胆囊癌早期诊断试剂盒及其应用的制作方法

1.本发明属于生物医药技术领域，具体涉及胆囊癌早期诊断试剂盒及其应用。


背景技术：

2.胆囊癌(gbc)是最常见的胆道癌。其发病率显示出很大的地域差异，在智利和印 度等一些国家，妇女的发病率接近30/100000。与其他类型的癌症不同，只有30％的gbc 患者在术前被诊断或怀疑，而其他病例是根据术后偶然发现诊断的。在大多数患者中， 在手术时或由病理学家检查手术标本时识别出肿瘤。大多数有症状的gbc患者都有无法 治愈的肿瘤，即使r0切除后，gbc复发的风险在5年时仍为64％。gbc的临床结果非 常差，尽管在早期(t1)疾病中可以达到75％的5年生存率，但总体5年生存率不到5％。
3.在考虑胆囊癌的潜在风险时，重要的是了解胆囊息肉样病变与gbc之间的关系，从而 明智而及时地进行管理。胆囊息肉的人群患病率约为5％，约占胆囊切除术标本的2
‑
12％。 胆囊上皮内瘤样变(gin)和胆囊腺瘤(gba)是两种常见的良性肿瘤性息肉，由于其可能 的预恶变行为而引起了人们的广泛关注。具体而言，形态学研究表明，在有或没有邻近gin 的情况下，gba向gbc的组织学转变。分子分析表明，tp53和kras在gba和gbc中 通常发生突变，而p16/cyclin
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d1/cdk4细胞周期通路的失调同时与胆囊异型增生和癌细胞有 关。此外，良性gba，恶性改变的gba和浸润性gbc的患者平均年龄逐渐增加。这些观 察结果表明，gba是癌前病变，它通过逐步演变逐渐发展为gbc，这与肠腺瘤到肠癌大致 相似。但是，一些组织学和基因组观测挑战了gba
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gbc序贯模型。最直接的证据是，在进 行胆囊切除术的患者中，gba相对于gbc的频率相对稀少。同样，gba通常伴随gin， 而不是gbc。从形态上讲，即使胆囊癌细胞处于早期或者分化良好的阶段，gbc周边存在 gba成分的现象也很罕见。相较于gba，高级别gin更表现出有助于促进向浸润性gbc 发展的形态学特征。gba中信号通路的改变与gbc中信号通路的改变是不同的。此外，相 比于幽门腺癌型gba，在新生胆囊癌中更经常检测到kras 12位密码子突变。因此，gba、 gin和gbc之间的遗传和进化的关系以及驱动胆囊癌变的分子事件尚不清楚。
4.gbc是一种恶性肿瘤，总生存期较差，对其发病机理和致癌作用的分子研究相对较少。 像大多数上皮癌类型一样，gbc伴随着一系列的癌前组织学和分子变化，这些变化可持续 几十年。如何提供一种能够早期诊断gbc的试剂盒，从而通过临床鉴定高危患者，在gbc 发展前将胆囊摘除。


技术实现要素：

5.因此，本发明的目的在于提供一种早期诊断胆囊癌的试剂盒及其应用。为了实现本发 明的发明目的，拟采用如下技术方案：
6.本发明一方面涉及一种早期诊断胆囊癌的试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括： ctnnb1突变检测试剂和arid2突变检测试剂。本发明通过创造性的研究发现，具有胆囊 息肉的人群中，具有ctnnb1突变和arid2突变的人群属于高危人群，通过本发明的试剂， 能够
早期诊断出胆囊癌的高危人群，从而在腺瘤样息肉进一步恶化形成gbc前将胆囊摘 除避免癌变。
7.在本发明的一个优选实施方式中，所述的试剂盒中还包括tp53突变检测试剂、kras 突变检测试剂、smad4突变检测试剂、pi3kca突变检测试剂和erbb3突变检测试剂中 的一种、两种、三种或者四种。
8.在本发明的另一个优选实施方式中，所述的试剂盒中还包括检测杂合性缺失(loh) 事件的试剂。
9.本发明另一方面还涉及上述试剂盒在制备胆囊癌早期诊断试剂中的应用。
10.在本发明的一个优选实施方式中，所述的早期诊断是指在发生胆囊癌之前具有胆囊腺瘤 息肉的患者。
11.在本发明的一个优选实施方式中，所述的患者优选是指年龄在62岁以上的患者。本发 明通过研究发现在gbc样本中，与年龄相关的特征占突变的>75％，因此，年龄在62岁以 上的患者成为高危人群的可能性较大。
12.在本发明的一个优选实施方式中，所述的早期诊断是指在胆囊癌癌变之前具有胆囊腺瘤 和/或上皮内瘤变的患者。
13.本发明通过一系列共存的gba、gin和gbc中的体细胞变化的全基因组表征，本发明 首次破译了关于胆囊息肉中gbc如何演化的详细分子画像。对来自同一患者的不同类型胆 囊肿瘤(良性和恶性)的同时分析使本发明能够高度自信地重建演化史，这使本发明的研究 与之前对gbc的研究(基于分开的患者人群的癌前病变和癌性病变之间的比较)有所区别。
14.本发明的突变分析强调，所有gba、gin和gbc都是衰老和突变积累的必然结果，其 特征是与年龄相关的突变特征(s1)是在所有肿瘤中观察到的主要成分。这些病症与发病年 龄中位数有关，有症状性胆囊炎的胆囊息肉很少出现在40岁之前，检测gin的中位年龄为 45岁，而gba的中位年龄为50岁，而gbc诊断的中位年龄为71岁。因此可以推测，癌 性病变在早期以小团簇的肿瘤上皮细胞开始，然后随着年龄的增长而增加。在癌变时，突变 驱动的失控增殖通常会选择具有致癌潜力的克隆。与先前的研究相似，本发明观察到gbc 中的多个复发性驱动基因突变，包括tp53，kras，arid2，smad4，pi3kca和erbb3。 值得注意的是，本发明的结果表明ctnnb1突变在细胞从正常细胞生长转变为无法控制的增 殖状态中起着至关重要的作用。先前的研究报道，gba表达的β
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catenin明显高于gbc，并 且62.5％的gba样品在ctnnb13号外显子中具有突变，但gbc的这一比率仅为4.8％。 在本发明的研究案例中，11例患者中有5例具有ctnnb1突变。在这5例病例中的4例中， gbc及其邻近的gba在ctnnb1中共享相同的突变，这表明ctnnb1突变在腺瘤/异型增 生的背景下比单独的gbc更加积极地参与了癌的形成。
15.gbc主要有两种推测的发展途径：(i)仅存在gbc时从头发展；(ii)当gbc与 gba或gin共存时的腺瘤/异型增生
‑
癌序贯模型。但是，尚不清楚如何确定gbc的发展路 径以及gba或gin在后一种模型中是否代表主要的过渡状态。通过对癌症基因组的全面和 多层分析，本发明的研究表明，gbc与相邻gba/gin之间的关系可以分为两条进化路径， 即gbc早期分化和gbc晚期分化。早期分化模型与从头发展路径更一致，在新发发展路径 中，癌在gba和gin发散之前开始并且更独立地发展。相反，gbc
‑
晚期分化模型类似于 腺癌/异型增生
‑
癌序贯模型，其中癌是通过逐步进行的方式从gba或gin演变而来的。关 键的决定因素是初
始阶段的loh和体细胞突变事件的积累是否足以为后续gbc的发展形成 癌基因位。有趣的是，除了体细胞突变，本发明还比较了两条进化路径之间的loh差异， 这突显了在生态位定义过程中丧失功能性肿瘤抑制基因的重要性。在富含可能促进癌基因位 点的loh事件的单个染色体中，chr.5q和chr.7p上的loh与胆囊的早期致癌性改变有关， 重要的是，在正常胆囊中，loh事件很少见。在临床上，本发明的结果表明，主动干预应 重点关注通过无创检测方法识别富含loh的胆囊组织的患者，以便可以将早期或更积极的 胆囊切除术作为gbc的主要预防方法。此外，本发明的结果证实，不典型增生
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癌序贯 (gin
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gbc)和腺瘤
‑
癌序贯(gba
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gbc)都存在于gbc发展中。尽管本发明的gbc晚期 分化组的样本量较小(gin
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gbc，n＝2；gba
‑
gbc，n＝3)，但本发明并未观察到对gba 或gin的显著偏性。尚不清楚胆囊切除术后胆囊管边缘残留的异型增生是否与复发性癌症 的发生率增加相关。因此，及时检测具有肿瘤性生态位的gbc对于决定是否需要无gba/ gin的手术切缘至关重要。
附图说明
16.图1.腺瘤/异型增生相关gbc的研究概况和突变特征
17.(a)总体研究设计。(b)在来自18种tcga癌症类型的i期样本与胆囊癌(gbc) 的tmb分布。(c)gbc和18种tcga癌症类型中不同突变特征(由病因因素注释)的 相对贡献。(b，c)gbc在方框中突出显示。read：直肠腺癌；thca：甲状腺癌；tgct： 睾丸生殖细胞肿瘤；kich：肾嫌色细胞癌；brca：乳腺浸润癌；chol：胆管癌；paad： 胰腺腺癌；kirc：肾透明细胞癌；kirp：肾乳头状细胞癌；lihc：肝细胞癌；hnsc：头 颈部鳞状细胞癌；esca：食道癌；coad：结肠腺癌；stad：胃腺癌；luad：肺腺癌； lusc：肺鳞状细胞癌；skcm：皮肤黑色素瘤。
18.图2.三种类型的胆囊肿瘤之间的突变特征比较
19.(a)每种肿瘤的tmb分布。(b)来自年轻患者(n＝2)和老年患者(n＝9)的肿 瘤样本中的突变数。(c)每种肿瘤的msi得分分布。(d)肿瘤样品中不同突变特征(由 病因注释)的相对贡献。(e)肿瘤图谱显示至少在两名患者中检测到的潜在的驱动突变(不 同灰度代表不同突变类型)。(a
‑
c)方框的中线是中位数，方框的底部和顶部是下四分位 数和上四分位数，须分别延伸到下和上四分位数的1.5
×
间距。p值基于t检验。
20.图3.胆囊肿瘤的系统发生树
21.(a)gbc早期分化组(n＝6)，以及(b)gbc晚期分化组(n＝5)。枝长与标记的 突变数成正比。潜在的驱动突变基因沿分支注释。(c)gbc样本中的突变数，(d)诊断 年龄，以及(e)在gbc早期和gbc晚期分化组中，在gba/gin/gbc的共同祖先状态 下积累的突变。方框中的中线是中位数，方框的底部和顶部是下四分位数和上四分位数，须 分别延伸到下和上四分位数的1.5
×
间距。p值基于wilcoxon秩和检验。
22.图4.gbc早期和gbc晚期分化组中肿瘤的loh和克隆进化比较
23.(a)gbc样品中的loh百分比。(b)gba/gin样品中的loh百分比。 (c)gbc，gba和gin共有的loh百分比。(d)gbc样品中的染色体水平 loh比较。(e)热图显示了基于染色体水平loh状态的样本聚类模式。(f)克 隆数和(g)克隆进化分析中使用的突变数。方框中的中线是中位数，方框的底 部和顶部是下四分位数和上四分位数，须分别延伸到下和上四分位数的1.5
×
间 距。p值基于t检验。图5.gbc发展的进化模型
具体实施方式
24.为了进一步理解本发明，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行 清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施 例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所 有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
25.如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买 获得。
26.实施例1
27.实验方法：
28.患者招募和样本队列
29.所有样本均在中国北京协和医院(pumch)的机构审查委员会(irb)的批准下收集。 每位患者均获得知情和书面同意。本发明招募了11例于2008年4月至2016年12月在 pumch接受胆囊息肉手术切除的患者，并经病理学证实在物理上共存gbc、gba和gin 病变。每个患者的样本均需要gbc、gba、gin和正常胆囊组织。为了使对正常样品的癌 变作用最小化，本发明仅将正常胆囊组织包括在不含癌症的石蜡块中。所有临床数据均从医 院记录中获得。
30.全外显子组测序
31.从代表性的脱蜡石块上切下连续的5
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μm厚的连续切片，并用苏木精染色。多个病理学 家独立确认了诊断，不同的组织学特征和足够的细胞性。使用leica ctr 6000microsystem (德国韦茨拉尔)从每个患者的载玻片分别激光显微切割了gbc、gba、gin和正常组织 这四个成分。根据制造商的规程，使用qiaamp dna ffpe组织试剂盒(德国qiagen)提取 基因组dna(gdna)。然后，使用covaris超声仪(covaris，ma，usa)将0.1μg dna 剪切成200
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300bp片段。修复所得的dna片段并具有3'a尾。将接头连接到片段的两端， 然后选择合适大小。通过聚合酶链反应(pcr)扩增选择的片段。使用sureselect human allexon v6(agilent)按照制造商的方案进行外显子组捕获，然后进行pcr扩增，使用illuminanovaseq测序。
32.体细胞突变和杂合丧失的分析
33.全外显子组测序片段进行质控，仅保留了<3％n碱基和>50％高质量碱基的序列，用于 后续分析。使用burrows
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wheeler aligner(0.7.17)将得到的高质量测序序列与人类参考基因 组(homo_sapiens_assembly19)进行比对。为了提高比对准确性，本发明使用genome analysistoolkit(gatk，版本3.8.1)处理bam文件，包括标记重复比对序列，重新校准碱基质量 以及高质量小片段插入缺失周围区域的局部比对。使用bam
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matcher基于约7,000个高频 snp位点，gbc、gba、gin和正常组织之间的一致性>95％，证实这些组织确实来自同一 患者。本发明使用了tcga mc3 project开发的突变检测分析流程。简而言之，该流程使用 六个软件来检测snv突变，并使用三个软件来检测小片段插入缺失，并带有详细注释。本 发明仅关注满足以下标准的snv突变和插入缺失：1)在正常和肿瘤样品中位点深度≥10
ꢀ×
；2)至少有两个软件支持；3)位于wes探针的捕获区域内。由于所有gbc患者均在 t1时被确诊，为了与其他癌症类型进行公平比较，本发明采用了来自18个tcga癌症类型 的约1200个i期样本突变数据集，这些样本是通过相同的生物信息学分析流程生成的。为 了计算tmb值，本发明仅在本研究与tcga mc3 project中定义的重叠目标区域中使用了错 义/
无义突变或orf移码突变。对于gbc/gba/gin分析，本发明进一步召回了他们的突 变，以提高突变检测的敏感性。根据msings程序包中的2539个基因位点，本发明使用 mantis对每个样品分析了msi状态。对于突变特征，本发明使用deconstructsigs来计算 cosmic数据库(2.0版)所定义的30个已知突变特征的相对贡献。为了识别潜在的驱动基 因突变，本发明检查了通过tcga pancanatlas在33种癌症类型中识别的驱动基因的突变状 态，包括错义突变，无义突变，剪接位点和终止密码子突变。本发明基于全外显子组测序数 据，在facets之后使用snp
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pipeline进行了loh分析。胚系突变是由gatk3.8的 haplotypecaller检测的。
34.系统发育树的构建
35.为了推断同一患者的gbc、gba和gin样品之间的进化关系，本发明分别采用 treeomics和megax的最大简约方法进行分析。根据snv突变，本发明在11位患者中的 10位获得了一致的系统发育拓扑结构。对于其余患者，我们将突变范围拓展至外显子区域 外，即获得了一致的系统发育树。根据系统发育树，本发明根据gbc在gba和gin的共 同祖先之前或之后分化，将11例患者分为两组：一组被标记为gbc早期分化(6例)，另 一组被标记为：gbc晚期分化(5例)。为了消除loh对突变检测的潜在影响，本发明又 使用非loh区中的突变重复构建系统发育树。
36.克隆进化分析
37.本发明采用pyclone(一种基于bayesian聚类方法的统计模型)的beta二项式模型为 每个snv突变的推断出癌细胞比例(ccf)。使用facets评估p03和p07外其他样品的 纯度和倍性，而p03和p07的基因组几乎没有倍性变化。通过control
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freec将倍数设置为 2进一步评估了这两名患者的样本。对于每个snv突变，本发明提取了facets产生的主 要和次要拷贝数。根据pyclone估计，本发明仅计算出突变≥10的那些克隆(突变簇)。
38.实验结果：
39.腺瘤/不典型增生相关胆囊癌的基因组学特征
40.在对大量胆囊肿瘤样品进行严格的病理检查后，本发明从11例诊断为t1肿瘤的患者中 收集了包括正常组织在内的组织样品，其中gbc、gba和gin病变在物理上共存(平均年 龄62岁)。尽管样本量有限，但本发明在本研究中注意到了更多的女性患者(女性：9；男 性：2)，这与流行病学研究中发现的性别偏性结论一致。11例入组患者中p03和p11的诊 断年龄为38岁，其余患者均超过60岁。通过激光显微切割术，本发明分离了gbc、gba、 gin和正常胆囊组织，并对总共44个样本进行了全外显子测序(平均深度：正常组织107
ꢀ×
；gbc 171
×
；gba 188
×
；gin 206
×
)(图1a)。本发明采用了一种有效的、基于多种 软件的mc3方法来检测单核苷酸变异(snv)突变和小片段插入缺失(该方法已用于生成 the cancer genome atlas(tcga)的高质量突变数据)。在来自11位患者的33个肿瘤样 本中，本发明确定了平均214个snv(范围：69
‑
725)和9个插入缺失(范围：3
‑
48)。与 来自tcga的其他18种癌症的i期肿瘤样本相比，本发明的gbc样本显示出中等水平的肿 瘤突变负担(tmb)，与肝脏肝细胞癌(lihc)相似(t检验，p＝0.79)，但明显高于胆 管癌(chol)(t检验，p＝7.3
×
10
‑4，图1b)。
41.为了阐明早期恶性肿瘤的主要诱因，本发明基于30种已建立的突变特征(cosmic突 变特征版本2)分解了tcga癌症类型和gbc的突变谱。该分析证实了一些已知的特征模 式，例如皮肤黑色素瘤(skcm)的紫外线辐射(特征7)和肺癌的吸烟(特征4)(图1c)。 本发明
发现在大多数癌症类型中，i期肿瘤的突变主要是由年龄引起的，尤其是对于大肠癌 (coad/read)、胰腺腺癌(paad)和胃癌(stad)。在gbc样本中，与年龄相关的 特征1占突变的>75％，与apobec相关的特征4占约10％(图1c)。这些结果表明了衰 老过程中积累的突变对于gbc发育的重要性，并提供了与gba/gin共存的gbc突变特 征的首要观点。
42.胆囊肿瘤突变特征比较
43.除了上述恶性肿瘤类型之间的比较，本发明还比较了三种胆囊肿瘤类型之间的突变特 征。本发明发现gbc、gba和gin表现出相似的突变率(配对t检验，p>0.05，图2a)， 但是无论肿瘤类型如何，两名年轻患者(p03和p11)的肿瘤样本显示的突变比老年患者少 (平均值101vs.273，t检验，p<7
×
10
‑5，图2b)。本发明基于大量的高质量微卫星基因位 点进一步量化了这些肿瘤样品的微卫星不稳定性(msi)状态，但未发现肿瘤类型之间存在 显着差异(配对t检验，p>0.05，图2c)。就六种碱基替换类型而言，三种肿瘤类型也显 示出相似的组成。来自同一患者的不同肿瘤通常表现出相似的突变特征模式，但特征组成因 患者而异(图2d)，这表明潜在的诱变机制对患者的特异性比对肿瘤类型的特异性更高。 在33个肿瘤样本中，均存在与年龄相关的特征1。此外，来自患者p10的肿瘤样品显示了 apobec相关的特征2和dna错配修复缺陷(ddmr)相关的特征26。来自患者p05的肿 瘤表现出与apobec相关的特征(特征2和特征13)和与ddmr相关的特征26。来自p02 的肿瘤显示出与pole相关的特征10的贡献较高。来自p03，p06和p08的gbc样品与它 们相应的良性组织(gba和gin)表现出一些特征差异。
44.为了了解肿瘤发展过程中的关键体细胞突变，本发明研究了潜在的体细胞驱动基因。为 了克服相对较小的样本量，本发明只关注了在最近的tcga全癌分析中确定的已知驱动基 因。总共在至少两名患者中观察到16个潜在的驱动基因突变。其中，在11例患者中有5例 检测到ctnnb1和arid2突变，在3例患者中鉴定出tp53和erbb3突变(图2e)。gbc 样本所包含的驱动突变未超过gba或gin。至于特定的突变，五位患者携带了四个不同的ctnnb1突变，分别是：来自p03的所有三个肿瘤样品共有的p.t41i，p07和p10共有p.s45f， p09具有p.s33c以及来自p01的gba和gbc具有p.s45f和p.k335t。这些ctnnb1突变 的polyphen得分>0.9，即这些突变均可能是有害突变。据报道，ctnnb1突变引起与肝肿 瘤进展相关的β
‑
catenin活性改变。该观察结果突出了由ctnnb1突变驱动的β
‑
catenin活性 在gbc肿瘤发生中的细胞转化中的关键作用。对于arid2(pbaf染色质重塑复合体的一 个亚基)的突变，五名患者具有六个突变，但仅有p.q916*被p10的三个肿瘤样本共有，这 表明该患者的arid2功能丧失是驱动因素。这些结果为腺瘤/发育不良相关gbc的发展过程 中的候选驱动基因突变提供了候选清单。
45.由早期loh和突变负荷驱动的两条gbc进化路径
46.体细胞突变为癌症的发展提供了分子足迹。考虑到snv体细胞突变的高可靠性，本发 明根据其snv突变推断出gbc、gba和gin之间的进化关系。为了确保进化树的准确性， 本发明采用了两种独立的方法treeomics和megax，并为所有11例患者观察到非常一致的 肿瘤样本系统发育拓扑结构。根据gbc在gba和gin的共同祖先之前或者之后分化，该 进化树可以分为两组：(i)gba和gin更密切相关的gbc早期分化组(6例)(图3a)； (ii)gbc晚期分化组(5例，其中2例患者gbc与gin更近缘，3例患者中gbc与gba 更近缘)(图3b)。有趣的是，将两名年轻患者(在38岁诊断的p03和p11)分为不同的 组(p03：gbc晚期分化；p11：gbc早期分
化)。具体而言，来自p03的gbc，gba和 gin仅共享一个潜在的驱动突变(ctnnb1.pt41i)，而p11中的gbc具有一个smarca4 突变，而p11中的gin具有一个arid2突变。这些结果表明gbc发展有两种共存的进化途 径：gbc晚期分化模型与传统的腺瘤/异型增生
‑
癌序贯模型更一致，其中良性肿瘤gba/gin 作为gbc的前体。gbc早期分化模型表明gbc的起源更加独立。有趣的是，尽管两组的 突变数和诊断年龄都非常相似(图3c，d)，但在gbc/gin/gbc的共同祖先中获得的突 变数在gbc早期分化组中显著更高(平均值为150vs.36，wilcoxon秩和检验，p<0.05)。 这些结果表明，在肿瘤发展的早期积累的突变负荷影响gbc的进化途径，而不是gbc中的 总突变负荷。
47.为了确定影响gbc进化的其他驱动因素，本发明比较了两组之间gbc样品的基因组特 征，但未发现特定的驱动基因和msi方面有任何显着差异。杂合性缺失(loh)在癌症中 很常见，早期研究已经提出loh的积累与胆囊的癌变有关。有趣的是，本发明观察到早期 分化组中的gbc样品显示出的loh比例高于晚期分化组中的loh比例(平均值为20％ vs.5％，t检验，p＝0.021，图4a)。该观察结果为gbc早期分化组提出了两种可能的演变 方案：(i)在gba/gin/gbc的共同祖先发生了大规模的loh事件，从而导致了gbc 的早期分化；或(ii)与gba/gin分叉后，在gbc中独立发生了loh事件。为了确定更 可能的情况，本发明比较了gba/gin的loh状态，发现它们显示出与gbc样本相同的 模式(平均值为20％对3％，t检验，p＝1.8
×
10
‑4，图4b)。本发明进一步比较了gba/gin /gbc共同祖先的loh状态(通过计算三个肿瘤之间共有的loh区域)，并观察到gbc 早期分化组中的loh事件比gbc晚期组中的loh事件明显更广泛(平均值，13％vs.2％， t检验，p＝0.028，图4c)。
48.最后，为了排除loh区域可能影响基于突变的树构建的可能性，本发明仅 基于非loh区域中的突变重建了进化树，并观察到相同的模式。在染色体水平 上检查gbc样品的loh状态时，本发明发现chr5，chr17，chr18和chr20显示 出最显著的差异(t检验，p<0.05，图4d)。实际上，基于它们的染色体水平loh 状态的胆囊肿瘤的聚集模式很大程度上重新捕获了基于突变的树形拓扑结构的 肿瘤组分类(图4e)。为了获得对克隆进化的更多见解，本发明使用facets估 算了gbc/gba/gin样品的纯度和倍性，然后使用pyclone推断了每位患者的 肿瘤进化克隆数。本发明发现，gbc早期分化组的肿瘤包含的克隆明显多于gbc 晚期分化组的肿瘤(t检验，p＝0.049，图4f)，尽管它们不包含更多的体细胞 突变(t检验，p＝0.4，图4g)。
49.基于这些结果，本发明提出了gbc发展的进化模型，其中在胆囊肿瘤发展的初始阶段 累积的loh事件和体细胞突变的程度是决定癌变后续路径的关键(图5)。在gbc早期分 化路径中，首先发生广泛的loh和突变事件，从而导致gba/gin/gba共同祖先的“癌 变”。gbc获得潜在的癌化能力后倾向于更早分化，并且更独立于gba和gin进化，并 且在微进化过程中有更多克隆。在gbc后分化路径中，最初发生的loh事件和体细胞突变 较少，从而导致了共同祖先的“肿瘤”生态位。肿瘤生态位需要逐步发展才能获得癌变的能 力，而肿瘤的萌芽是基于发育不良或赘生性细胞。从这个生态位，gbc倾向于后来分化， 并发展到gba或gin的中间阶段，并且克隆较少。
50.以上描述了本发明优选实施方式，然其并非用以限定本发明。本领域技术人员对在此 公开的实施方案可进行并不偏离本发明范畴和精神的改进和变化。