单宁酶AfTan2.0突变体及其应用的制作方法

单宁酶aftan2.0突变体及其应用
技术领域
1.本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种嗜热真菌来源的单宁酶aftan2.0突变体及其应用。


背景技术：

2.单宁酶(tannase ec 3.1.1.20)，又称鞣酸酶，是一种单宁酰基水解酶，可以水解单宁中的酯键与缩酚羧键，生成葡萄糖、没食子酸及其相应的醇类等化合物。单宁酶广泛分布在自然界中，如动物、植物及微生物，目前，生产用单宁酶主要来自微生物的曲霉属。美国食品药品监督管理局(fda)已将单宁酶作为一种安全的食品添加剂，并已被茶、饮料以及酿酒工程中用来澄清液体。除此之外，其还被应用于化工、医药及饲料等工业领域。
3.目前，单宁酶的生产成本限制了单宁酶的实际应用，利用生物技术提高单宁酶的产量是降低生产成本的可行途径。1996年，hatamoto等人首次对米曲霉中的单宁酶进行了异源表达，到目前为止共有4种来源的单宁酶实现了克隆表达，包括真菌来源的米曲霉和黑曲霉，原核微生物来源的植物乳杆菌和葡萄球菌。还有，目前的单宁酶热稳定性较差，而在实际生产过程中，常常面临发酵温度的较大变化，使得现有的单宁酶催化活性受到较大影响。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种嗜热真菌来源的单宁酶aftan2.0基因突变体及其应用。
5.一种单宁酶aftan2.0突变体，所述突变体为g475e、t437k、a222v；
6.所述突变体g475e是单宁酶aftan2.0的第475位氨基酸g突变为e；
7.所述突变体t437k是单宁酶aftan2.0的第437位氨基酸t突变为k；
8.所述突变体a222v是单宁酶aftan2.0的第222位氨基酸a突变为v。
9.所述未突变单宁酶aftan2.0的氨基酸序列如序列表seq id no：1所示，基因序列如序列表seq id no：2所示。
10.一种含所述单宁酶aftan2.0突变体基因的载体。
11.含有所述单宁酶aftan2.0突变体基因载体的工程菌。
12.扩增所述的单宁酶aftan2.0基因中任一片段的引物。
13.所述单宁酶aftan2.0突变体在提高单宁酶的热稳定性中的应用。
14.本发明的有益效果：g475e、t437k、a222v均在位于α/β水解酶折叠结构域，本发明运用计算程序foldx在分子动力学模拟的基础上，设计了20个单点突变体，经活性鉴定后发现突变体r230l失去了单宁酶活性，通过测定剩余19个突变体在50℃和60℃处理条件下的残余酶活力筛选出对单宁酶热稳定性有明显改善作用的突变体g475e、t437k、a222v。
附图说明
15.图1为单宁酶热稳定性突变体sds
‑
page分析。
16.图2为单宁酶热稳定性突变体的ph稳定性。
17.图3为单宁酶热稳定性突变体的温度稳定性。
具体实施方式
18.下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。下述实施例采用的实验材料如无特别说明，均是本领域常规试剂，实验方法如无特别说明，均为常规实验方法。
19.实施例1单宁酶aftan2.0的突变策略
20.使用蛋白质在线建模软件swiss
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model(https://swissmodel.expasy.org/interactive)构建aftan2.0的三维结构模型，同样选择黑曲霉单宁酶的晶体结构(pdb：7k4o)作为模板。使用在线工具galaxyrefine(http://galaxy.seoklab.org/cgi
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bin/submit.cgi？type＝refine)对swiss
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model构建的模型进行优化。使用procheck检测优化前后模型的质量，选择最优模型进行分子动力学模拟。在400k温度下，利用软件namd2.12对蛋白进行了20ns的分子动力学模拟并从模拟轨迹中提取100帧结构。运用foldx4.0软件对分子动力学模拟轨迹中提取出的每一帧蛋白质结构进行扫描突变操作，随后将计算的每帧结构的突变体的解折叠自由能(δδg)变化作为热稳定性评估的标准，对于解折叠自由能显著下降的突变体用于后续实验验证。
21.采用foldx 4.0软件计算aftan2.0不同氨基酸残基突变后的δδg值，按照突变体的解折叠自由能(δδg)变化选择了20个突变体，分别为t163l、t176l、t176f、q211l、a222v、r230l、r230f、q234l、s242l、c255p、i295n、i295k、t412l、t437k、t437r、a459l、g475e、g475p、v476e和s477l。20个突变体共涉及15个位点，其中6个位点位于帽子结构域，分别为r230、q234、t412、s242、i295和c255；9个位点位于α/β水解酶折叠结构域，分别为t163、t176、q211、a222、t437、a459、g475、v476和s477。
22.实施例2单宁酶aftan2.0的突变体构建
23.构建aftan2.0热稳定性研究的突变体所用引物如表1所示，突变引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成。突变体构建方法采用常规方法。
24.表1热稳定性研究的突变体引物
25.[0026][0027]
注：下划线所标记的为突变位点
[0028]
实施例3单宁酶热稳定性突变体sds
‑
page分析及活性鉴定
[0029]
对单宁酶热稳定性突变体进行sds
‑
page分析，20个突变体均在巴斯德毕赤酵母gs115重组菌株中表达，结果如图1所示。各突变体的表观分子量在75～100kda之间，与aftan2.0的表观分子量相同。在测定各突变体的单宁酶活性时发现突变体r230l失去了单宁酶酶活性，其余19个突变体t163l、t176l、t176f、q211l、a222v、r230f、q234l、s242l、c255p、i295n、i295k、t412l、t437k、t437r、a459l、g475e、g475p、v476e和s477l仍具有单宁酶酶活性。
[0030]
实施例4单宁酶突变体酶学性质分析
[0031]
按照常规方法测定具有单宁酶活性的19个突变体的最适温度、最适ph及动力学参数并于aftan2.0的最适温度、最适ph及动力学参数进行比较，结果如表2所示。突变体t176l、a222v、s242l、c255p、i295n、t412l、t437k和g475p的最适温度均为30.0℃，相比于aftan2.0的最适温度提高了10℃；突变体t176f和g475e的最适温度40.0℃，相比于aftan2.0的最适温度提高了20.0℃；其余突变体的最适温度并未改变。在最适ph方面，仅突变体q234l的最适ph未发生改变，其余突变体的最适ph均发生改变，趋向于弱酸性和中性。如s242l和v476e的最适ph由此前ph 5.0改变为ph 7.0，而突变体t163l、t176l、t176f、q211l、a222v、r230f、c255p、i295n、i295k、t412l、t437k、t437r、a459l、g475e、g475p和s477l的最适ph则改变为ph 6.0。热稳定性突变使单宁酶的动力学常数(km和vmax)产生较大的变化，多数突变体的km值有着不同程度的增大，表明热稳定性突变使单宁酶与底物的亲和减弱，仅突变体t176l和g475e的km值有所减小。
[0032]
表2热稳定性突变体的最适温度、ph及动力学参数
[0033][0034]
实施例5单宁酶热稳定性突变体的ph稳定性
[0035]
通过测定19个单宁酶热稳定性突变体在ph 2～12范围内的稳定性，探究热稳定突
变对单宁酶ph稳定性的影响，结果如图2所示。热稳定性突变普遍改善了单宁酶在极端ph(ph 2.0和ph 12.0)条件下的稳定性。19个突变体中仅r230f、q211l和t163l在ph 2.0条件下仍保持较差的稳定性，其余提突变体在ph 2.0条件下的稳定性均得到不同程度的提高，如突变体s477l、i295k、c255p和a222v在ph 2.0条件下处理1h后，残余酶活力可维持在60％以上，与aftan2.0相比提高了约20倍。除了突变体s477l和i295k在ph 12.0条件下处理1h后丧失酶活性，其余突变体均表现为稳定性提高。
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实施例6单宁酶热稳定性突变体的温度稳定性
[0037]
野生单宁酶aftana在截去loopβ10
‑
β11结构中kex2蛋白酶识别位点(k315
‑
r316)后得到突变体aftan2.0。与野生型单宁酶相比，aftan2.0的酶学性质发生较大改变，其中最突出的改变是最适温度的降低和热稳定性的提高。本文在aftan2.0的基础上继续进行热稳定性突变，为了验证热稳定性突变体是否改善了单宁酶的热稳定性，在50℃和60℃的温度条件下处理0、5、10、20、30和60min，测定残余酶活力。图3a为各突变体在50℃处理时热稳定性测定结果，突变体g475e、t437k、t412l和a222v在50℃处理60min的残余酶活力分别为65.9％、62.7％、49.4％和65.4％，相对于aftan2.0的42.7％分别提高了23.2％、20％、6.7％和22.7％；图3b为各突变体在50℃处理时热稳定性测定结果，突变体v476e、g475e、t437k、t412l、i295k、i295n、c255p、s242l和a222v在60℃处理10min的残余酶活力分别为53.7％、72.3％、77.5％、60.8％、63.6％、52.4％、50.0％、49.9％和68.3％，相对于aftan2.0的44.9％分别提高了8.8％、27.4％、32.6％、15.9％、18.7％、7.5％、5.1％、5.0％和23.4％。综合来看突变体g475e、t437k和a222v可以有效提高单宁酶热稳定性。
[0038]
随着计算机科学与生命科学的相结合，生物信息学的蓬勃发展，为了改善蛋白质的热稳定性开发了大量的热稳定性预测软件或计算程序，用以预测突变(单个或多个)对蛋白质稳定性的影响。本发明运用计算程序foldx在分子动力学模拟的基础上，设计了20个单点突变体。随即构建20个突变体重组表达质粒并在巴斯德毕赤酵母中重组表达并进行单宁酶的活性鉴定，发现突变体r230l失去了单宁酶活性。对剩余19个突变体进行了酶学性质的测定，分析发现热稳定突变使单宁酶酶学性质产生较大变化。19个突变体中仅q234l的最适温度和最适ph未发生变化，认为20℃和ph 5.0，但km增大67％，vmax减小1.46倍，q234位于帽子结构域与α/β水解酶折叠结构域的交界处，在真菌单宁酶中保守，dong等人对此位点突变后黑曲霉单宁酶tan7酶活力下降80％以上，该位点与底物的结合有关。突变体t163l、q211l、r230f、i295n、t437r、a459l、v476e和、s477l的最适温度仍未20℃，最适ph改变为6.0或7.0，而km和vmax则表现为增大和减小。突变体t176l、a222v、s242l、c255p、i295k、t412l、t437k和g475p的最适温度为30℃，s242l最适ph为7.0，其余突变体最适ph则为6.0。以上8个最适温度为30℃的突变体中，仅t158l的km减小和vmax增大。突变体r230f和t163l表现出碱性条件(ph 12.0)下的稳定性增强，突变体i295k和s477l表现出酸性条件(ph 2.0)下的稳定性增强，其余突变体在酸碱条件(ph 2.0和ph 12.0)下的稳定性均有所增强。突变体v476e、g475e、t437k、t412l、i295k、i295n、c255p、s242l和a222v均可不同程度的提高单宁酶的热稳定性，其中g475e、t437k和a222v改善热稳定性的作用尤为突出，g475e、t437k和a222v在60℃处理10min的残余酶活力，相对于aftan2.0的44.9％分别提高了27.4％、32.6％和23.4％。