聚(3-羟基丁酸-4-羟基丁酸-5-羟基戊酸)三聚物及其微生物生产菌株构建的制作方法

聚(3
‑
羟基丁酸
‑4‑
羟基丁酸
‑5‑
羟基戊酸)三聚物及其微生物生产菌株构建
技术领域
1.本发明涉及生物技术和生物材料领域，具体涉及聚(3
‑
羟基丁酸
‑4‑
羟基丁酸
‑5‑
羟基戊酸)，一种新的聚羟基脂肪酸pha新型三聚物，及其微生物合成代谢通路的构建方法。


背景技术：

2.pha为微生物合成的生物聚酯，单体为羟基脂肪酸。有研究发现该种生物聚酯具有与石油基塑料类似的材料性质，是石油基塑料的替代品，拥有良好的生物相容性和可降解能力（wang y, yin j, chen g q. polyhydroxyalkanoates, challenges and opportunities[j]. current opinion in biotechnology, 2014, 30: 59
‑
65.）。近年来，随着环保意识的逐渐加强，禁塑令的产生以及资源的逐渐枯竭，开发新型可降解、可再生和生物基材料成为大家关注的热点。
[0003]
pha积累于微生物的细胞质中，以包涵体的形式存在。某些微生物可天然生产pha，如聚(3
‑
羟基丁酸)（phb）和聚(3
‑
羟基丁酸
‑3‑
羟基戊酸)（phbv）。pha的合成需要单体分子连接辅酶a变成高能状态，随后在pha聚合酶的催化下连接成为高分子。近年来，随着不同底物特异性的pha聚合酶陆续被发现，pha家族逐渐扩充，已有上百种不同单体的pha可以通过发酵生产获得（choi s y, cho i j, lee y, et al. microbial polyhydroxyalkanoates and nonnatural polyesters[j]. advanced materials, 2020, 32(35): 1907138.）。尽管如此，与石油基塑料相比，pha的种类仍不够丰富，所应用的领域仍相当有限。因此，扩展pha的种类、性能和应用领域仍是很有必要的研究和应用方向。
[0004]
盐单胞菌属为一系列的中等耐盐菌，在1
‑
10%左右的nacl，ph 8
‑
11的环境中可以保持正常生长。在该盐浓度及酸碱度下，一般的微生物均较慢。因此，盐单胞菌在工业生物技术中具有不易染菌的优点。不仅如此，盐单胞菌halomonas bluephagenesis td01 cgmcc. no. 4353, halomonas campaniensis ls21 cgmcc no.6593以及halomonas aydingkolgenesis m1 cgmcc no.19880均为天然的pha生产者，可以在葡萄糖为单一碳源的条件下在胞内积累占干重80%以上的phb。所以，盐单胞菌适合作为生产pha的底盘菌，目前已改造盐单胞菌产出了多种pha，部分产品已经投入产业化（tan d, wang y, tong y, et al. grand challenges for industrializing polyhydroxyalkanoates (phas)[j]. trends in biotechnology, 2021.）。因此，在盐单胞菌中生产新型pha是与产业化最快，实用性最好的选择。


技术实现要素：

[0005]
本技术经过对盐单胞菌的改造，使其在特定底物下发酵生产聚(3
‑
羟基丁酸
‑4‑
羟基丁酸
‑5‑
羟基戊酸)三聚物，该三聚物可以作为石油基塑料的替代品，物理及热力学性能优异，拥有良好的生物相容性和可降解能力。
[0006]
本发明的第一方面，提供了一种盐单胞菌，所述的盐单胞菌的基因组中包含外源
基因，所述的外源基因包含醇脱氢酶基因、醛脱氢酶基因、辅酶a转移酶基因和聚羟基脂肪酸酯合成酶基因。
[0007]
优选的，所述的外源基因还包含琥珀酸半醛脱氢酶基因和4
‑
羟基丁酸脱氢酶。
[0008]
在本发明的一个具体实施方式中，所述的外源基因为醇脱氢酶基因（adhp或dhat）、醛脱氢酶基因aldd、辅酶a转移酶基因orfz和聚羟基脂肪酸酯合成酶基因phac。
[0009]
在本发明的一个具体实施方式中，所述的外源基因为醇脱氢酶基因（adhp或dhat）、醛脱氢酶基因aldd、辅酶a转移酶基因orfz、聚羟基脂肪酸酯合成酶基因phac、琥珀酸半醛脱氢酶基因sucd和4
‑
羟基丁酸脱氢酶4hbd。
[0010]
在本发明的一个具体实施方式中，所述的醇脱氢酶基因adhp来源于盐单胞菌（优选halomonas bluephagenesis）。进一步优选来源于halomonas bluephagenesis td01 cgmcc. no. 4353。其核苷酸序列进一步优选如seq id no：1所示。
[0011]
在本发明的一个具体实施方式中，所述的醇脱氢酶基因dhat的核苷酸序列如seq id no：5第310
‑
1494位核苷酸所示。
[0012]
在本发明的一个具体实施方式中，所述的醛脱氢酶基因aldd来源于盐单胞菌（优选halomonas bluephagenesis）。进一步优选来源于halomonas bluephagenesis td01 cgmcc. no. 4353。其核苷酸序列进一步优选如seq id no：2或seq id no：5中第1501
‑
3021位核苷酸所示。
[0013]
在本发明的一个具体实施方式中，所述的辅酶a转移酶基因orfz来源于克氏梭菌（优选为clostridium klyveri）。其核苷酸序列优选如seq id no：3所示。
[0014]
在本发明的一个具体实施方式中，所述的聚羟基脂肪酸酯合成酶基因phac来源于罗氏真养菌（优选为cupriavidus necator）。其核苷酸序列优选如seq id no：4所示。
[0015]
在本发明的一个具体实施方式中，所述的琥珀酸半醛脱氢酶基因sucd来源于克氏梭菌（优选为clostridium klyveri）。其核苷酸序列优选如seq id no：16所示。
[0016]
在本发明的一个具体实施方式中，所述的4
‑
羟基丁酸脱氢酶4hbd来源于克氏梭菌（优选为clostridium klyveri）。其核苷酸序列优选如seq id no：17所示。
[0017]
当然，改造的盐单胞菌只要包含醇脱氢酶基因（adhp或dhat）、醛脱氢酶基因aldd、辅酶a转移酶基因orfz和/或聚羟基脂肪酸酯合成酶基因phac，或者还包含琥珀酸半醛脱氢酶基因sucd和/或4
‑
羟基丁酸脱氢酶4hbd即可，无需必须是外源引入的，重点在于包含生产聚(3
‑
羟基丁酸
‑4‑
羟基丁酸
‑5‑
羟基戊酸)三聚物的代谢通路。根据具体的出发菌，上述的醇脱氢酶基因（adhp或dhat）、醛脱氢酶基因aldd、辅酶a转移酶基因orfz、聚羟基脂肪酸酯合成酶基因phac、琥珀酸半醛脱氢酶基因sucd或4
‑
羟基丁酸脱氢酶4hbd可以是内源的或者外源的。
[0018]
例如，如果出发菌株为halomonas bluephagenesis td01 cgmcc. no. 4353，因其本身包含醇脱氢酶基因adhp、醛脱氢酶基因aldd，外源基因只要引入辅酶a转移酶基因orfz和聚羟基脂肪酸酯合成酶基因phac，优选还可以引入琥珀酸半醛脱氢酶基因sucd以及4
‑
羟基丁酸脱氢酶4hbd即可。
[0019]
优选的，所述的外源基因在盐单胞菌中表达。
[0020]
优选的，所述的外源基因在一个或多个质粒上表达或者整合至盐单胞菌的基因组上表达。
id no：5第310
‑
1494位核苷酸所示。
[0040]
在本发明的一个具体实施方式中，所述的醛脱氢酶基因aldd来源于盐单胞菌（优选halomonas bluephagenesis）。进一步优选来源于halomonas bluephagenesis td01 cgmcc. no. 4353。其核苷酸序列进一步优选如seq id no：2或seq id no：5中第1501
‑
3021位核苷酸所示。
[0041]
在本发明的一个具体实施方式中，所述的辅酶a转移酶基因orfz来源于克氏梭菌（优选为clostridium klyveri）。其核苷酸序列优选如seq id no：3所示。
[0042]
在本发明的一个具体实施方式中，所述的聚羟基脂肪酸酯合成酶基因phac来源于罗氏真养菌（优选为cupriavidus necator）。其核苷酸序列优选如seq id no：4所示。
[0043]
在本发明的一个具体实施方式中，所述的琥珀酸半醛脱氢酶基因sucd来源于克氏梭菌（优选为clostridium klyveri）。其核苷酸序列优选如seq id no：16所示。
[0044]
在本发明的一个具体实施方式中，所述的4
‑
羟基丁酸脱氢酶4hbd来源于克氏梭菌（优选为clostridium klyveri）。其核苷酸序列优选如seq id no：17所示。
[0045]
所述的外源基因在一个或多个质粒上表达或者被整合到所述盐单胞菌的基因组中表达。
[0046]
所述的盐单胞菌选自halomonas bluephagenesis、halomonas campaniensis或halomonas aydingkolgenesis。
[0047]
在本发明的一个具体实施方式中，所述的盐单胞菌选自halomonas bluephagenesis td01 cgmcc. no. 4353、halomonas campaniensis ls21 cgmcc no.6593或halomonas aydingkolgenesis m1 cgmcc no.19880。
[0048]
所述的制备方法优选为基因编辑例如crispr
‑
cas9等等。基因敲除，基因敲低，异源基因整合基因组等改变细胞代谢过程。
[0049]
优选的，所述的质粒中包含调控序列，所述的调控序列优选为启动子。所述的启动子调控外源基因在盐单胞菌中表达。
[0050]
所述的启动子可以为组成型或诱导型启动子。
[0051]
优选的，所述的组成型启动子可以为组成型孔蛋白基因porin启动子。
[0052]
优选的，所述的组成型启动子可以为低强度启动子、中等强度启动子或高强度启动子。
[0053]
在本发明的一个具体实施方式中，所述的组成型启动子包括但不限于野生型porin启动子、porin211启动子（低强度启动子）、porin42启动子（中等强度启动子）或porin140启动子（高强度启动子）。
[0054]
优选的，所述的诱导型启动子可以为iptg诱导型t7启动子。
[0055]
在本发明的一个具体实施方式中，所述的质粒为py01
‑
py07。其中，py01质粒使用野生型porin启动子表达醇脱氢酶基因dhat、醛脱氢酶基因aldd、辅酶a转移酶基因orfz和pha合成酶基因phac（yin j, fu x z, wu q, et al. development of an enhanced chromosomal expression system based on porin synthesis operon for halophile halomonas sp[j]. applied microbiology and biotechnology, 2014, 98(21): 8987
‑
8997.）。py02质粒使用野生型porin启动子表达醇脱氢酶基因adhp、醛脱氢酶基因aldd
td
、辅酶a转移酶基因orfz和pha合成酶基因phac。py03质粒使用mmp1诱导型启动子表达醇脱氢酶
基因adhp、醛脱氢酶基因aldd
td
、辅酶a转移酶基因orfz和pha合成酶基因phac；py04
‑
py06分别为使用porin211、porin42和porin140启动子表达醇脱氢酶基因adhp、醛脱氢酶基因aldd
td
、辅酶a转移酶基因orfz和pha合成酶基因phac，上述三种启动子选自porin启动子库（shen r, yin j, ye j w, et al. promoter engineering for enhanced p (3hb
‑
co
‑
4hb) production by halomonas bluephagenesis[j]. acs synthetic biology, 2018, 7(8): 1897
‑
1906.），其中porin211为低强度启动子，porin42为中等强度启动子，porin140为高强度启动子。py07质粒使用野生型porin启动子表达醇脱氢酶基因adhp、醛脱氢酶基因aldd
td
、辅酶a转移酶基因orfz、琥珀酸半醛脱氢酶基因sucd、4
‑
羟基丁酸脱氢酶基因4hbd和pha合成酶基因phac。
[0056]
优选的，所述的质粒还包含5’臂和/或3’臂。
[0057]
所述的5’臂为与插入位置5’端同源的dna片段。所述的3’臂为与插入位置3’端同源的dna片段。
[0058]
在本发明的一个具体实施方式中，所述的质粒为peg1
‑
peg6。具体的，通过使用质粒pge1将野生型porin启动子表达的醇脱氢酶基因dhat、醛脱氢酶基因aldd、辅酶a转移酶基因orfz和pha合成酶基因phac（即聚(3
‑
羟基丁酸
‑4‑
羟基丁酸
‑5‑
羟基戊酸)合成通路）整合到微生物（特别是盐单胞菌）的基因组中；pge2将野生型porin启动子表达的醇脱氢酶基因adhp、醛脱氢酶基因aldd
td
、辅酶a转移酶基因orfz和pha合成酶基因phac整合到微生物（特别是盐单胞菌）的基因组中。peg3
‑
peg5分别为使用porin211、porin42和porin140启动子表达醇脱氢酶基因adhp、醛脱氢酶基因aldd
td
、辅酶a转移酶基因orfz和pha合成酶基因phac整合到微生物（特别是盐单胞菌）的基因组中，上述三种启动子选自porin启动子库，其中porin211为低强度启动子，porin42为中等强度启动子，porin140为高强度启动子。pge6将野生型porin启动子表达的醇脱氢酶基因adhp、醛脱氢酶基因aldd
td
、辅酶a转移酶基因orfz和pha合成酶基因phac，琥珀酸半醛脱氢酶基因sucd、4
‑
羟基丁酸脱氢酶基因4hbd整合到微生物（特别是盐单胞菌）的基因组中。
[0059]
在本发明的一个具体实施方式中，所述的质粒的核苷酸序列如seq id no：5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、18或19所示。
[0060]
优选的，所述的制备方法包括将包含外源基因的质粒导入盐单胞菌的基因组的非编码区。
[0061]
在本发明的一个具体实施方式中，所述的外源基因插入盐单胞孔蛋白基因的下游（例如图5b）。
[0062]
在本发明的一个具体实施方式中，所述的外源基因插入盐单胞菌halomonas bluephagenesistd01_00227和halomonas bluephagenesistd01_00228基因间的非编码区（例如图5a）。
[0063]
本发明的第三方面，提供了一种盐单胞菌，所述的盐单胞菌的基因组中导入辅酶a转移酶基因orfz、聚羟基脂肪酸酯合成酶基因phac、琥珀酸半醛脱氢酶基因sucd以及4
‑
羟基丁酸脱氢酶4hbd，使得盐单胞菌中表达orfz蛋白、phac蛋白、sucd蛋白以及4hbd蛋白，所述的盐单胞菌为halomonas bluephagenesis。
[0064]
优选的，所述的盐单胞菌为halomonas bluephagenesis td01 cgmc c. no. 4353。
[0065]
在本发明的一个具体实施方式中，所述的辅酶a转移酶基因orfz来源于克氏梭菌（优选为clostridium klyveri）。其核苷酸序列优选如seq id no：3所示。
[0066]
在本发明的一个具体实施方式中，所述的聚羟基脂肪酸酯合成酶基因phac来源于罗氏真养菌（优选为cupriavidus necator）。其核苷酸序列优选如seq id no：4所示。
[0067]
在本发明的一个具体实施方式中，所述的琥珀酸半醛脱氢酶基因sucd来源于克氏梭菌（优选为clostridium klyveri）。其核苷酸序列优选如seq id no：16所示。
[0068]
在本发明的一个具体实施方式中，所述的4
‑
羟基丁酸脱氢酶4hbd来源于克氏梭菌（优选为clostridium klyveri）。其核苷酸序列优选如seq id no：17所示。
[0069]
本发明的第四方面，提供了一种质粒，所述的质粒包含醇脱氢酶基因（adhp或dhat）、醛脱氢酶基因aldd、辅酶a转移酶基因orfz和/或聚羟基脂肪酸酯合成酶基因phac。
[0070]
优选的，所述的质粒还包含琥珀酸半醛脱氢酶基因sucd和/或4
‑
羟基丁酸脱氢酶4hbd。
[0071]
在本发明的一个具体实施方式中，所述的质粒包含醇脱氢酶基因（adhp或dhat）、醛脱氢酶基因aldd、辅酶a转移酶基因orfz和聚羟基脂肪酸酯合成酶基因phac。
[0072]
在本发明的一个具体实施方式中，所述的质粒包含醇脱氢酶基因（adhp或dhat）、醛脱氢酶基因aldd、辅酶a转移酶基因orfz、聚羟基脂肪酸酯合成酶基因phac、琥珀酸半醛脱氢酶基因sucd和4
‑
羟基丁酸脱氢酶4hbd。
[0073]
在本发明的一个具体实施方式中，所述的醇脱氢酶基因adhp来源于盐单胞菌（优选halomonas bluephagenesis）。进一步优选来源于halomonas bluephagenesis td01 cgmcc. no. 4353。其核苷酸序列进一步优选如seq id no：1所示。
[0074]
在本发明的一个具体实施方式中，所述的醇脱氢酶基因dhat的核苷酸序列如seq id no：5第310
‑
1494位核苷酸所示。
[0075]
在本发明的一个具体实施方式中，所述的醛脱氢酶基因aldd来源于盐单胞菌（优选halomonas bluephagenesis）。进一步优选来源于halomonas bluephagenesis td01 cgmc c. no. 4353。其核苷酸序列进一步优选如seq id no：2或seq id no：5中第1501
‑
3021位核苷酸所示。
[0076]
在本发明的一个具体实施方式中，所述的辅酶a转移酶基因orfz来源于克氏梭菌（优选为clostridium klyveri）。其核苷酸序列优选如seq id no：3所示。
[0077]
在本发明的一个具体实施方式中，所述的聚羟基脂肪酸酯合成酶基因phac来源于罗氏真养菌（优选为cupriavidus necator）。其核苷酸序列优选如seq id no：4所示。
[0078]
在本发明的一个具体实施方式中，所述的琥珀酸半醛脱氢酶基因sucd来源于克氏梭菌（优选为clostridium klyveri）。其核苷酸序列优选如seq id no：16所示。
[0079]
在本发明的一个具体实施方式中，所述的4
‑
羟基丁酸脱氢酶4hbd来源于克氏梭菌（优选为clostridium klyveri）。其核苷酸序列优选如seq id no：17所示。
[0080]
优选的，所述的质粒还包含调控序列。所述的调控序列优选为启动子。所述的启动子可以为组成型或诱导型启动子。
[0081]
优选的，所述的组成型启动子可以为组成型孔蛋白基因porin启动子。
[0082]
优选的，所述的组成型启动子可以为低强度启动子、中等强度启动子或高强度启动子。
[0083]
在本发明的一个具体实施方式中，所述的组成型启动子包括但不限于野生型porin启动子、porin211启动子（低强度启动子）、porin42启动子（中等强度启动子）或porin140启动子（高强度启动子）。
[0084]
优选的，所述的诱导型启动子可以为iptg诱导型t7启动子。
[0085]
在本发明的一个具体实施方式中，所述的质粒为py01
‑
py07。其中，py01质粒使用野生型porin启动子表达醇脱氢酶基因dhat、醛脱氢酶基因aldd、辅酶a转移酶基因orfz和pha合成酶基因phac（yin j, fu x z, wu q, et al. development of an enhanced chromosomal expression system based on porin synthesis operon for halophile halomonas sp[j]. applied microbiology and biotechnology, 2014, 98(21): 8987
‑
8997.）。py02质粒使用野生型porin启动子表达醇脱氢酶基因adhp、醛脱氢酶基因aldd
td
、辅酶a转移酶基因orfz和pha合成酶基因phac。py03质粒使用mmp1诱导型启动子表达醇脱氢酶基因adhp、醛脱氢酶基因aldd
td
、辅酶a转移酶基因orfz和pha合成酶基因phac；py04
‑
py06分别为使用porin211、porin42和porin140启动子表达醇脱氢酶基因adhp、醛脱氢酶基因aldd
td
、辅酶a转移酶基因orfz和pha合成酶基因phac，上述三种启动子选自porin启动子库（shen r, yin j, ye j w, et al. promoter engineering for enhanced p (3hb
‑
co
‑
4hb) production by halomonas bluephagenesis[j]. acs synthetic biology, 2018, 7(8): 1897
‑
1906.），其中porin211为低强度启动子，porin42为中等强度启动子，porin140为高强度启动子。py07质粒使用野生型porin启动子表达醇脱氢酶基因adhp、醛脱氢酶基因aldd
td
、辅酶a转移酶基因orfz、琥珀酸半醛脱氢酶基因sucd、4
‑
羟基丁酸脱氢酶基因4hbd和pha合成酶基因phac。
[0086]
优选的，所述的质粒还包含5’臂和/或3’臂。
[0087]
所述的5’臂为与插入位置5’端同源的dna片段。所述的3’臂为与插入位置3’端同源的dna片段。
[0088]
在本发明的一个具体实施方式中，所述的质粒为peg1
‑
peg6。具体的，通过使用质粒pge1将野生型porin启动子表达的醇脱氢酶基因dhat、醛脱氢酶基因aldd、辅酶a转移酶基因orfz和pha合成酶基因phac（即聚(3
‑
羟基丁酸
‑4‑
羟基丁酸
‑5‑
羟基戊酸)合成通路）整合到微生物（特别是盐单胞菌）的基因组中；pge2将野生型porin启动子表达的醇脱氢酶基因adhp、醛脱氢酶基因aldd
td
、辅酶a转移酶基因orfz和pha合成酶基因phac整合到微生物（特别是盐单胞菌）的基因组中。peg3
‑
peg5分别为使用porin211、porin42和porin140启动子表达醇脱氢酶基因adhp、醛脱氢酶基因aldd
td
、辅酶a转移酶基因orfz和pha合成酶基因phac整合到微生物（特别是盐单胞菌）的基因组中，上述三种启动子选自porin启动子库，其中porin211为低强度启动子，porin42为中等强度启动子，porin140为高强度启动子。pge6将野生型porin启动子表达的醇脱氢酶基因adhp、醛脱氢酶基因aldd
td
、辅酶a转移酶基因orfz和pha合成酶基因phac，琥珀酸半醛脱氢酶基因sucd、4
‑
羟基丁酸脱氢酶基因4hbd整合到微生物（特别是盐单胞菌）的基因组中。
[0089]
在本发明的一个具体实施方式中，所述的质粒的核苷酸序列如seq id no：5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、18或19所示。
[0090]
本发明的第五方面，提供了一种生产聚(3
‑
羟基丁酸
‑4‑
羟基丁酸
‑5‑
羟基戊酸)三聚物的方法，所述的方法包括发酵培养上述任一所述的盐单胞菌。
[0091]
所述的发酵培养的碳源包含葡萄糖，还包含1，4
‑
丁二醇和/或1，5
‑
戊二醇。
[0092]
在本发明的一个具体实施方式中，所述的盐单胞菌过表达醇脱氢酶基因、醛脱氢酶基因、辅酶a转移酶基因和pha合成酶基因。使用的碳源包含葡萄糖、1，4
‑
丁二醇和1，5
‑
戊二醇。
[0093]
1，4
‑
丁二醇和1，5
‑
戊二醇经醇脱氢酶、醛脱氢酶的氧化后，催化成为4
‑
羟基丁酸和5
‑
羟基戊酸单体。随后在辅酶a转移酶的协助下，两种单体分子转化为4
‑
羟基丁酰辅酶a和5
‑
羟基戊酰辅酶a。葡萄糖经过糖酵解变成乙酰辅酶a，随后在硫解酶和乙酰乙酰辅酶a还原酶的催化下成为3
‑
羟基丁酰辅酶a。最后4
‑
羟基丁酰辅酶a、5
‑
羟基戊酰辅酶a以及3
‑
羟基丁酰辅酶a在pha聚合酶的催化下生成聚(3
‑
羟基丁酸
‑4‑
羟基丁酸
‑5‑
羟基戊酸)三聚物（参见附图1）。
[0094]
在本发明的一个具体实施方式中，所述的盐单胞菌过表达醇脱氢酶基因、醛脱氢酶基因、辅酶a转移酶基因、琥珀酸半醛脱氢酶基因、4
‑
羟基丁酸脱氢酶和pha合成酶基因，使用的碳源包含葡萄糖和1，5
‑
戊二醇。
[0095]
1，5
‑
戊二醇经过醇脱氢酶、醛脱氢酶的氧化后，催化成为5
‑
羟基戊酸单体。随后在辅酶a转移酶的协助下，单体分子转化为5
‑
羟基戊酰辅酶a。葡萄糖经过糖酵解变成乙酰辅酶a，随后在细菌自身的硫解酶和乙酰乙酰辅酶a还原酶的催化下成为3
‑
羟基丁酰辅酶a。三羧酸循环中的琥珀酰辅酶a经琥珀酸半醛脱氢酶催化形成琥珀酸半醛脱氢酶基因，随后在4
‑
羟基丁酸脱氢酶的还原下生成4
‑
羟基丁酸单体，在辅酶a转移酶的协助下转化为4
‑
羟基戊酰辅酶a。最后，4
‑
羟基戊酰辅酶a、5
‑
羟基戊酰辅酶a以及3
‑
羟基丁酰辅酶a在pha聚合酶的催化下生成聚(3
‑
羟基丁酸
‑4‑
羟基丁酸
‑5‑
羟基戊酸)三聚物（参见附图1）本发明的第六方面，提供了一种重组菌，所述的重组菌的基因组中包含外源基因。
[0096]
所述的外源基因包含醇脱氢酶基因（adhp或dhat）、醛脱氢酶基因aldd、辅酶a转移酶基因orfz和/或聚羟基脂肪酸酯合成酶基因phac。
[0097]
优选的，所述的外源基因还包含琥珀酸半醛脱氢酶基因sucd和/或4
‑
羟基丁酸脱氢酶4hbd。
[0098]
在本发明的一个具体实施方式中，所述的外源基因为醇脱氢酶基因（adhp或dhat）、醛脱氢酶基因aldd、辅酶a转移酶基因orfz和聚羟基脂肪酸酯合成酶基因phac。
[0099]
在本发明的一个具体实施方式中，所述的外源基因为醇脱氢酶基因（adhp或dhat）、醛脱氢酶基因aldd、辅酶a转移酶基因orfz、聚羟基脂肪酸酯合成酶基因phac、琥珀酸半醛脱氢酶基因sucd和4
‑
羟基丁酸脱氢酶4hbd。
[0100]
在本发明的一个具体实施方式中，所述的醇脱氢酶基因adhp来源于盐单胞菌（优选halomonas bluephagenesis）。进一步优选来源于halomonas bluephagenesis td01 cgmcc. no. 4353。其核苷酸序列进一步优选如seq id no：1所示。
[0101]
在本发明的一个具体实施方式中，所述的醇脱氢酶基因dhat的核苷酸序列如seq id no：5第310
‑
1494位核苷酸所示。
[0102]
在本发明的一个具体实施方式中，所述的醛脱氢酶基因aldd来源于盐单胞菌（优选halomonas bluephagenesis）。进一步优选来源于halomonas bluephagenesis td01 cgmc c. no. 4353。其核苷酸序列进一步优选如seq id no：2或seq id no：5中第1501
‑
3021位核苷酸所示。
[0103]
在本发明的一个具体实施方式中，所述的辅酶a转移酶基因orfz来源于克氏梭菌（优选为clostridium klyveri）。其核苷酸序列优选如seq id no：3所示。
[0104]
在本发明的一个具体实施方式中，所述的聚羟基脂肪酸酯合成酶基因phac来源于罗氏真养菌（优选为cupriavidus necator）。其核苷酸序列优选如seq id no：4所示。
[0105]
在本发明的一个具体实施方式中，所述的琥珀酸半醛脱氢酶基因sucd来源于克氏梭菌（优选为clostridium klyveri）。其核苷酸序列优选如seq id no：16所示。
[0106]
在本发明的一个具体实施方式中，所述的4
‑
羟基丁酸脱氢酶4hbd来源于克氏梭菌（优选为clostridium klyveri）。其核苷酸序列优选如seq id no：17所示。
[0107]
所述的外源基因在一个或多个质粒上表达或者被整合到所述重组菌的基因组中表达。
[0108]
在本发明的一个具体实施方式中，所述的外源基因在质粒上表达。
[0109]
在本发明的一个具体实施方式中，所述的外源基因在染色体上的相同位置或不同位置表达。
[0110]
优选的，所述的外源基因被整合至所述重组菌基因间的非编码区。
[0111]
优选的，所述的外源基因的导入不影响该重组菌中必需基因的表达。进一步优选将外源基因整合至所述重组菌各个必需基因前面或者后面。
[0112]
当然，改造的重组菌只要包含醇脱氢酶基因（adhp或dhat）、醛脱氢酶基因aldd、辅酶a转移酶基因orfz和/或聚羟基脂肪酸酯合成酶基因phac，或者还包含琥珀酸半醛脱氢酶基因sucd和/或4
‑
羟基丁酸脱氢酶4hbd即可，无需必须是外源引入的，重点在于包含生产聚(3
‑
羟基丁酸
‑4‑
羟基丁酸
‑5‑
羟基戊酸)三聚物的代谢通路。根据具体的出发菌，上述的醇脱氢酶基因（adhp或dhat）、醛脱氢酶基因aldd、辅酶a转移酶基因orfz、聚羟基脂肪酸酯合成酶基因phac、琥珀酸半醛脱氢酶基因sucd或4
‑
羟基丁酸脱氢酶4hbd可以是内源的或者外源的。
[0113]
例如，如果出发菌株为halomonas bluephagenesis td01 cgmc c. no. 4353，因其本身包含醇脱氢酶基因adhp、醛脱氢酶基因aldd，外源基因只要引入辅酶a转移酶基因orfz和聚羟基脂肪酸酯合成酶基因phac，优选还可以引入琥珀酸半醛脱氢酶基因sucd以及4
‑
羟基丁酸脱氢酶4hbd即可。
[0114]
所述的外源基因在组成型或诱导型启动子下表达。
[0115]
优选的，所述的组成型启动子可以为组成型孔蛋白基因porin启动子。
[0116]
优选的，所述的组成型启动子可以为低强度启动子、中等强度启动子或高强度启动子。
[0117]
在本发明的一个具体实施方式中，所述的组成型启动子包括但不限于野生型porin启动子、porin211启动子（低强度启动子）、porin42启动子（中等强度启动子）或porin140启动子（高强度启动子）。
[0118]
优选的，所述的诱导型启动子可以为iptg诱导型t7启动子。
[0119]
所述的醇脱氢酶基因（adhp或dhat）、醛脱氢酶基因aldd、辅酶a转移酶基因orfz、聚羟基脂肪酸酯合成酶基因phac、琥珀酸半醛脱氢酶基因sucd和4
‑
羟基丁酸脱氢酶4hbd可以独立地各自在一个或多个启动子的控制下表达。
[0120]
所述的重组菌包含生产聚(3
‑
羟基丁酸
‑4‑
羟基丁酸
‑5‑
羟基戊酸)的合成代谢通
路。
[0121]
所述的重组菌包括但不限于大肠杆菌（优选为escherichia coli mg1655）、乳杆菌、酿酒酵母、假单胞菌、芽孢杆菌、需钠弧菌、盐单胞菌或其组合。优选为halomonas bluephagenesis、halomonas campaniensis或halomonas aydingkolgenesis。
[0122]
在本发明的一个具体实施方式中，所述的重组菌选自halomonas bluephagenesis td01 cgmcc. no. 4353、halomonas campaniensis ls21 cgmcc no.6593或halomonas aydingkolgenesis m1 cgmcc no.19880。
[0123]
本发明的第七方面，提供了一种上述重组菌的制备方法，所述的制备方法包括采用上述质粒将外源基因导入重组菌。
[0124]
优选为基因编辑例如crispr
‑
cas9等等。基因敲除，基因敲低，异源基因整合基因组等改变细胞代谢过程。
[0125]
本发明的第八方面，提供了一种调整聚(3
‑
羟基丁酸
‑4‑
羟基丁酸
‑5‑
羟基戊酸)三聚物中3
‑
羟基丁酸、4
‑
羟基丁酸及5
‑
羟基戊酸的组分比例的方法，所述的方法包括培养上述重组菌或盐单胞菌生产聚(3
‑
羟基丁酸
‑4‑
羟基丁酸
‑5‑
羟基戊酸)三聚物。
[0126]
优选的，采用不同质粒构建的重组菌或盐单胞菌生产聚(3
‑
羟基丁酸
‑4‑
羟基丁酸
‑5‑
羟基戊酸)三聚物。
[0127]
优选的，采用不同强度启动子表达系统控制聚(3
‑
羟基丁酸
‑4‑
羟基丁酸
‑5‑
羟基戊酸)三聚物中3
‑
羟基丁酸、4
‑
羟基丁酸及5
‑
羟基戊酸的组分比例。
[0128]
优选的，所述的不同强度的启动子包括野生型porin启动子、porin211启动子（低强度启动子）、porin42启动子（中等强度启动子）或porin140启动子（高强度启动子）。
[0129]
本发明的第九方面，提供了一种上述的方法制备获得的聚(3
‑
羟基丁酸
‑4‑
羟基丁酸
‑5‑
羟基戊酸)三聚物。
[0130]
本发明中涉及的简写“adhp”代表醇脱氢酶基因，“adhp”为相应蛋白。
[0131]
本发明中涉及的简写“dhat”代表醇脱氢酶基因，“dhat”为相应蛋白。
[0132]
本发明中涉及的简写“aldd”代表醛脱氢酶基因，“aldd”为相应蛋白。
[0133]
本发明中涉及的简写“orfz”代表辅酶a转移酶基因，“orfz”为相应蛋白。
[0134]
本发明中涉及的简写“phac”代表聚羟基脂肪酸酯合成酶基因，“phac”为相应蛋白。
[0135]
本发明中涉及的简写“sucd”代表琥珀酸半醛脱氢酶基因，“sucd”为相应蛋白。
[0136]
本发明中涉及的简写“4hbd”代表4
‑
羟基丁酸脱氢酶基因或蛋白。
附图说明
[0137]
以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：图1：聚(3
‑
羟基丁酸
‑4‑
羟基丁酸
‑5‑
羟基戊酸)的合成通路示意图。
[0138]
图2a：质粒py01的结构示意图。
[0139]
图2b：质粒py02的结构示意图。
[0140]
图2c：质粒py03的结构示意图。
[0141]
图2d：质粒py04的结构示意图。
[0142]
图2e：质粒py05的结构示意图。
na2hpo4·
12h2o，3.3g/l kh2po4，10ml/l微量元素溶液i和1ml/l微量元素溶液ii。其中，微量元素溶液i的组成为：5g/l柠檬酸铁铵，2g/l cacl2，用1m hcl配制。微量元素溶液ii的组成为：100mg/l znso4·
7h2o，30mg/l mncl2·
4h2o，300mg/l h3bo3，200mg/l cocl2·
6h2o，10mg/l cuso4·
5h2o，20mg/l nicl2·
6h2o，30mg/l namoo4·
2h2o，用1m hcl配制。上述试剂购自国药集团化学试剂公司。
[0171]
3）发酵培养条件取步骤1）得到的二级种子液，按照10%的接种量接种到上述发酵培养基中，7.5l发酵罐初始装液3l，发酵体系不灭菌直接发酵。控制温度37℃，初始溶氧控制在30%
‑
50%，通过调节转速和通气来控制溶氧，起始转速200rpm，最大转速800rpm，最大通风量3vvm，转速和通气达到最大后，不控制溶氧；发酵过程中通过补料控制糖浓度在10
‑
15g/l之间，用5m naoh控制发酵ph为8.5。
[0172]
发酵期间需要实时监控发酵状况，控制温度、ph、溶氧、残糖等参数在正常范围内。取样分析频率为每2小时取3
‑
5ml小样一次，每4小时取30ml大样一次；小样用于测定葡萄糖和细胞密度以监控发酵过程和补料速度，大样用于后续的pha含量分析和细胞干重测定。
[0173]
实施例中冷冻干燥的方法：发酵后，取30ml细胞培养液，14000g离心10min，收集菌体沉淀，用水进行洗涤，然后进行冷冻干燥（将装有菌体沉淀的离心管先置于
‑
80℃ 1h，再放入真空冷冻干燥仪中12h），得到冷冻干燥产物。
[0174]
实施例中细胞干重计算方法：以每升发酵后体系中的细胞干重计量。细胞干重的单位为g/l。细胞干重（cdw）=（进行冷冻干燥后的离心管的重量
‑
原空离心管的重量）
÷
0.03；进行冷冻干燥后的离心管的重量和原空离心管的重量，单位均为g；0.03代表0.03l。
[0175]
实施例中菌体pha含量以及各个单体含量的检测方法：冷冻干燥产物进行酯化反应，然后通过气相色谱法（gc）测定单体含量；酯化反应：取30
‑
40mg冷冻干燥产物于酯化管中，加入2ml氯仿和2ml酯化液（含1g/l苯甲酸和3%浓硫酸的甲醇溶液）混匀，加盖密闭，100℃金属浴中酯化4h；冷却至室温后，加入1ml蒸馏水，充分振荡混匀，静置分层；待氯仿相与水完全分离后，取氯仿相进行气相色谱分析；取20
‑
25mg的聚3
‑
羟基丁酸酯(p3hb)、γ
‑
丁内酯或δ
‑
戊内酯进行酯化反应后作为标准样品；气相色谱(gc)分析参数：在岛津gc
‑
2014型气相色谱仪中使用hp
‑
5型色谱柱分离被测物质；设定gc分析升温程序，进样口温度（240℃）、检测器温度（250℃）、起始温度与维持时间（80℃，1.5min）、第一阶段升温（升温速率30℃/min）、第二阶段升温（升温速率40℃/min，升至240℃后维持2min）、总程序时间8min；通过读取气相色谱测得的内标峰面积、标样的pha单体甲酯峰面积、样品的内标峰面积和样品的pha单体甲酯峰面积进行相应pha单体比例的计算。
[0176]
pha的含量（wt%）=(3hb的质量 4hb的质量 5hv的质量)
÷
冷冻干燥产物的质量
×
100%；3hb的含量(mol%)=3hb的摩尔数
÷
(3hb的摩尔数 4hb的摩尔数 5hv的摩尔数)
×
100%；4hb的含量、5hv的含量的计算方法参见3hb的含量。
[0177]
实施例1改造halomonasbluephagenesistd01cgmcc.no.4353用于生产聚(3
‑
羟基丁酸
‑4‑
羟基丁酸
‑5‑
羟基戊酸)一、质粒及生产菌构建1.质粒py01
‑
py07的构建py01
‑
py07质粒的骨架为pseva321（质粒参见mart
í
nez
‑
garc
í
ae,apariciot,go
ñ
i
‑
morenoa,etal.seva2.0:anupdateofthestandardeuropeanvectorarchitectureforde
‑
/re
‑
constructionofbacterialfunctionalities[j].nucleicacidsresearch,2015,43(d1):d1183
‑
d1189.）制备质粒py01，质粒py01的结构示意图如图2a所示，为环形质粒，序列如seqidno：5所示。
[0178]
其中，第44
‑
261位核苷酸为porin启动子（genbankaccessioncp007757.1）及其rbs，第310
‑
1494位核苷酸为dhat基因（genbankaccessionae015451.2），第1501
‑
3021位核苷酸为aldd基因（genbankaccessionae015451.2），第4890
‑
6179位核苷酸为orfz基因（genbankaccessionl21902.1），第3060
‑
4829位核苷酸为phac基因（genbankaccessionj05003.1）。
[0179]
制备质粒py02，质粒py02的结构示意图如图2b所示，为环形质粒，序列如seqidno：6所示。。
[0180]
其中，第44
‑
261位核苷酸为porin启动子（genbankaccessioncp007757.1）及其rbs，第1964
‑
2980位核苷酸为adhp基因（genbankaccessioncp007757.1），第310
‑
1830位核苷酸为aldd
td
基因（genbankaccessioncp007757.1），第4849
‑
6138位核苷酸为orfz基因（genbankaccessionl21902.1），第3019
‑
4788位核苷酸为phac基因（genbankaccessionj05003.1）。
[0181]
制备质粒py03，质粒py03的结构示意图如图2c所示，为环形质粒，序列如seqidno：7所示。
[0182]
其中，第1901
‑
2917位核苷酸为adhp基因（genbankaccessioncp007757.1），第247
‑
1767位核苷酸为aldd
td
基因（genbankaccessioncp007757.1），第4786
‑
6075位核苷酸为orfz基因（genbankaccessionl21902.1），第2956
‑
4725位核苷酸为phac基因（genbankaccessionj05003.1）。
[0183]
制备质粒py04，质粒py04的结构示意图如图2d所示，为环形质粒，序列如seqidno：8所示。
[0184]
其中，第44
‑
215位核苷酸为porin211启动子及其rbs，第1870
‑
2886位核苷酸为adhp基因（genbankaccessioncp007757.1），第216
‑
1736位核苷酸为aldd
td
基因（genbankaccessioncp007757.1），第4755
‑
6044位核苷酸为orfz基因（genbankaccession2l21902.1），第2925
‑
4694位核苷酸为phac基因（genbankaccessionj05003.1）。
[0185]
制备质粒py05，质粒py05的结构示意图如图2e所示，为环形质粒，序列如seqid
no：9所示。
[0186]
其中，第44
‑
215位核苷酸为porin42启动子及其rbs，第1870
‑
2886位核苷酸为adhp基因（genbankaccessioncp007757.1），第216
‑
1736位核苷酸为aldd
td
基因（genbankaccessioncp007757.1），第4755
‑
6044位核苷酸为orfz基因（genbankaccession2l21902.1），第2925
‑
4694位核苷酸为phac基因（genbankaccessionj05003.1）。
[0187]
制备质粒py06，质粒py06的结构示意图如图2f所示，为环形质粒，序列如seqidno：10所示。
[0188]
其中，第44
‑
215位核苷酸为porin140启动子及其rbs，第1870
‑
2886位核苷酸为adhp基因（genbankaccessioncp007757.1），第216
‑
1736位核苷酸为aldd
td
基因（genbankaccessioncp007757.1），第4755
‑
6044位核苷酸为orfz基因（genbankaccession2l21902.1），第2925
‑
4694位核苷酸为phac基因（genbankaccessionj05003.1）。
[0189]
制备质粒py07，质粒py07的结构示意图如图2g所示，为环形质粒，序列如seqidno：18所示。
[0190]
其中，第44
‑
261位核苷酸为porin启动子（genbankaccessioncp007757.1）及其rbs，第1964
‑
2980位核苷酸为adhp基因（genbankaccessioncp007757.1），第310
‑
1830位核苷酸为aldd
td
基因（genbankaccessioncp007757.1），第4849
‑
6138位核苷酸为orfz基因（genbankaccessionl21902.1），第3019
‑
4788位核苷酸为phac基因（genbankaccessionj05003.1），第6226
‑
7587位核苷酸为sucd基因（genbankaccessionl21902.1），第7614
‑
8729位核苷酸为4hbd基因（genbankaccessionl21902.1）。
[0191]
2.质粒pge1
‑
pge6的构建制备质粒pge1，质粒pge1的结构示意图如图3a所示，为环形质粒，序列如seqidno：11所示。
[0192]
其中，第1
‑
1000位核苷酸为上游同源臂（genbankaccessioncp007757.1），第7222
‑
7438位核苷酸为porin启动子（genbankaccessioncp007757.1）及其rbs，第9141
‑
10157位核苷酸为adhp基因（genbankaccessioncp007757.1），第7487
‑
9007位核苷酸为aldd
td
基因（genbankaccessioncp007757.1），第12026
‑
13315位核苷酸为orfz基因（genbankaccessionl21902.1），第10196
‑
11965位核苷酸为phac基因（genbankaccessionj05003.1）。第6222
‑
7221位核苷酸为下游同源臂（genbankaccessioncp007757.1）。
[0193]
制备质粒pge2，质粒pge2的结构示意图如图3b所示，为环形质粒，序列如seqidno：12所示。
[0194]
其中，第1
‑
1000位核苷酸为上游同源臂（genbankaccessioncp007757.1），第7222
‑
7438位核苷酸为porin启动子（genbankaccessioncp007757.1）及其rbs，第9141
‑
10157位核苷酸为adhp基因（genbankaccessioncp007757.1），第7487
‑
9007位核苷酸为aldd
td
基因（genbankaccessioncp007757.1），第12026
‑
13315位核苷酸为orfz基因（genbankaccessionl21902.1），第10196
‑
11965位核苷酸为phac基因（genbankaccessionj05003.1）。第6222
‑
7221位核苷酸为下游同源臂（genbankaccessioncp007757.1）。
[0195]
制备质粒pge3，质粒pge3的结构示意图如图3c所示，为环形质粒，序列如seqid
no：13所示。
[0196]
其中，第1
‑
1000位核苷酸为上游同源臂（genbank accession cp007757.1），第7222
‑
7393位核苷酸为porin211启动子其rbs，第9048
‑
10064位核苷酸为adhp基因（genbank accession cp007757.1），第7394
‑
8914位核苷酸为aldd
td
基因（genbank accession cp007757.1），第11933
‑
13222位核苷酸为orfz基因（genbank accession l21902.1），第10103
‑
11872位核苷酸为phac基因（genbank accession j05003.1）。第6222
‑
7221位核苷酸为下游同源臂（genbank accession cp007757.1）。
[0197]
制备质粒pge4，质粒pge4的结构示意图如图3d所示，为环形质粒，序列如seq id no：14所示。
[0198]
其中，第1
‑
1000位核苷酸为上游同源臂（genbank accession cp007757.1），第7222
‑
7393位核苷酸为porin42启动子其rbs，第9048
‑
10064位核苷酸为adhp基因（genbank accession cp007757.1），第7394
‑
8914位核苷酸为aldd
td
基因（genbank accession cp007757.1），第11933
‑
13222位核苷酸为orfz基因（genbank accession l21902.1），第10103
‑
11872位核苷酸为phac基因（genbank accession j05003.1）。第6222
‑
7221位核苷酸为下游同源臂（genbank accession cp007757.1）。
[0199]
制备质粒pge5，质粒pge5的结构示意图如图3e所示，为环形质粒，序列如seq id no：15所示。
[0200]
其中，第1
‑
1000位核苷酸为上游同源臂（genbank accession cp007757.1），第7222
‑
7393位核苷酸为porin140启动子其rbs，第9048
‑
10064位核苷酸为adhp基因（genbank accession cp007757.1），第7394
‑
8914位核苷酸为aldd
td
基因（genbank accession cp007757.1），第11933
‑
13222位核苷酸为orfz基因（genbank accession l21902.1），第10103
‑
11872位核苷酸为phac基因（genbank accession j05003.1）。第6222
‑
7221位核苷酸为下游同源臂（genbank accession cp007757.1）。
[0201]
制备质粒pge6，质粒pge6的结构示意图如图3f所示，为环形质粒，序列如seq id no：19所示。
[0202]
其中，第1
‑
1000位核苷酸为上游同源臂（genbank accession cp007757.1），第7222
‑
7438位核苷酸为porin启动子（genbank accession cp007757.1）及其rbs，第9141
‑
10157位核苷酸为adhp基因（genbank accession cp007757.1），第7487
‑
9007位核苷酸为aldd
td
基因（genbank accession cp007757.1），第12026
‑
13315位核苷酸为orfz基因（genbank accession l21902.1），第10196
‑
11965位核苷酸为phac基因（genbankaccession j05003.1）。第13403
‑
14767位核苷酸为sucd基因（genbank accession l21902.1），第14791
‑
15903位核苷酸为4hbd基因（genbank accession l21902.1）。第6222
‑
7221位核苷酸为下游同源臂（genbank accession cp007757.1）。
[0203]
3. 重组菌的构建实施例使用的pq08质粒（质粒参见qin q, ling c, zhao y, et al. crispr/cas9 editing genome of extremophile halomonas spp[j]. metabolic engineering, 2018, 47: 219
‑
229.）。
[0204]
将质粒py01
‑
py07中的任一个与pq08质粒通过接合转化方式分别转入盐单胞菌halomonas bluephagenesis td01 cgmcc. no. 4353中，得到的盐单胞菌分别命名为
halomonas bluephagenesis（py01）、halomonas bluephagenesis（py02）、halomonas bluephagenesis（py03）、halomonas bluephagenesis（py04）、halomonas bluephagenesis（py05）、halomonas bluephagenesis（py06）、halomonas bluephagenesis（py07）。
[0205]
二、改造后的盐单胞菌halomonas bluephagenesis的摇瓶表征1. 制备halomonas bluephagenesis的种子液。
[0206]
2. 摇瓶发酵培养实验取2.5ml步骤1得到的重组盐单胞菌halomonas bluephagenesis(py01)，halomonas bluephagenesis(py02)和对照菌种子液，接种于含47.5ml摇瓶培养基的500ml摇瓶，37℃、200rpm振荡培养48小时。
[0207]
摇瓶培养结束后，进行细胞干重测定、pha含量以及单体含量的测定。进行三次重复试验，每次重复试验设置三个重复处理，结果取平均值。
[0208]
气相色谱结果显示，标样中3hb，4hb和5hv单体在gc色谱中的出峰时间分别为2.1min，2.5min和3.4min，利用重组盐单胞菌所生产的p34hb5hv各组分的出峰位置与之一致。
[0209]
结果见表1。以葡萄糖为单一碳源的对照组菌halomonas bluephagenesis(py01)，halomonas bluephagenesis(py02)仅能积累phb，以葡萄糖，1，4
‑
丁二醇为碳源的对照组菌halomonas bluephagenesis(py01)，halomonas bluephagenesis(py02)仅能积累p34hb，以葡萄糖，1，5
‑
戊二醇为碳源的对照组菌halomonas bluephagenesis(py01)，halomonas bluephagenesis(py02)仅能积累phb5hv，均无法聚合形成p34hb5hv。以葡萄糖，1，4
‑
丁二醇，1，5
‑
戊二醇为碳源进行摇瓶培养的情况下，两株重组菌株均可以生产出p34hb5hv，其中halomonas bluephagenesis(py02)可以得到65.6%含量的p34hb5hv，细胞干重为7.2g/l，3hb的比例可以为36.1%，4hb的比例为23.3%，5hv的比例为40.6%。而野生型对照halomonas bluephagenesistd01的摇瓶结果中无法检测到4hb和5hv组分，证明了外源引入的特异性pha聚合酶phac能够成功聚合以上三种单体。而作为该pha合成途径的关键蛋白，醇脱氢酶、醛脱氢酶和辅酶a转移酶则在p34hb5hv的合成中发挥重要作用。halomonas bluephagenesis(py01)与halomonas bluephagenesis（py02）相对比，halomonas bluephagenesis(py02)产出pha的4hb与5hv的比例要更高，说明该菌株聚合4hb与5hv的能力更强，可能更符合实际需求。
[0210]
表1：halomonas bluephagenesis (py01)、halomonas bluephagenesis (py02)发酵生产p34hb5hv的实验结果
nd表示没有检测到相应单体的特征峰。
[0211]
为了进一步增加产量，使用了不同强度的启动子来表达p34hb5hv的生产通路。启动子分别为porin211（低强度），porin42（中强度），porin140（高强度）（shen r, yin j, ye j w, et al. promoter engineering for enhanced p (3hb
‑
co
‑
4hb) production by halomonas bluephagenesis[j]. acs synthetic biology, 2018, 7(8): 1897
‑
1906.）。分别对应质粒py04、py05和py06。结果如表2所示，强启动子下4hb与5hv组分比例上升，而干重对比弱启动子有下降。在porin140启动子下，halomonas bluephagenesis(py06)可以生产出69.1%含量的p34hb5hv，细胞干重为7.6g/l，3hb的比例可以为43.5%，4hb的比例为20.8%，5hv的比例为35.7%。与halomonas bluephagenesis(py02)相当。结果说明halomonas bluephagenesis可以在不同强度启动子的表达下产出不同比例的p34hb5hv。
[0212]
表2：不同强度启动子发酵生产p34hb5hv的实验结果
随后，halomonas bluephagenesis(py03)的性质也得到了表征。
[0213]
鉴于halomonas bluephagenesis(py03)需要iptg诱导产生三聚物，摇瓶实验中iptg的量分别设置为0mg/l，10mg/l，20mg/l，50mg/l，100mg/l，200mg/l。结果如表3所示，以葡萄糖为单一碳源的对照组菌halomonas bluephagenesis(py03)仅能积累phb；以葡萄糖，1，4
‑
丁二醇，1，5
‑
戊二醇为碳源进行摇瓶培养的情况下，改造后的盐单胞菌可以生产出p34hb5hv，其中halomonas bluephagenesis(py03)在100mg/l的iptg诱导下，可以得到61.1%含量的p34hb5hv，细胞干重为6.8g/l，3hb的比例可以为43.2%，4hb的比例为17.5%，5hv的比例为39.3%。而野生型对照halomonas bluephagenesistd01的摇瓶结果中无法检测到4hb和5hv组分，证明了诱导表达系统可以在halomonas bluephagenesis中生产p34hb5hv。
[0214]
表3：halomonas bluephagenesis (py03)诱导发酵生产p34hb5hv的实验结果nd表示没有检测到相应单体的特征峰。
[0215]
盐单胞菌可以葡萄糖为原料生产出含p4hb的聚合物（ye j, hu d, che x, et al. engineering of halomonas bluephagenesis for low cost production of poly (3
‑
hydroxybutyrate
‑
co
‑4‑
hydroxybutyrate) from glucose[j]. metabolic engineering, 2018, 47: 143
‑
152.）。因此，我们试图在盐单胞菌halomonas bluephagenesis中表达琥珀酸半醛脱氢酶和4
‑
羟基丁酸脱氢酶，构建一条以葡萄糖为底物生产4hb聚合物组分的通路。
[0216]
结果见表4。以葡萄糖为单一碳源的对照组菌halomonas bluephagenesis(py07)仅能积累p34hb，以葡萄糖，1，5
‑
戊二醇为碳源进行摇瓶培养的情况下可以生产出73.6%的
p34hb5hv，细胞干重为7.9g/l，3hb的比例可以为69.8%，4hb的比例为15.2%，5hv的比例为15.0%。而作为该pha合成途径的关键蛋白，醇脱氢酶、醛脱氢酶、琥珀酸半醛脱氢酶和4
‑
羟基丁酸脱氢酶和辅酶a转移酶则在p34hb5hv的合成中发挥重要作用。所述重组菌halomonas bluephagenesis(py07)可被用作p34hb5hv的生产菌。
[0217]
表4：halomonas bluephagenesis (py07)中双碳源发酵生产p34hb5hv的实验结果nd表示没有检测到相应单体的特征峰。
[0218]
三、以halomonas bluephagenesis（py02）进行发酵罐生产1. 对照组（葡萄糖为单一碳源）发酵条件：采用分批补料方式。控制补料速度维持培养基糖浓度在10
‑
15g/l左右，直至发酵结束。
[0219]
2. 实验组（葡萄糖，1，4
‑
丁二醇，1，5
‑
戊二醇三碳源）发酵条件：采用与上述对照组相同的底料。葡萄糖补料方式与上文相同。在发酵的第24h一次性加入20g/l的1，4
‑
丁二醇和1，5
‑
戊二醇。
[0220]
经过48小时连续发酵后将菌液离心、水洗、冰干后得到待测样品，并通过气相色谱检测(条件和方法同上)，结果见表5。halomonas bluephagenesis（py02）可以利用葡萄糖，1，4
‑
丁二醇和1，5
‑
戊二醇作为碳源在放大发酵中生产p34hb5hv，发酵终点的3hb的比例为40.4%，4hb的比例为20.5%，5hv的比例为39.1%。
[0221]
表5：halomonas bluephagenesis（py02）的发酵实验结果nd表示没有检测到相应单体的特征峰。
[0222]
四、以halomonas bluephagenesis（py07）进行发酵罐生产1. 对照组（葡萄糖为单一碳源）发酵条件：采用分批补料方式。控制补料速度维持培养基糖浓度在10
‑
15g/l左右，直至发酵结束。
[0223]
2. 实验组（葡萄糖，1，5
‑
戊二醇双碳源）发酵条件：采用与上述对照组相同的底料。葡萄糖补料方式与上文相同。在发酵的第24h一次性加入20g/l的1，5
‑
戊二醇。
[0224]
经过48小时连续发酵后将菌液离心、水洗、冰干后得到待测样品，并通过气相色谱检测(条件和方法同上)，结果见表6。halomonas bluephagenesis（py07）可以利用葡萄糖和1，5
‑
戊二醇双碳源在放大发酵中生产p34hb5hv，发酵终点的3hb的比例为62.7%，4hb的比例为17.6%，5hv的比例为19.7%。
[0225]
表6：halomonas bluephagenesis（py07）的发酵实验结果nd表示没有检测到相应单体的特征峰。
[0226]
五、通路相关基因的基因组整合及发酵罐生产将质粒peg1
‑
peg6与pq08质粒对照组接合进halomonas bluephagenesis td01 cgmcc. no. 4353中，待菌落长出后，以pcr验证的方式确定整合菌落，测序后丢掉上述质粒，得到菌株halomonas bluephagenesisv345（插入基因组中的位置为td01_00227和td01_00228基因间的非编码区，参见图5a），halomonas bluephagenesisv346（插入位置为孔蛋白基因的下游，参见图5b），halomonas bluephagenesis v347（插入基因组中的位置为td01_00227和td01_00228基因间的非编码区，参见图5a），halomonas bluephagenesisv348（插入基因组中的位置为td01_00227和td01_00228基因间的非编码区，参见图5a），halomonas bluephagenesis v349（插入基因组中的位置为td01_00227和td01_00228基因间的非编码区，参见图5a）和halomonas bluephagenesis v350（插入基因组中的位置为halomonas bluephagenesis td01_00227和halomonas bluephagenesis td01_00228基因间的非编码区，参见图5a）。
[0227]
六、基因组整合后的halomonas bluephagenesis发酵罐生产1. 对照组（葡萄糖为单一碳源）发酵条件：采用分批补料方式。控制补料速度维持培养基糖浓度在10
‑
15g/l左右，直至发酵结束。
[0228]
2. 实验组发酵条件：采用与上述对照组相同的底料。葡萄糖补料方式与上文相同。在发酵的第24h一次性加入20g/l的1，4
‑
丁二醇和1，5
‑
戊二醇（或20g/l 1，5
‑
戊二醇）。菌株为halomonas bluephagenesisv345和halomonas bluephagenesisv346，halomonas bluephagenesis347，halomonas bluephagenesisv348，halomonas bluephagenesis v349和halomonas bluephagenesisv350。其中菌株halomonas bluephagenesisv345
‑
v349使用葡萄糖，1，4
‑
丁二醇和1，5
‑
戊二醇三碳源发酵；halomonas bluephagenesis v350使用葡萄糖和1，5
‑
戊二醇双碳源发酵。
[0229]
经过48小时连续发酵后将菌液离心、水洗、冰干后得到待测样品，并通过气相色谱检测(条件和方法同上)，结果见表7。重组菌halomonas bluephagenesisv345可以利用葡萄糖，1，4
‑
丁二醇和1，5
‑
戊二醇作为三碳源在放大发酵中生产p34hb5hv，发酵终点的3hb的比例为63.3%，4hb的比例为12.6%，5hv的比例为25.1%。halomonas bluephagenesisv346发酵终点的3hb的比例为52.6%，4hb的比例为20.1%，5hv的比例为27.3%。halomonas bluephagenesisv347发酵终点的3hb的比例为81.7%，4hb的比例为7.3%，5hv的比例为11.0%。halomonas bluephagenesisv348发酵终点的3hb的比例为73.6%，4hb的比例为10.7%，5hv的比例为15.7%。halomonas bluephagenesisv349发酵终点的3hb的比例为67.1%，4hb的比例为17.9%，5hv的比例为15.0%。halomonas bluephagenesisv350发酵终点
的3hb的比例为74.3%，4hb的比例为14.1%，5hv的比例为11.6%。
[0230]
表7：halomonas bluephagenesis v345
‑
v350的发酵实验结果nd表示没有检测到相应单体的特征峰。
[0231]
实施例2改造盐单胞菌halomonas campaniensis ls21 cgmcc no.6593可控生产p34hb5hv一．构建生产菌
将质粒py01
‑
py07中的任一个与pq08质粒（质粒构建同实施例1）通过接合转化方式分别转入盐单胞菌halomonas campaniensis ls21 cgmcc no.6593中，得到的盐单胞菌分别命名为h. ls21(py01)、h. ls21(py02)、h. ls21(py03)、h. ls21(py04)、h. ls21(py05)、h. ls21(py06)、h. ls21(py07)。
[0232]
二．表征1. 制备种子液。
[0233]
2. 取2.5ml步骤1得到的盐单胞菌种子液，接种于含47.5ml摇瓶培养基的500ml摇瓶，37℃、200rpm振荡培养48小时。
[0234]
摇瓶培养结束后，进行细胞干重测定、pha含量以及单体含量的测定。进行三次重复试验，每次重复试验设置三个重复处理，结果取平均值。
[0235]
气相色谱结果显示，标样中3hb，4hb和5hv单体在gc色谱中的出峰时间分别为2.1min，2.5min和3.4min，利用改造后的盐单胞菌所生产的p34hb5hv各组分的出峰位置与之一致。
[0236]
结果见表8。以葡萄糖为单一碳源的对照组菌halomonas campaniensis ls21 cgmcc no.6593 [h. ls21(py01)]，h. ls21(py02)仅能积累phb，以葡萄糖，1，4
‑
丁二醇为碳源的对照组菌h. ls21(py01), h. ls21(py02)仅能积累p34hb，以葡萄糖，1，5
‑
戊二醇为碳源的对照组菌h. ls21(py01), h. ls21(py02)仅能积累phb5hv，均无法聚合形成p34hb5hv。以葡萄糖，1，4
‑
丁二醇，1，5
‑
戊二醇为碳源进行摇瓶培养的情况下，h. ls21(py01)、h. ls21(py02)均可以生产出p34hb5hv，其中h. ls21 (py02)可以得到59.4%含量的p34hb5hv，细胞干重为6.8g/l，3hb的比例可以为43.8%，4hb的比例为17.6%，5hv的比例为38.5%。而野生型对照h. ls21 cgmcc no.6593的摇瓶结果中无法检测到4hb和5hv组分，证明了外源引入的特异性pha聚合酶phac能够成功聚合以上三种单体。而作为该pha合成途径的关键蛋白，醇脱氢酶、醛脱氢酶和辅酶a转移酶则在p34hb5hv的合成中发挥重要作用。h. ls21 (py01)与h. ls21 (py02)相对比，h. ls21 (py02)产出pha的4hb与5hv的比例要更高，说明该菌株聚合4hb与5hv的能力更强，可能更符合实际需求。所述重组菌h. ls21 (py02)可被用作p34hb5hv的生产菌。
[0237]
表8：h. ls21(py01)、h. ls21(py02)发酵生产p34hb5hv的实验结果
nd表示没有检测到相应单体的特征峰。
[0238] 为了进一步增加产量，使用了不同强度的启动子来表达p34hb5hv的生产通路。启动子分别为porin211（低强度），porin42（中强度），porin140（高强度）。分别对应质粒py04、py05和py06。结果如表9所示，强启动子下4hb与5hv组分比例上升，而干重对比弱启动子有下降。在porin140启动子下，h. ls21(py06)可以生产出57.7%含量的p34hb5hv，细胞干重为7.1g/l，3hb的比例可以为56.5%，4hb的比例为17.8%，5hv的比例为25.7%。与h. ls21(py02)相当。结果说明改造后的h. ls21可以在不同强度启动子的表达下产出不同比例的p34hb5hv。
[0239]
表9：不同强度启动子发酵生产p34hb5hv的实验结果随后，h. ls21(py03)的性质也得到了表征。鉴于h. ls21(py03)需要iptg诱导产生三聚物，摇瓶实验中iptg的量分别设置为0mg/l，10mg/l，20mg/l，50mg/l，100mg/l，
200mg/l。结果如表10所示，以葡萄糖为单一碳源的对照组菌h. ls21 (py03)，h. ls21(py03)仅能积累phb；以葡萄糖，1，4
‑
丁二醇，1，5
‑
戊二醇为碳源进行摇瓶培养的情况下，重组菌株可以生产出p34hb5hv，其中h. ls21 (py03)可以得到56.2%含量的p34hb5hv，细胞干重为6.4g/l，3hb的比例可以为53.1%，4hb的比例为15.5%，5hv的比例为31.4%。而野生型对照h. ls21的摇瓶结果中无法检测到4hb和5hv组分，证明了诱导表达系统可以在h. ls21中生产p34hb5hv。
[0240]
表10：诱导发酵生产p34hb5hv的实验结果nd表示没有检测到相应单体的特征峰。
[0241]
在盐单胞菌h. ls21中表达琥珀酸半醛脱氢酶和4
‑
羟基丁酸脱氢酶，构建一条以葡萄糖为底物生产4hb聚合物组分的通路。结果见表11。以葡萄糖为单一碳源的对照组菌h. ls21(py07)仅能积累p34hb，以葡萄糖，1，5
‑
戊二醇为碳源进行摇瓶培养的情况下可以生产出76.3%的p34hb5hv，细胞干重为7.2g/l，3hb的比例可以为75.1%，4hb的比例为11.3%，5hv的比例为13.6%。而作为该pha合成途径的关键蛋白，醇脱氢酶、醛脱氢酶、琥珀酸半醛脱氢酶和4
‑
羟基丁酸脱氢酶和辅酶a转移酶则在p34hb5hv的合成中发挥重要作用。
[0242]
表11：h. ls21(py07)双碳源发酵生产p34hb5hv的实验结果nd表示没有检测到相应单体的特征峰。
[0243]
三、h. ls21(py02)进行发酵罐生产
1. 对照组（葡萄糖为单一碳源）发酵条件：采用分批补料方式。控制补料速度维持培养基糖浓度在10
‑
15g/l左右，直至发酵结束。
[0244]
2. 实验组（葡萄糖，1，4
‑
丁二醇，1，5
‑
戊二醇三碳源）发酵条件：采用与上述对照组相同的底料。葡萄糖补料方式与上文相同。在发酵的第24h一次性加入20g/l的1，4
‑
丁二醇和1，5
‑
戊二醇。
[0245]
经过48小时连续发酵后将菌液离心、水洗、冰干后得到待测样品，并通过气相色谱检测(条件和方法同上)，结果见表12。重组菌h. ls21(py02)可以利用葡萄糖，1，4
‑
丁二醇和1，5
‑
戊二醇作为三碳源在放大发酵中生产p34hb5hv，发酵终点的3hb的比例为58.5%，4hb的比例为22.3%，5hv的比例为19.2%。
[0246]
表12：h. ls21(py02)的发酵实验结果四、以重组菌h. ls21（py07）进行发酵罐生产1. 对照组（葡萄糖为单一碳源）发酵条件：采用分批补料方式。控制补料速度维持培养基糖浓度在10
‑
15g/l左右，直至发酵结束。
[0247]
2. 实验组（葡萄糖，1，5
‑
戊二醇双碳源）发酵条件：采用与上述对照组相同的底料。葡萄糖补料方式与上文相同。在发酵的第24h一次性加入20g/l的1，5
‑
戊二醇。
[0248]
经过48小时连续发酵后将菌液离心、水洗、冰干后得到待测样品，并通过气相色谱检测(条件和方法同上)，结果见表13。重组菌h. ls21（py07）可以利用葡萄糖和1，5
‑
戊二醇双碳源在放大发酵中生产p34hb5hv，发酵终点的3hb的比例为69.3%，4hb的比例为14.4%，5hv的比例为16.3%。
[0249]
表13：h. ls21（py07）的发酵实验结果nd表示没有检测到相应单体的特征峰。
[0250]
实施例3应用改造后的halomonas aydingkolgenesis m1 cgmcc no.19880可控生产p34hb5hv一．构建生产菌
将质粒py01
‑
py07中的任一个与pq08质粒（质粒构建同实施例1）通过接合转化方式分别转入盐单胞菌halomonas aydingkolgenesis m1 cgmcc no.19880中，得到的盐单胞菌分别命名为h. aydingkolgenesis m1(py01)、h. aydingkolgenesis m1(py02)、h. aydingkolgenesis m1(py03)、h. aydingkolgenesis m1(py04)、h. aydingkolgenesis m1(py05)、h. aydingkolgenesis m1(py06)、h. aydingkolgenesis m1(py07)。
[0251]
二．表征1. 制备种子液。
[0252]
2. 发酵取2.5ml步骤1得到的种子液，接种于含47.5ml摇瓶培养基的500ml摇瓶，37℃、200rpm振荡培养48小时。
[0253]
摇瓶培养结束后，进行细胞干重测定、pha含量以及单体含量的测定。进行三次重复试验，每次重复试验设置三个重复处理，结果取平均值。
[0254]
气相色谱结果显示，标样中3hb，4hb和5hv单体在gc色谱中的出峰时间分别为2.1min，2.5min和3.4min，利用盐单胞菌所生产的p34hb5hv各组分的出峰位置与之一致。
[0255]
结果见表14。以葡萄糖为单一碳源的对照组菌h. aydingkolgenesis m1(py01), h. aydingkolgenesis m1(py02)仅能积累phb，以葡萄糖，1，4
‑
丁二醇为碳源的对照组菌h. aydingkolgenesis m1(py01)，h. aydingkolgenesis m1(py02)仅能积累p34hb，以葡萄糖，1，5
‑
戊二醇为碳源的对照组菌h. aydingkolgenesis m1(py01), h. aydingkolgenesis m1(py02)仅能积累phb5hv，均无法聚合形成p34hb5hv。以葡萄糖，1，4
‑
丁二醇，1，5
‑
戊二醇为碳源进行摇瓶培养的情况下，两株重组菌株均可以生产出p34hb5hv，其中h. aydingkolgenesis m1 (py02)可以得到60.3%含量的p34hb5hv，细胞干重为7.0g/l，3hb的比例可以为42.3%，4hb的比例为19.3%，5hv的比例为38.4%。而野生型对照h. aydingkolgenesis m1的摇瓶结果中无法检测到4hb和5hv组分，证明了外源引入的特异性pha聚合酶phac能够成功聚合以上三种单体。而作为该pha合成途径的关键蛋白，醇脱氢酶、醛脱氢酶和辅酶a转移酶则在p34hb5hv的合成中发挥重要作用。h. aydingkolgenesis m1 (py01)与h. aydingkolgenesis m1 (py02)相对比，h. aydingkolgenesis m1 (py02)产出pha的4hb与5hv的比例要更高，说明该菌株聚合4hb与5hv的能力更强，可能更符合实际需求。
[0256]
表14：h. aydingkolgenesis m1(py01)、h. aydingkolgenesis m1(py02)发酵生产p34hb5hv的实验结果
nd表示没有检测到相应单体的特征峰。
[0257]
为了进一步增加产量，使用了不同强度的启动子来表达p34hb5hv的生产通路。启动子分别为porin211（低强度），porin42（中强度），porin140（高强度）。分别对应质粒py04、py05和py06。结果如表15所示，强启动子下4hb与5hv组分比例上升，而干重对比弱启动子有下降。在porin 140启动子下，h. aydingkolgenesis m1 (py06)可以生产出56.7%含量的p34hb5hv，细胞干重为7.0g/l，3hb的比例可以为58.1%，4hb的比例为18.1%，5hv的比例为23.8%。与h. aydingkolgenesis m1(py02)相当。结果说明h.aydingkolgenesis m1可以在不同强度启动子的表达下产出不同比例的p34hb5hv。
[0258]
表15：不同强度启动子发酵生产p34hb5hv的实验结果
随后，h. aydingkolgenesis m1(py03)的性质也得到了表征。鉴于h. aydingkolgenesis m1(py03)需要iptg诱导产生三聚物，摇瓶实验中iptg的量分别设置为0mg/l，10mg/l，20mg/l，50mg/l，100mg/l，200mg/l。结果如表16所示，以葡萄糖为单一碳源的对照组菌h. aydingkolgenesis m1 (py03)，h. aydingkolgenesis m1(py03)仅能积累phb；以葡萄糖，1，4
‑
丁二醇，1，5
‑
戊二醇为碳源进行摇瓶培养的情况下，改造后的菌株可以生产出p34hb5hv，其中h. aydingkolgenesis m1 (py03)可以得到53.9%含量的p34hb5hv，细胞干重为6.6g/l，3hb的比例可以为52.2%，4hb的比例为18.0%，5hv的比例为29.8%。而野生型对照h. aydingkolgenesis m1的摇瓶结果中无法检测到4hb和5hv组分，证明了诱导表达系统可以在h. aydingkolgenesis m1中生产p34hb5hv。
[0259]
表16：h. aydingkolgenesis m1(py03)诱导发酵生产p34hb5hv的实验结果nd表示没有检测到相应单体的特征峰。
[0260]
在盐单胞菌h. aydingkolgenesis中表达琥珀酸半醛脱氢酶和4
‑
羟基丁酸脱氢酶，构建一条以葡萄糖为底物生产4hb聚合物组分的通路。结果见表17。以葡萄糖为单一碳源的对照组菌h. aydingkolgenesis (py07)仅能积累p34hb，以葡萄糖，1，5
‑
戊二醇为碳源进行摇瓶培养的情况下可以生产73.5%的p34hb5hv，细胞干重为7.4g/l，3hb的比例可以为72.3%，4hb的比例为15.2%，5hv的比例为12.5%。而作为该pha合成途径的关键蛋白，醇脱氢酶、醛脱氢酶、琥珀酸半醛脱氢酶和4
‑
羟基丁酸脱氢酶和辅酶a转移酶则在p34hb5hv的合成中发挥重要作用。
[0261]
表17：双碳源发酵生产p34hb5hv的实验结果nd表示没有检测到相应单体的特征峰。
[0262]
三、h. aydingkolgenesis m1 (py02)进行发酵罐生产1. 对照组（葡萄糖为单一碳源）发酵条件：采用分批补料方式。控制补料速度维持培养基糖浓度在10
‑
15g/l左右，直至发酵结束。
[0263]
2. 实验组（葡萄糖，1，4
‑
丁二醇，1，5
‑
戊二醇三碳源）发酵条件：采用与上述对照组相同的底料。葡萄糖补料方式与上文相同。在发酵的第24h一次性加入20g/l的1，4
‑
丁二醇和1，5
‑
戊二醇。
[0264]
经过48小时连续发酵后将菌液离心、水洗、冰干后得到待测样品，并通过气相色谱检测(条件和方法同上)，结果见表18。重组菌h. aydingkolgenesis m1(py02)可以利用葡萄糖，1，4
‑
丁二醇和1，5
‑
戊二醇作为三碳源在放大发酵中生产p34hb5hv，发酵终点的3hb的比例为56.2%，4hb的比例为20.3%，5hv的比例为24.5%。
[0265]
表18：h. aydingkolgenesis m1 (py02)的发酵实验结果四、h. aydingkolgenesis（py07）进行发酵罐生产1. 对照组（葡萄糖为单一碳源）发酵条件：采用分批补料方式。控制补料速度维持培养基糖浓度在10
‑
15g/l左右，直至发酵结束。
[0266]
2. 实验组（葡萄糖，1，5
‑
戊二醇双碳源）发酵条件：采用与上述对照组相同的底料。葡萄糖补料方式与上文相同。在发酵的第24h一次性加入20g/l的1，5
‑
戊二醇。
[0267]
经过48小时连续发酵后将菌液离心、水洗、冰干后得到待测样品，并通过气相色谱检测(条件和方法同上)，结果见表19。重组菌h.aydingkolgenesis（py07）可以利用葡萄糖和1，5
‑
戊二醇双碳源在放大发酵中生产p34hb5hv，发酵终点的3hb的比例为67.5%，4hb的比例为16.9%，5hv的比例为13.6%。
[0268]
表19：h.aydingkolgenesis（py07）的发酵实验结果nd表示没有检测到相应单体的特征峰。
[0269]
实施例4对不同比例p34hb5hv材料性能的表征1. 盐单胞菌生产的pha材料提取菌液经离心后，冷冻干燥得到菌体，如上文所述。菌体使用索氏提取仪提取出材料。随后材料重溶于氯仿，用无水乙醇沉淀后完成进一步提纯。提纯后的材料放置于室温下自然除去乙醇备用。提取的材料为不同比例的p(3hb
‑
co
‑
4hb
‑
co
‑
5hv)。
[0270]
2. pha材料分子量的测定分子量和分散度等信息均由gpc（凝胶渗透色谱）测定，样品均溶在色谱纯氯仿里，终浓度为2g/l。随后经0.22μm的尼龙膜除去杂质。流动相为色谱纯氯仿，流速为1ml/min，温度为35℃，上样量为40μl。标样使用不同分子量的聚苯乙烯，通过标曲来确定pha的分子量。分散度信息由分析程序计算获得。各pha材料的分子量如表20所示，分子量约为几十万道尔顿，随4hb/5hv的比例升高而降低。
[0271]
表20：不同比例p34hb5hv的分子量。
[0272]
mw代表重均分子量，mn代表数均分子量，pdi代表分子量分布值。
[0273]
3. pha材料热力学性质的测定pha材料的热力学性质由差示扫描量热法确定。温度范围为
‑
80℃
‑
200℃，氮气流
量为50 ml/min。样品重量控制在5
‑
10mg之间，先降温至
‑
80℃，随后以10℃/min的速度升温至180℃，以上步骤重复一次。各样品的玻璃化温度（tg），结晶温度（tc），熔融温度（tm）结果如表21所示。由数据所示，4hb、5hv比例越高，玻璃化温度和熔融温度越低。
[0274]
表21：不同比例p34hb5hv的热力学性质。
[0275]
tg代表玻璃化温度，tc代表数结晶温度，tm代表熔融温度。
[0276]
4. pha材料热降解性质的测定pha材料的热降解性质由热失重分析确定。样品重量控制在5
‑
10mg之间，填充气体为氮气，以10℃/min的速度升温至600℃。如表22所示，上述pha材料的分解温度td均在280℃左右，随4hb、5hv的比例升高略有上升，由278℃上升至287℃。
[0277]
表22：不同比例p34hb5hv的热降解性质。td代表热降解温度。
[0278]
5. pha材料机械性能的测定1g的pha材料由氯仿溶解后，倒入12mm半径的玻璃平板上长膜。玻璃平板置于通风橱中两周，待pha薄膜完全结晶后，裁剪成哑铃状的薄片。测量并记录样品宽度与厚度后，以10mm/min的拉伸速度进行拉力试验，并记录断裂延伸率。结果如表23所示，随着4hb/5hv的比例升高，材料的杨氏模量（e）有所下降，由383mpa降至235mpa，而断裂延伸率（εb）有所上升，由77%上升至187%。
[0279]
表23：不同比例p34hb5hv的机械性质e代表杨氏模量，σt代表抗拉强度，εb代表断裂延伸率。
[0280]
6. pha材料透光率的展示pha材料的透光情况如附图4所示，由图可得，p(3hb
‑
co
‑
35% 4hb
‑
co
‑
31% 5hv)的pha材料透光性良好，可用作生物相容性好，可降解的透明材料。
[0281]
以上实施例仅为本发明的示例性实施例，不用于限制本发明，本发明的保护范围由权利要求书限定。本领域技术人员可以在本发明的实质和保护范围内，对本发明做出各种修改或等同替换，这种修改或等同替换也应视为落在本发明的保护范围内。