利用内参快速准确表征蛋白质相对丰度的方法与流程

1.本发明属于生物检测领域，尤其是涉及一种利用内参快速准确表征蛋白质相对丰度的方法。


背景技术：

2.外泌体(exosomes)是一种直径在30
‑
150nm之间的茶托型结构的小囊泡，包含rna、蛋白质、microrna、dna片段等多种成分。全部真核细胞和一些原核细胞均可分泌，主要分布在血液、唾液、尿液、羊水和母乳等多种体液中。它是由细胞质膜内陷形成早期的核内体，核内体内陷包裹物质形成多泡体，而后多泡体在与质膜融合后得以释放。尽管外泌体早在1983年就被发现，但当时人们普遍认为它是细胞代谢的废弃物，主要作用是在新陈代谢过程中承担扔废料的角色。然而2007年，研究人员发现外泌体含有母细胞来源的蛋白、脂质和核酸，并能作为信号分子传递其他细胞从而改变靶细胞功能。随着研究结果的不断发现，把外泌体研究与转化研究推向了新的时代。
3.外泌体表征中蛋白质组学是关键指标，而最常使用的设备是蛋白质质谱分析仪。蛋白质谱样品处理方法复杂，步骤繁多，对实验操作技术水平要求很高，试剂价格昂贵，以thermo scientific
tm easypep
tm 微型ms样品制备试剂盒说明书为例，该试剂盒目录价格为7023.00元/20次实验，对纯化后样品依次进行细胞裂解，核酸降解，蛋白质酶解，还原/烷基化，肽段纯化富集等操作步骤，此外蛋白质质谱分析仪以及配套软件价格昂贵，使用操作更加复杂，严重影响对外泌体内蛋白质相对丰度的研究，而且不能考察外源蛋白在靶细胞外泌体中的表达丰度。


技术实现要素：

4.为解决上述技术问题，本发明提供一种利用内参快速准确表征蛋白质相对丰度的方法。
5.本发明采用的技术方案是：利用内参快速准确表征蛋白质相对丰度的方法，在基因能够表达的环境中转入外源基因和待测蛋白基因，外源基因包括第一报告基因和第二报告基因，待测蛋白基因与第一报告基因或第二报告基因连接，表达后，测定第一报告基因和第二报告基因信号比值即为待测蛋白的相对丰度，用于衡量所述待测蛋白基因在所述表达环境中的表达能力。
6.优选地，通过对比两种不同待测蛋白的相对丰度从而对两种不同待测蛋白做出比较。
7.优选地，待测蛋白为内源蛋白或外源蛋白。
8.优选地，待测蛋白基因为外泌体相关基因。
9.优选地，待测蛋白为外泌体腔内蛋白、膜上蛋白或膜外蛋白。
10.优选地，待测蛋白相对丰度测定方法步骤如下：将含有第一报告基因、第二报告基因和待测蛋白基因的一个或两个质粒转入到靶
细胞中；细胞培养后检测第一报告基因、第二报告基因信号；计算得到待测蛋白相对丰度。
11.优选地，第一报告基因和第二报告基因能够表达得到两种不同的荧光蛋白和/或荧光化学分子。
12.优选地，第一报告基因和第二报告基因能够表达得到萤火虫荧光素酶、海肾荧光素酶、高斯荧光素酶、nanoluc荧光素酶、β
‑
半乳糖苷酶、acgfp1和mcherry中任意两个。
13.优选地，通过荧光素酶试剂盒、elisa或荧光显微镜测定第一报告基因和第二报告基因信号。
14.优选地，外源基因连接在待测蛋白基因编码序列的5’端或3’端，或者外源基因连接在待测蛋白基因编码序列中间。
15.优选地，待测蛋白基因与第一报告基因连接，待测蛋白相对丰度为第一报告基因信号比第二报告基因信号的值。
16.利用内参快速准确表征蛋白质相对丰度的方法在蛋白质分析技术中的应用。
17.本发明具有的优点和积极效果是：与传统蛋白质组检测方法比较，本方案对实验操作技术水平要求较低，实验周期短、成本低，用于外泌体相关基因的研究时，不限外泌体来源，不限待测蛋白来源，不限靶细胞来源，不限外泌体溶液纯化方式和纯度，具有较广的检测范围；本方案用于外泌体相关蛋白检测时，能够最大限度保留外泌体样本，低浓度或微量检测也能够获得较佳信号值，检测灵敏度高。
附图说明
18.图1是用于表征人类cd81蛋白在人胚胎肾细胞hek293t细胞外泌体中的相对丰度质粒结构图（psicheck
‑2‑
cd81）；图2是psicheck
‑2‑
cd81质粒在人胚胎肾细胞hek293t细胞和上清液中两种报告基因活性；图3是用于表征人类cd63蛋白在人胚胎肾细胞hek293t细胞外泌体中的相对丰度质粒结构图（psicheck
‑2‑
cd63）；图4是psicheck
‑2‑
cd63质粒在人胚胎肾细胞hek293t细胞和上清液中两种报告基因活性；图5是用于表征小鼠cd63蛋白在人胚胎肾细胞hek293t细胞外泌体中的相对丰度质粒结构图（psicheck
‑2‑
mouse
‑
cd81）；图6是psicheck
‑2‑
mouse
‑
cd63质粒在人胚胎肾细胞hek293t细胞和上清液中两种报告基因活性；图7用于表征人类cd81蛋白在人胚胎肾细胞hek293t细胞外泌体中的相对丰度质粒结构图（pbi
‑
cmv2
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cd81
‑
mcherry）；图8是pbi
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cmv2
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cd81
‑
mcherry质粒在人胚胎肾细胞hek293t细胞和上清液中两种报告基因（acgfp1和mcherry）活性；图9是用于表征人类cd63蛋白在人胚胎肾细胞hek293t细胞外泌体中的相对丰度
质粒结构图（pbi
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cmv2
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cd63
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mcherry）；图10是pbi
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cmv2
‑
cd63
‑
mcherry质粒在人胚胎肾细胞hek293t细胞和上清液中两种报告基因（acgfp1和mcherry）活性。
具体实施方式
19.本发明涉及一种利用内参快速准确表征蛋白质相对丰度的方法，代替传统的蛋白质组学分析方法，可以利用外源双报告基因系统，一种报告基因表征待测蛋白在外泌体中的丰度，另一种报告基因作为内参，测定两种不同报告基因信号值比值，作为表征待测蛋白质在外泌体中的相对丰度。构建外源双报告基因系统，在基因能够表达的环境中转入外源基因和待测蛋白基因，外源基因包括第一报告基因和第二报告基因，待测蛋白基因与第一报告基因或第二报告基因连接，外源基因表达后，测定第一报告基因和第二报告基因信号比值即为待测蛋白的相对丰度。利用这样的方法能够快速得知待测蛋白的表达水平，检测周期短，成本低。
20.本发明某些实施例中，待测蛋白可以为内源蛋白，也可以是外源蛋白。尤其适合外泌体相关蛋白表达水平的检测。待测蛋白为外泌体相关蛋白时，可以为腔内蛋白、膜上蛋白或膜外蛋白。腔内蛋白为在外泌体里面，或者贴在外泌体膜内侧的蛋白；膜上蛋白为嵌入外泌体膜的蛋白；膜外蛋白为没有嵌入外泌体膜，但是被吸在膜外侧，或者贴在外侧的蛋白。传统方案研究外泌体相关蛋白，需要提取并纯化外泌体；与其他种类蛋白比较，外泌体一般含量较低，纯化不易，获得能够进行质谱的蛋白量需要较高成本。而在两种报告基因的比较下，以内参为基准，即便是有微量外泌体，也能够快速、准确、低成本的对待测蛋白的功能做出判断。
21.第一报告基因和第二报告基因为两种不同的荧光蛋白和/或荧光化学分子的基因，可通过荧光检测得知第一报告基因和第二报告基因的表达丰度，这样的检测方式更为快捷和直观，第一报告基因和第二报告基因信号比值即为待测蛋白的表达丰度，代表了不同待测蛋白的表达能力，能够直接用于对比两种或多种待测蛋白。例如，待测蛋白基因与第一报告基因连接，待测蛋白相对丰度为第一报告基因荧光信号比第二报告基因荧光信号的值。本方案某些实施例中，第一报告基因和第二报告基因能够表达得到萤火虫荧光素酶、海肾荧光素酶、高斯荧光素酶、nanoluc荧光素酶和β
‑
半乳糖苷酶中任意两个；荧光信号可通过荧光素酶试剂盒、elisa或荧光显微镜测定。
22.通过质粒设计令待测蛋白与第一报告基因或第二报告基因连接，使得第一报告基因或第二报告基因与待测蛋白基因的表达直接相关。第一报告基因或第二报告基因连接在待测蛋白基因编码序列的5’端或3’端，或者第一报告基因或第二报告基因连接在待测蛋白基因编码序列中间。第一报告基因和第二报告基因可存在于同一个质粒上，也可以分别在两个质粒上，当第一报告基因和第二报告基因存在于同一个质粒上时，双报告系统中的两种报告基因可以共用一个启动子，或分别使用不同启动子。
23.利用内参快速准确表征蛋白质相对丰度的方法具体如下：步骤一：构建双报告系统质粒，将待测蛋白编码序列融合第一报告基因，第二报告基因作为内参；步骤二：将质粒导入靶细胞；
步骤三：细胞培养后，收集上清液和细胞组织，检测连接待测蛋白的第一报告基因信号和作为内参的第二报告基因信号；第一报告基因信号和第二报告基因信号的比值即待测蛋白在外泌体中的相对丰度。
24.其中，质粒导入靶细胞方式可以是转染试剂或电转，可以做瞬时转染或稳定转染；靶细胞可以是任何真核细胞或原核细胞。
25.本方案某些实施例中，还可以通过对比两种不同待测蛋白的相对丰度从而对两种不同待测蛋白做出比较，例如用于选择多种蛋白，通过比较多种蛋白分别在相同环境下的表达相对丰度，从而选择出最适合的蛋白。
26.下面结合实施例对本发明方案做出进一步说明，其中，未具体说明操作步骤的实验方法，均按照相应商品说明书进行，实施例中所用到的仪器、试剂、耗材如无特殊说明，均可从商业公司购买得到。
27.对比例：取人胚胎肾细胞hek293t细胞（第8代细胞）外泌体300 ng，使用thermo scientific
tm easypep
tm 微型ms样品制备试剂盒并按照说明书制备蛋白质组学分析样品，取50 ng肽段样品放入进样管，使用ultimate 3000 rsclnano（thermo scientific
tm
）仪器进行蛋白质组色谱分离，色谱柱为acclaim pepmap 100 c17（75 μl
×ꢀ
2cm，孔径100
ꢀå
，thermo scientific
tm
），肽段样品被洗脱分离，流动相a为千分之一甲酸水，流动相b为乙腈和千分之一甲酸水，流速为300 nl/min，梯度洗脱程序为0
‑
8分钟采用2%流动相b，此后8
‑
43分钟流动相b的含量从2%增加至17%，此后43
‑
58分钟流动相b的含量再从17%增加至25%，此后58
‑
68分钟流动相b的含量再从25%增加至50%，最后用100%流动相b冲洗5分钟。
28.蛋白质谱分析采用qexactivebasic（thermo scientific
tm
），质合比检测范围是400
‑
1600，分辨率为70,000，使用软件proteome discoverer software（2.1.1.21）进行蛋白质谱数据分析，数据库为swiss
‑
prot homo sapiens（taxonomy 9606 version 2017
‑
05
‑
10, 42,153 entries），对比两个内源蛋白的相对丰度（# psms），其中cd81为5，cd63为1。可见cd81比cd63 相对丰度更高。
29.实施例1：快速准确表征人源蛋白cd81与人源蛋白cd63在hek293t细胞外泌体中相对丰度取内源基因cd81（uniportentryp60033）编码基因，克隆到psicheck
‑
2（promega
tm
）质粒的海肾荧光素酶的3’端的阅读框中，最后构建完成psicheck
‑2‑
cd81（图1）。质粒抽提之后使用lipofectamine 3000（thermo scientific tm
）转染人胚胎肾细胞hek293t细胞（四万个细胞/孔），单次使用100 ng质粒，转染24小时之后，取100 μl上清液和贴壁细胞组织，使用dual
‑
luciferase
®ꢀ
reporter assay system（promega
tm
）试剂盒分别测定上清液中的海肾荧光素酶活力和细胞中的萤火虫荧光素酶活力，二者比值即待测蛋白在外泌体中的相对丰度。根据图2数据，人源蛋白cd81在hek293t细胞外泌体中相对丰度为上清液中海肾荧光素酶活性比细胞中萤火虫荧光素酶活性，即0.314。
30.取内源基因cd63（uniportentryp08962）编码基因，克隆到psicheck
‑
2（promega
tm
）质粒的海肾荧光素酶的3’端的阅读框中，最后构建完成psicheck
‑2‑
cd63（图3）。质粒抽提之后使用lipofectamine 3000（thermo scientific tm
）转染人胚胎肾细胞hek293t细胞（四
万个细胞/孔），单次使用100 ng质粒，转染24小时之后，取100 μl上清液和贴壁细胞组织，使用dual
‑
luciferase
®ꢀ
reporter assay system（promega
tm
）试剂盒分别测定上清液中的海肾荧光素酶活力和细胞中的萤火虫荧光素酶活力，二者比值即待测蛋白在外泌体中的相对丰度。根据图4数据，人源蛋白cd63在hek293t细胞外泌体中相对丰度为上清液中海肾荧光素酶活性比细胞中萤火虫荧光素酶活性，即0.0925。
31.由上述两组数据可知，人源蛋白cd81和cd63在hek293t细胞外泌体中相对丰度分别为0.314和0.0925，可见cd81比cd63 相对丰度更高。其结论与蛋白质谱分析结论相同，可见本方案准确性。
32.实施例2：快速准确表征人源蛋白cd63和鼠源蛋白cd63在hek293t细胞外泌体中相对丰度人源蛋白cd63相对丰度数据如实施例1所述。
33.取小鼠外源基因cd63（uniportentryp41731）编码基因，克隆到psicheck
‑
2（promega
tm
）质粒的海肾荧光素酶的3’端的阅读框中，最后构建完成psicheck
‑2‑
mouse
‑
cd63（图5）。质粒抽提之后使用lipofectamine 3000（thermo scientific tm
）转染人胚胎肾细胞hek293t细胞（四万个细胞/孔），单次使用100 ng质粒，转染24小时之后，取100 μl上清液和贴壁细胞组织，使用dual
‑
luciferase
®ꢀ
reporter assay system（promega
tm
）试剂盒分别测定上清液中的海肾荧光素酶活力和细胞中的萤火虫荧光素酶活力，二者比值即待测蛋白在外泌体中的相对丰度。根据图6数据，鼠源蛋白cd63在hek293t细胞外泌体中相对丰度为上清液中海肾荧光素酶活性比细胞中萤火虫荧光素酶活性，即0.282。
34.综合分析，人源蛋白cd63和鼠源蛋白cd63在hek293t细胞外泌体中相对丰度分别为0.0925和0.282，可见鼠源蛋白cd63相比于人源蛋白cd63在hek293t细胞外泌体中相对丰度更高。
35.实施例3：快速准确筛选候选支架蛋白cd63（人源）和cd63（鼠源）支架蛋白指在外泌体富集的蛋白，已知支架蛋白包括cd81、cd9等外泌体表面标志物，本实施例的目的是将内源基因（人源）cd81作为阳性对照，通过表征cd63（人源）和cd63（鼠源）在外泌体中的相对丰度，从而判断二者是否可以作为支架蛋白使用，即是否在外泌体富集。
36.从实施例1和实施例2中可知，人源蛋白cd81、cd63和鼠源蛋白cd63在hek293t细胞外泌体中相对丰度分别为0.314、0.0925和0.282，于是cd63（人源）和cd63（鼠源）相对于阳性对照的相对丰度为(0.0925/0.314)和(0.282/0.314)，即0.29458599和0.89808917，于是cd63（鼠源）的相对丰度是cd63（人源）三倍左右，更适合作为支架蛋白使用。
37.结合上述实施例能够看出，本方案能够快速比较不同待测蛋白的相对丰度，节省时间和成本，同时具有极高准确率，能够用于多种类型的蛋白检测和比较，准确评价待测蛋白质在细胞或外泌体中的相对富集程度。
38.实施例4：使用一对荧光蛋白（acgfp1和mcherry）快速准确表征人源蛋白cd81与人源蛋白cd63在hek293t细胞外泌体中相对丰度取内源基因cd81（uniportentryp60033）编码基因，融合荧光蛋白报告基因mcherry（rfp，snapgene
tm
）并克隆到pbi
‑
cmv2（takara bio
tm
）双表达元件质粒的多克隆位点（mcs）中，最后构建完成pbi
‑
cmv2
‑
cd81
‑
mcherry（图7）。质粒抽提之后使用
lipofectamine 3000（thermo scientific tm
）转染人胚胎肾细胞hek293t细胞（四万个细胞/孔），单次使用100 ng质粒，转染24小时之后，取100 μl上清液和贴壁细胞组织，使用酶标仪（biotek
tm
synergy h1）分别测定上清液中的mcherry荧光强度和细胞中的acgfp1荧光强度，二者比值即待测蛋白在外泌体中的相对丰度。根据图8数据，人源蛋白cd81在hek293t细胞外泌体中相对丰度为上清液中的mcherry荧光强度比细胞中的acgfp1荧光强度，即0.0412。
39.取内源基因cd63（uniportentryp08962）编码基因，融合荧光蛋白报告基因mcherry（rfp，snapgene
tm
）并克隆到pbi
‑
cmv2（takara bio
tm
）双表达元件质粒的多克隆位点（mcs）中，最后构建完成pbi
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cmv2
‑
cd63
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mcherry（图9）。质粒抽提之后使用lipofectamine 3000（thermo scientific tm
）转染人胚胎肾细胞hek293t细胞（四万个细胞/孔），单次使用100 ng质粒，转染24小时之后，取100 μl上清液和贴壁细胞组织，使用酶标仪（biotek
tm
synergy h1）分别测定上清液中的mcherry荧光强度和细胞中的acgfp1荧光强度，二者比值即待测蛋白在外泌体中的相对丰度。根据图10数据，人源蛋白cd63在hek293t细胞外泌体中相对丰度为上清液中的mcherry荧光强度比细胞中的acgfp1荧光强度，即0.00387。
40.由上述两组数据可知，人源蛋白cd81和cd63在hek293t细胞外泌体中相对丰度分别为0.0412和0.00387，可见cd81比cd63 相对丰度更高。其结论与蛋白质谱分析结论相同，可见本方案准确性。
41.以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。