后的牡丹籽粕中。牡丹籽粕包括芪类、单 萜苷类、三萜类、有机酸、甾类及一些其他成分。单萜类化合物中，属芍药苷含量最多， 芍药苷具有很高的药用价值，具体表现为抗菌、降血糖、消炎等作用。但是在张亚欣等 人的实验中证明皂甙具有一定的毒性，长期食用会损伤肝脏，导致肝功能衰竭。还有研 究发现，某些植物产生的皂苷可能会干扰消化系统的运作，使得脂肪、葡萄糖、蛋白质、 胆固醇和维生素的吸收与消化受到不好影响。食用过量皂甙的家禽的消化肠道黏膜受到 刺激，引起局部肿胀出血，对家禽的生产性能有极大的危害。所以要适当控制皂甙的含 量才能更好的发挥牡丹籽粕的饲用价值。故本发明要采用微生物发酵的方法降低牡丹籽 粕中皂甙的含量，以便其发挥最大的饲用价值。这种对废弃籽粕的科学合理利用起来， 极大地符合在可持续发展理念和资源合理高效利用理念，在一定程度上能缓解粮食短缺 饲料供应的压力。


技术实现要素：

5.本发明的目的就在于为了解决上述问题而提供了一种饲用牡丹籽粕的发酵改良方 法及其发酵产物和应用。
6.本发明通过以下技术方案来实现上述目的：
7.一种饲用牡丹籽粕的发酵改良方法，主要包括以下步骤：
8.(1)粉碎处理：将牡丹籽粕投入粉碎机内粉碎，过60目筛，保存备用；
9.(2)菌种活化：将微生物发酵选用的菌种经活化后得到菌液；
10.(3)发酵处理：称取5g牡丹籽粕加纯水100ml作为初始培养基，灭菌，无菌操作 下，
往培养基加入活化好的菌液，在摇床上发酵降解，得到发酵液，即完成牡丹籽粕微 生物发酵降解皂甙的过程。
11.作为本发明的进一步优化方案，所述微生物发酵选用的菌种为贝莱斯芽孢杆菌、 酵母菌或二者等比例混合的混合菌。
12.作为本发明的进一步优化方案，所述步骤(3)发酵处理，具体为，称取5g牡丹 籽粕、1g葡萄糖、0.5氯化钠、0.5蛋白胨和0.1g蛋白胨，加纯水100ml作为初始培养 基，初始培养基ph值为3，灭菌，在超净工作台上，放入灭好菌的液体培养基，吸取 5％的活化后的菌种放入培养基，在37℃的摇床发酵7d。
13.本发明还提供了一种牡丹籽粕发酵产物，所述牡丹籽粕发酵产物为利用上述方法 制备获得的发酵液，或为所述发酵液的浓缩或干燥产物。
14.本发明还提供了上述牡丹籽粕发酵产物在作为蛋鸡类饲料中的应用。
15.本发明还提供了一种可降解牡丹籽粕中皂甙的酶的制备方法及其酶，所述酶的制 备方法包括：对牡丹籽粕发酵产物进行预处理，步骤包括：在4000r/min下离心10min， 过滤得到上清液，即粗酶液，在粗酶液中缓慢加入硫酸铵，使其浓度为70％
‑
75％，于4℃ 冰箱中放置过夜，进行盐析，盐析后离心，去上清液，留蛋白质沉淀，蛋白质纯化后得 到纯化蛋白，即为所述酶。
16.本发明的有益效果在于：
17.(1)本发明提供了一种饲用牡丹籽粕的发酵改良方法，并找出其中起降解作用的 酶，能够方便、经济地降解皂甙，利用微生物降解其中的皂甙，就能够很好的对牡丹籽 粕进行充分加工利用，为以后提高牡丹籽粕添进蛋鸡类饲料的比例提供了一个前提条 件，方便开展了牡丹籽粕资源开发利用，减少了粮食养殖成本，促进了作物产业的发展， 此方式减少了牡丹籽粕资源浪费和环境污染，有利于促进油用牡丹产业的稳定发展，且 方法简单，成本低，易于操作；
18.(2)本发明利用贝莱斯芽孢杆菌发酵降解牡丹籽粕中的皂甙，其获得的牡丹籽粕 发酵物中引入贝莱斯芽孢杆菌，贝莱斯芽孢杆菌作为益生菌分泌多种分解酶、抗菌蛋白、 脂肽类抗生素、聚酮类抗生素、植物激素等，具有生长迅速、易分离培养和生物安全性 高等优点，降低养殖动物肠道和生境中的病原菌丰度，降低发病率，因此，利用牡丹籽 粕发酵物生产发酵饲料用于蛋鸡饲养，发酵牡丹籽粕可以作为蛋白饲料替代部分豆粕添 加到蛋鸡日粮中，不会降低蛋鸡生产性能，且能够增强肠道菌群多样性，真正发挥牡丹 籽粕的潜在价值，成为健康无害的饲料原料。
附图说明
19.图1为本发明提供的初级纯化凝胶电泳图(注：左边为分子量在65kda的纯化蛋白； 右边为标准蛋白maker)；
具体实施方式
20.下面结合附图对本技术作进一步详细描述，有必要在此指出的是，以下具体实施 方式只用于对本技术进行进一步的说明，不能理解为对本技术保护范围的限制，该领域 的技术人员可以根据上述申请内容对本技术作出一些非本质的改进和调整。
21.一种饲用牡丹籽粕的发酵改良方法，主要包括以下步骤：
22.(1)粉碎处理：将牡丹籽粕投入粉碎机内粉碎，过60目筛，保存备用；
23.(2)菌种活化：将微生物发酵选用的菌种经活化后得到菌液；
24.①
贝莱斯芽孢杆菌的活化
25.在超净工作台里，取灭菌过的lb培养基10ml于干净试管内，加100μl(1％)贝 莱斯芽孢杆菌菌液，标记“贝莱斯”，37℃下恒温摇床活化12h，呈浑浊状态取出，4℃ 下保存；
26.②
酵母菌的活化
27.在超净工作台内，取10ml灭菌过的ypd培养基于离心管内，用移液枪吸取100 μl(1％)酵母菌加入离心管内，拧紧盖子并标记“酵母”，在37℃恒温摇床活化20h， 呈浑浊状态取出，4℃保存；
28.③
混合菌液的配制
29.取活化后的贝莱斯芽孢杆菌和酵母菌按1：1比例混合，例如：混合菌浓度为3％时， 即在100ml的发酵底物中，分别加入1.5ml的酵母菌和贝莱斯芽孢杆菌，封口标记“混 合菌”，4℃下进行保存；
30.(3)发酵处理：称取5g牡丹籽粕粉碎料、1g葡萄糖、0.5氯化钠、0.5蛋白胨和0.1g 蛋白胨，加纯水100ml作为初始培养基，初始培养基ph值为3，灭菌，在超净工作台上， 放入灭好菌的液体培养基，吸取5％的活化后的菌种放入培养基，在37℃的摇床发酵7d， 得到发酵液，即完成牡丹籽粕微生物发酵降解皂甙的过程。
31.所述步骤(4)之后，还包括提取降解牡丹籽粕中皂甙的酶的过程，具体为，首先， 对步骤(4)得到的发酵液进行预处理，在4000r/min离心10min，过滤得到上清液，即 粗酶液，在粗酶液中缓慢加入硫酸铵，使其浓度为70％
‑
75％，加入硫酸铵时速度要慢, 防止过热或浓度过高，然后在4℃冰箱中放置过夜，进行盐析。盐析后离心，去上清液， 留沉淀，对沉淀进一步进行蛋白纯化，以获得纯化蛋白，具体分为两步：
32.第一，离子交换
33.将沉淀溶于7.0tris
‑
hcl缓冲液中，取deae
‑
纤维素，经膨胀活化处理，除去杂质， 暴露deae
‑
纤维素上的极性基团，注意的是，deae
‑
纤维素的用量则根据柱容积的大小和 所需过柱样品的量来决定，一般是1.0g deae
‑
纤维素相当于6ml～8ml柱床体积；
34.将deae
‑
纤维素放入0.0lmol/l ph为7.4的pb液中(即起始缓冲液)，静止1h， 不时搅拌，待纤维素下沉后，倾去上清液或抽滤除去洗液，如此反复几次至倾出液体的 ph值与加入的pb液的ph值相近时为止；
35.取层析柱，柱长和柱直径之比为10︰1～20︰1，柱的内径上下要均匀一致，装柱时， 先剪一块圆形的尼龙纱布(直径与层析柱内径一致)，放入层析柱底部，将柱下端连接 细塑料管，夹上螺旋夹，把层析柱垂直固定在三角铁架上，倒入起始缓冲液至一半的柱 高，除去死区及塑料管内的气泡，再将平衡的deae－纤维素糊状物沿管壁倒入柱中。注 意不要产生气泡，如有气泡应排除或重装，拧开螺旋夹，使流速至1ml/5min，待缓冲液 快接近纤维素面时，继续倒入纤维素糊，同时用玻璃棒搅拌表面层，以免使两次加入的 纤维素形成分界层，通过进出缓冲液调节流量，也可通过塑料管的升降来控制，至柱床 体积不变为止，剪一圆形滤纸(与柱内径大小一致)，从柱的上端轻轻放入，使其沉接 于纤维素床表面，以免在加样时打乱纤维素层，装好柱的柱面应该是平整的，无倾斜， 整个柱床内无气泡、不分层，继
续平衡，使流出液的ph值与流入液的ph值完全一致为 止；
36.将柱的上端打开，用吸管将纤维素柱上面的缓冲液吸出，不要吸净，留一薄层液面， 以免空气进入，沿管壁缓缓加入样品，注意不要打乱纤维素表层，另外，注意要层析的 样品首先必须用起始缓冲液(4℃)平衡过夜，中间可换液数次，拧开下端的螺旋夹， 使样品进入交换剂中，快要进完时，加1ml
‑
2ml缓冲液冲洗柱壁，随即用多量的洗脱液 洗脱，连续洗脱数次，利用自动分步收集器收集洗脱液，最后，将使用过的deae－纤维 素移入烧杯中，用2mol/l nacl液浸泡，抽滤并洗涤数次，即完成交换柱的再生。
37.第二，将经上述离子柱层析得到的冻干浓缩样品进行凝胶层析。
38.称取适量sephadex g100凝胶加入过量的缓冲液在冰箱(或室温)中充分膨胀，或 在沸水中煮，即完成凝胶的预处理，将处理过的凝胶装柱，得到凝胶层析柱，需注意的 是，纯化蛋白质时，柱床体积应为样品体积的25
‑
100倍，去盐、游离荧光素约为样品 体积的4
‑
10倍，装柱过程基本同离子交换层析柱；
39.将冻干浓缩样品加入凝胶层析柱中，样品体积不宜过多，最好为床体积的1％～5％， 最多不要超过10％，样品浓度一般不超过4％，洗脱液应与膨胀一致，否则更换溶剂，凝 胶体积会发生变化，影响分离效果，洗脱液要有一定的离子强度和ph值，洗脱液收集 同离子交换层析一致，当样品的各组分全部洗脱下来之后，即可加入新的样品，继续凝 胶柱的重复使用，按照上述方式得到的纯化蛋白即为所述酶。用透析袋在固体聚乙二醇 上浓缩纯化样品备用。
40.随后，将纯化蛋白溶解后，取适量作为样品进行非变性电泳跑胶，获取目的条带， 将该目的条带在4℃条件下用ph为7.0的缓冲液溶解，取溶解液按照检测方法测定皂甙 降解率，发现该溶解液可有效降解皂甙，明确该纯化蛋白中的目的条带蛋白具有降解皂 甙的特性，即牡丹籽粕降解酶，需要注意的是，变性电泳的电压先是50v，等样品和maker 跑成一条直线，电压后变为120v，跑完胶脱色查看条带，如图1所示。
41.实施例1
42.本实施例提供一种饲用牡丹籽粕的发酵改良方法，主要包括以下步骤：
43.(1)粉碎处理：将牡丹籽粕投入粉碎机内粉碎，过60目筛，保存备用；
44.(2)皂甙提取：先绘制齐墩果酸标准曲线，称取齐墩果酸标准品2mg于小烧杯中 先加少量无水乙醇摇匀溶解，后转移至10ml容量瓶中。用无水乙醇定容，制成0.2mg/ml 的齐墩果酸对照品溶液。准备3组试管(每组6支，编号1
‑
1、1
‑
2、1
‑
3、1
‑
4、1
‑
5、 1
‑
6，余下两组参照上述方法类推)，每组各加入0ml、0.1ml、0.2ml、0.3ml、0.4ml、 0.5ml齐墩果酸对照品溶支液。水浴挥干每一试管后，于每一支试管中加入现配的5％香 草醛
‑
冰醋酸0.5ml和高氯酸1ml。将全部试管加上塞后，放入水浴锅60℃水浴15min， 流水冷却至室温，每支试管再各加入4ml乙酸乙酯。震荡摇匀后，用紫外分光光度计测 定560nm处得的吸光度(a560nm)，以齐墩果酸的浓度为横坐标，od560nm为纵坐标， 绘制标准曲线，即可得到齐墩果酸的标准曲线，齐墩果酸的标准曲线方程为： y＝10.774x
‑
0.0268，r2＝0.9975，式中：x为皂甙含量，y为所测吸光值；
45.称取0.5g牡丹籽粕于试管中，配置70％乙醇，二者固液比为1:10，在水浴锅中60℃ 中水浴90min，取出后过滤，得到提取液，再取0.5ml提取液于试管中，挥干，加入香 草醛
‑
冰醋酸溶液0.5ml，高氯酸1ml，于60℃中水浴15min，加入乙酸乙酯4ml，用紫 外分光光度计测
定560nm处的吸光度值，并根据齐墩果酸的标准曲线方程，得到未经发 酵降解的牡丹籽粕中皂甙含量g0；
46.(3)菌种活化：将贝莱斯芽孢杆菌经活化后得到菌液；
47.(4)发酵处理：称取5g牡丹籽粕粉碎料加纯水100ml，初始培养基ph值为3， 灭菌。在超净工作台上，放入灭好菌的液体培养基，吸取5％的活化后的“贝莱斯”放入 发酵底物，在37℃、220r的摇床发酵7d。将发酵后的发酵液离心，取固体部分，将固 体部分75℃烘干10h至恒重。称取0.5g发酵后的牡丹籽粕于五支试管中，配置70％乙 醇，固液比为1:10。在水浴锅中60℃中水浴90min，取出后过滤，再分别取0.5ml提取 液于五支试管中，挥干，加入香草醛
‑
冰醋酸溶液0.5ml,高氯酸1ml，于60℃中水浴 15min，冷却至室温，加入乙酸乙酯4ml。震荡摇匀后，以0号试管(同等体积的蒸馏水) 作为空白对照调零，用紫外分光光度计于560nm处测得吸光度值，并根据齐墩果酸的标 准曲线方程，得到经发酵降解的牡丹籽粕中皂甙含量g1；
48.根据公式降解率(％)＝{(g0
‑
g1)/g0}
×
100％，得到经发酵降解的牡丹籽粕中皂 甙的降解率。
49.实施例2
50.与实施例1不同之处在于，微生物发酵所需的菌种选用酵母菌菌液。
51.实施例3
52.与实施例1不同之处在于，微生物发酵所需的菌种选用活化后的贝莱斯芽孢杆菌 和酵母菌按比例1：1混合而成的混合菌液。
53.实施例4
54.与实施例1不同之处在于，初始培养基的组成除5g牡丹籽粕和100ml纯水之外， 还添加有1g葡萄糖、0.5g氯化钠和0.6g蛋白胨。
55.实施例5
56.在实施例4的基础上，在微生物发酵7天后，提取发酵液中起降解作用的酶，进 行牡丹籽粕酶解实验，对比酶解前和酶解后的皂甙含量，具体为，对发酵液预处理，离 心去沉淀得到上清液，即粗酶液，在粗酶液中缓慢加入硫酸铵,使其浓度为70％,加入硫 酸铵时速度要慢,防止过热或浓度过高，然后在4℃冰箱中放置过夜,进行盐析，盐析后 离心，去上清液，留蛋白质沉淀，最后，进行蛋白纯化，得到纯化蛋白，随后，将纯化 蛋白溶解后，取微量进行电泳跑胶，获取目的片段的条带，将蒸馏水和纯化蛋白按1:8 的比例溶解，取10ml加入1g牡丹籽粕，去进行牡丹籽粕酶解实验，对比酶解前和酶解 后的皂甙含量。
57.一、不同微生物菌种对牡丹籽粕中皂甙降解率的影响
58.以未经微生物发酵的牡丹籽粕中皂甙含量g0作为对照，按照上述实施例1
‑
5所述 饲用牡丹籽粕的发酵改良方法对牡丹籽粕进行处理，并对各实施例的皂甙含量及皂甙降 解率进行计算，结果如表1：
59.表1不同微生物菌种对降解牡丹籽粕中皂甙降解率的影响
[0060][0061]
由上述结果可知，实施例1
‑
5中，按照实施例4提供的饲用牡丹籽粕的发酵改良方 法是使用贝莱斯芽孢杆菌对牡丹籽粕进行发酵降解处理，相较于未发酵处理的牡丹籽粕 中皂甙含量下降了12.51，皂甙降解率达到了42.12％，相比较单独使用酵母菌以及使用 二者的混合菌而言，其皂甙降解率要高；
[0062]
另外，实施例4相比于同样采用贝莱斯芽孢杆菌的实施例1而言，实施例4在初始 培养基中增加了1g葡萄糖、0.5g氯化钠、0.5g蛋白胨和0.1g蛋白胨作为营养元素， 可提高贝莱斯芽孢杆菌的生长活性，在发酵降解牡丹籽粕中皂甙提到积极作用，进而皂 甙降解率叫实施例1要高；
[0063]
最后，实施例5相较于实施例4，不同的是，实施例5提取了贝莱斯芽孢杆菌发酵 牡丹籽粕后的发酵液中起降解作用的酶，并使用提取的酶对牡丹籽粕进行相应的酶解， 对比酶解前和酶解后的皂甙含量，皂甙降解了41.24％，与实施例4相当，由此可知，贝 莱斯芽孢杆菌发酵降解牡丹籽粕中的皂甙主要是其中起降解作用的酶的作用。
[0064]
二、不同微生物菌种发酵降解的牡丹籽粕发酵产物对喂养蛋鸡的肠道菌群多样性 的影响
[0065]
将实施例1
‑
5所述饲用牡丹籽粕的发酵改良方法对牡丹籽粕进行处理得到的牡丹籽 粕发酵物，以5％的添加量添加至五组试验蛋鸡的日粮中，另外，对照组添加5％的未经 发酵降解的牡丹籽粕，评价其对喂养蛋鸡的肠道菌群多样性的影响。
[0066]
分别取试实施例1
‑
5喂养的蛋鸡样本及对照组喂养的蛋鸡样本的空肠和盲肠内容物 置于的2ml冷冻管内，存入干冰中，进行16srdna高通量测序检测空肠和盲肠的肠道菌 群多样性，6组空肠样品的高通量测序结果如表2所示，其中对照组有效序列数为28176， 序列聚类分析获得189个otus，实施例1有效序列数为49391，聚类分析获得256个otus， 实施例2有效序列数37317，聚类分析获得219个otus，实施例3有效序列数45683， 聚类分析获得236个otus，实施例4有效序列数54422，聚类分析获得339个otus，实 施例5有效序列数50422，聚类分析获得319个otus。otu水平一定程度上代表菌群丰 度，即实施例4与实施例5肠道菌群丰度相当，对照组的空肠菌群丰度最低。
[0067]
表2空肠微生物测序基本信息
[0068][0069]
另外，6组盲肠样品的高通量测序结果如表3所示，其中其中对照组有效序列数为40565，序列聚类分析获得623个otus，实施例1有效序列数为51196，聚类分析获得 649个otus，实施例2有效序列数37097聚类分析获得534个otus，实施例3有效序列 数50134，聚类分析获得643个otus，实施例4有效序列数54562，聚类分析获得680 个otus，实施例5有效序列数52376聚类分析获得669个otus。otu水平一定程度上代 表菌群丰度，即实施例4与实施例5肠道菌群丰度相当，对照组的空肠菌群丰度最低。
[0070]
表3盲肠微生物测序基本信息
[0071][0072]
结论，实施例4采用贝莱斯芽孢杆菌发酵降解牡丹籽粕中皂甙的方法对牡丹籽粕进 行处理得到的牡丹籽粕发酵物喂养蛋鸡时，其发酵组肠道菌群丰度和多样性都增加，原 因在于是经贝莱芽孢杆菌发酵得到的牡丹籽粕发酵饲料喂养蛋鸡时，贝莱芽孢杆菌作为 益生菌进入肠道，增加了肠道益生菌丰度，降低养殖动物肠道和生境中的病原菌丰度， 降低发病率。
[0073]
三、不同微生物菌种发酵降解的牡丹籽粕发酵产物对喂养蛋鸡的产蛋率的影响
[0074]
将实施例2
‑
4所述饲用牡丹籽粕的发酵改良方法对牡丹籽粕进行处理得到的牡丹籽 粕发酵产物，以5％的添加量添加至五组试验蛋鸡的日粮中，评价其对喂养蛋鸡的产蛋率 的影响，结果如表4所示。
[0075]
表4不同微生物菌种发酵降解的牡丹籽粕发酵产物对喂养蛋鸡的产蛋率的影响
[0076][0077]
结论，由表4可知，实施例4采用贝莱斯芽孢杆菌发酵降解牡丹籽粕中皂甙的方法 对牡丹籽粕进行处理得到的牡丹籽粕发酵物喂养蛋鸡时，其蛋鸡的产蛋率、平均蛋重均 有所提高，原因在于，其获得的牡丹籽粕发酵物中引入贝莱斯芽孢杆菌，贝莱斯芽孢杆 菌作为益生菌分泌多种分解酶、抗菌蛋白、脂肽类抗生素、聚酮类抗生素、植物激素等， 提高蛋鸡对饲料的吸收效果，从而提高蛋鸡生产性能，真正发挥牡丹籽粕的潜在价值， 成为健康无害的饲料原料。
[0078]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，但并不能因此而理解为对本发 明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明 构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。