一种抗乌鳢Nramp抗体的抗原表位多肽及其在抗体制备中的应用的制作方法

一种抗乌鳢nramp抗体的抗原表位多肽及其在抗体制备中的应用
技术领域
1.本发明属于免疫化学和分子生物学技术领域，具体涉及一种抗乌鳢nramp抗体的抗原表位多肽及其在抗体制备中的应用。


背景技术：

2.公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
3.近年来，随着水产养殖业的发展，水产养殖规模不断扩大，但是养殖环境却有恶化的趋势，水产鱼类在养殖过程中爆发的疾病越来越多，给水产养殖业带来了极大的经济损失，严重制约了水产养殖业的可持续发展。因此培育具有一定抗病力的鱼类新品系是解决病害问题的有效途径，也是实现水产养殖行业健康发展的一种趋势。
4.天然抗性相关巨噬蛋白(nramp)基因作为一种抗病候选基因，与鱼类的先天性免疫密切相关，在鱼类的抗病研究中具有重要价值。天然抗性相关巨噬蛋白(nramp)家族是一类抑制胞内病原菌侵染的天然免疫相关蛋白。目前在人和小鼠等哺乳动物中已发现两种具有不同功能的天然抗性巨噬蛋白nramp1和nramp2。但在鱼类中，除虹鳟(nrampα和nrampβ)外，发现的nramp蛋白只有一种，氨基酸序列对比分析研究表明，鱼类的nramp基因与哺乳类nramp2的同源性要高于nramp1的同源性，但其功能却与nramp1相似。然而，发明人发现，目前针对鱼类nramp的用于实验室研究的抗体和蛋白仍鲜有报道。


技术实现要素：

5.基于上述现有技术的不足，本发明提供一种抗乌鳢nramp抗体的抗原表位多肽及其在抗体制备中的应用。本发明通过研究发现，成功获得一种抗乌鳢nramp抗体的优势抗原表位多肽，并以其作为抗原成功制备了乌鳢nramp多克隆抗体，从而为进一步研究鱼类nramp的作用与功能奠定了基础，因此具有良好的实际应用之价值。
6.本发明的第一个方面，提供一种抗乌鳢nramp抗体的抗原表位多肽，所述多肽的氨基酸序列选自：包括或由seq id no.1构成的序列。
7.所述多肽的表位是乌鳢nramp蛋白的第318
‑
328个氨基酸序列。
8.本发明的第二个方面，提供上述抗原表位多肽在制备抗乌鳢nramp抗体中的应用。
9.其中，所述抗乌鳢nramp抗体可以为单克隆抗体或多克隆抗体。
10.上述抗体可用于检测乌鳢nramp蛋白。
11.本发明的第三个方面，提供一种抗乌鳢nramp抗体，所述抗乌鳢nramp抗体其特异性结合乌鳢nramp蛋白并且特异性识别上述抗原表位多肽。
12.本发明的第四个方面，提供编码上述抗乌鳢nramp抗体的核酸分子。
13.本发明的第五个方面，提供上述抗乌鳢nramp抗体的制备方法，所述制备方法包
括：针对上述抗原表位多肽构成的抗原对非人动物进行免疫获得。
14.本发明的第六个方面，提供一种用于检测乌鳢nramp蛋白的试剂盒，所述试剂盒包含上述抗乌鳢nramp抗体。
15.本发明的第七个方面，提供一种检测乌鳢nramp蛋白的方法，所述方法包括：采用上述抗乌鳢nramp抗体和/或上述试剂盒对待测样品进行检测。
16.上述一个或多个技术方案的有益技术效果：
17.上述技术方案提供了乌鳢nramp具有优势抗原表位的多肽序列，该多肽由11个氨基酸残基组成，其多肽的表位是乌鳢nramp蛋白第318
‑
328个氨基酸序列，具有很高的免疫原性和特异性。因此，可以将其用于制备抗乌鳢nramp抗体的制备，从而为鱼类nramp相关研究奠定基础，因此具有良好的实际应用之价值。
附图说明
18.构成本技术的一部分的说明书附图用来提供对本技术的进一步理解，本技术的示意性实施例及其说明用于解释本技术，并不构成对本技术的不当限定。
19.图1为本发明实施例中乌鳢nramp蛋白跨膜区分析图；
20.图2为本发明实施例中乌鳢nramp蛋白信号肽分析图；
21.图3为本发明实施例中乌鳢nramp蛋白疏水性分析图；
22.图4为本发明实施例中乌鳢nramp蛋白无序序列分析图；
23.图5为本发明实施例中乌鳢nramp蛋白抗原性分析图；其中，得分为0.5分以上的浅色区域为预测的抗原表位；
24.图6为本发明实施例中乌鳢nramp蛋白的同源性分析图；
25.图7为本发明实施例中乌鳢nramp蛋白的结构域分析图；
26.图8为本发明实施例中抗原表位多肽的序列抗原性分析图；
27.图9为本发明实施例中抗原sds
‑
page验证图；其中，m：m.marker(5μl，0.1mg/ml)；1：pa1
‑
21050016多肽偶联bsa；
28.图10为本发明实施例中抗体纯化结果图，其中，m：marker(5μl，0.1mg/ml)；1：兔g1638纯化抗体；2：兔g1639纯化抗体。
29.图11为本发明实施例中兔多抗验证结果图，其中，m：marker；1：乌鳢脾脏；2：乌鳢肾脏。
具体实施方式
30.应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
31.需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
32.本发明的一个典型实施方式中，提供一种抗乌鳢nramp抗体的抗原表位多肽，所述
多肽的氨基酸序列选自：包括或由seq id no.1构成的序列。
33.本发明的又一具体实施方式中，所述多肽的表位是乌鳢nramp蛋白的第318
‑
328个氨基酸序列。
34.本发明的又一具体实施方式中，提供上述抗原表位多肽在制备抗乌鳢nramp抗体中的应用。
35.本发明的又一具体实施方式中，所述应用为：利用上述抗原表位多肽为抗原制备所述抗乌鳢nramp抗体。
36.其中，所述抗乌鳢nramp抗体可以为单克隆抗体或多克隆抗体。
37.上述抗体可用于检测乌鳢nramp蛋白。
38.本发明的又一具体实施方式中，提供一种抗乌鳢nramp抗体，所述抗乌鳢nramp抗体其特异性结合乌鳢nramp蛋白并且特异性识别上述抗原表位多肽。
39.所述抗乌鳢nramp抗体可以为单克隆抗体或多克隆抗体。
40.本发明的又一具体实施方式中，提供编码上述抗乌鳢nramp抗体的核酸分子。
41.本发明的又一具体实施方式中，提供上述抗乌鳢nramp抗体的制备方法，所述制备方法包括：针对上述抗原表位多肽构成的抗原对非人动物进行免疫获得。
42.所述抗乌鳢nramp抗体可以为单克隆抗体或多克隆抗体。
43.当制备乌鳢nramp多克隆抗体时，所述非人动物为兔。因此最终制备得到的是抗乌鳢nramp抗体的抗原表位多肽的兔多克隆抗体。
44.本发明的又一具体实施方式中，提供一种用于检测乌鳢nramp蛋白的试剂盒，所述试剂盒包含上述抗乌鳢nramp抗体。
45.本发明的又一具体实施方式中，提供一种检测乌鳢nramp蛋白的方法，所述方法包括：采用上述抗乌鳢nramp抗体和/或上述试剂盒对待测样品进行检测。
46.以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
47.实施例
48.一、nramp的序列分析
49.nramp蛋白氨基酸序列选自kaf3689712.1(natural resistance
‑
associated macrophage protein 2[channa argus])，在uniprot数据库中比对发现同源性达100％的蛋白，来源于物种channa argus的氨基酸序列(seq id no.2)，其uniprot id为a0a6g1phj9。对其跨膜区、信号肽、疏水性分析、无序序列、抗原性、结构域进行分析，结果表明：该蛋白编码562个氨基酸，10次跨膜，无信号肽序列；作为免疫原来看，全长蛋白抗原指数得分适中，所以可以引起较好的免疫；从同源性分析及抗体制备要求来看，该蛋白在物种channa argus中比对显示特异性较强，与兔同源性很低，具有很高的免疫原性。根据抗原表位选取肽段进行多肽合成及抗体制备。
[0050]
二、合抗原表位分析结果及跨膜分析结果来选择肽段，采用化学合成的方式合成肽段，免疫后制备抗体。
[0051]
多肽序列：dktnievsekc(seq id no.1)，是乌鳢nramp蛋白的第318
‑
328个氨基酸序列。
[0052]
三、实验方案
[0053]
多肽合成—半抗原偶联及质控—动物免疫—效价检测—抗血清制备—抗体纯化—抗体验证
[0054]
(1)抗原制备
[0055]
多肽合成及完全抗原制备，多肽合成并偶联载体蛋白，裸肽提供ms和hplc质控报告，纯度大于90％，收率100％。
[0056]
(2)抗原质控
[0057]
sds
‑
page检测，完全抗原(
‑
bsa或
‑
ova或
‑
klh均可)6
‑
7mg，纯度大于90％，一般免疫两只兔子。
[0058]
(3)动物免疫
[0059]
抗原乳化后免疫2只实验兔。一免3周后进行二免，间隔2周后进行三免，三免间隔2周后进行。四免，四免间隔2周后进行五免。
[0060]
(4)效价检测
[0061]
三免后取血测效价，最多进行6次免疫提高抗血清效价，免疫期间分别取血清wb检测阳性组织裂解液。
[0062]
(5)抗体纯化
[0063]
采用proteina/g亲和纯化抗体。
[0064]
(6)wb验证
[0065]
抗血清以及抗血清纯化后抗体分别wb检测重组蛋白或者阳性组织裂解液。
[0066]
四、具体实验
[0067]
1.抗原sds
‑
page验证
[0068]
1.1抗原sds
‑
page验证：
[0069]
1.2结论：sds
‑
page检测结果：符合免疫要求，可安排后续免疫。
[0070]
2.免疫
[0071]
2.1免疫流程
[0072]
免疫次数免疫周期免疫时间免疫剂量免疫佐剂免疫动物状第一次免疫1天2021/06/030.5mg完全弗氏佐良好第二次免疫14天2021/06/170.5mg不完全弗氏佐良好第三次免疫28天2021/07/010.5mg不完全弗氏佐良好三免取血35天2021/07/08//采血正常第四次免疫42天2021/07/150.5mg不完全弗氏佐良好四免取血49天2021/07/22//采血正常免疫动物采血56天2021/07/29//采血正常
[0073]
2.2抗血清elisa检测
[0074]
(1)抗原包被：用包被液稀释抗原到2ug/ml，100μl/孔加入96孔酶标反应板中，4℃过夜包被。
[0075]
(2)洗涤：次日弃掉孔内的液体，洗涤液洗3次。
[0076]
(3)封闭：加200μl/孔封闭液，37℃温育2h。
[0077]
(4)洗涤：用洗涤液洗3次。
[0078]
(5)加待测样品(一抗)：加入抗血清(取血4℃4000rmp离心10min取上清)，用稀释
液将血清按1:2000,1:4000,1:8000，1:16000，1:32000，1:64000，1:128000......进行倍比稀释(空白血清同比稀释做阴性对照)，每孔100ul，37℃孵育1h。
[0079]
(6)洗涤：用洗涤液洗3次。
[0080]
(7)加酶标抗抗体：加入hrp标记igg二抗，100μl/孔，37℃孵育40min。(羊抗小鼠
‑
hrp 1：5000
‑
1：10000，羊抗兔
‑
hrp 1：5000
‑
1：10000)
[0081]
(8)洗涤：用洗涤液洗5次后拍干。
[0082]
(9)显色：加新鲜配制的底物溶液100μl/孔，37℃遮光放置5～20min。
[0083]
(10)终止反应、比色：加50μl/孔终止液。颜色变黄；用酶标仪测定450nm处各孔的吸光值。
[0084]
2.3抗血清效价
[0085]
两只兔子血清效价超过1:50k。
[0086]
3.抗体纯化
[0087]
3.1抗体纯化
[0088]
(1)层析柱预处理：10倍柱床体积的去离子水冲洗3
‑
5遍，流速1ml/min 10倍柱体积的0.02m pb 0.3m nacl冲洗3
‑
5遍，流速1ml/min。
[0089]
(2)样品上样：4
‑
10ml抗血清/腹水，用0.02m pb稀释后，0.22um滤器过滤后上柱，调整流速为5
‑
7s/滴。
[0090]
(3)洗杂：0.02m pb冲洗至检测(g250不变蓝)无蛋白流出为止，流速2s/滴。
[0091]
(4)抗体洗脱：0.1m ph＝3.0甘氨酸以3
‑
5s/滴过柱洗脱，收集洗脱物并用g250检测洗脱产物至不变蓝为止。
[0092]
(5)ph值调节：饱和碳酸钠调节洗脱产物ph至中性。
[0093]
(6)超滤浓缩：10kda超滤管，超滤浓缩至1
‑
3ml左右。
[0094]
(7)透析：5l，0.01m ph＝7.4pbs透析过夜，第二天换液1次后再透析4
‑
6h左右后跑sds胶并测定抗体浓度后装入标记好ep管，可暂存于4℃备用或直接保存于
‑
20℃。
[0095]
(8)层析柱洗涤与贮存：去离子水冲洗层析柱，5倍柱床体积20％乙醇冲洗层析柱后，4℃封存
[0096]
3.2抗体纯化结果
[0097]
免疫的兔g1638/g1639抗体纯度为90％以上。
[0098]
4.western blot
[0099]
4.1聚丙烯酰胺凝胶的制备
[0100]
4.1.1配制浓度为12％(的分离胶溶液(10ml)：依次加入去离子水3.3ml、30％丙烯酰胺4ml、ph8.8的tris 2.5ml、10％过硫酸铵100μl、10％sds 100μl、temed 6μl(加入temed后，分离胶马上开始聚合，故应立即快速混匀)。
[0101]
4.1.2迅速在两玻璃板的间隙中加入分离胶溶液，留出灌注浓缩胶所需空间，小心地在分离胶溶液上加入1ml异丙醇(贴壁加入)。
[0102]
4.1.3分离胶聚合完全后(25℃约30min)，尽可能排去凝胶上的液体，再用滤纸的边缘吸净残留液体。
[0103]
4.1.4配制浓度为5％的浓缩胶溶液(4ml)：依次加入去离子水2.7ml、30％丙烯酰胺670μl、ph6.8的tris 500μl、10％过硫酸铵40μl、10％sds 40μl、temed 6μl(加入temed
后，分离胶马上开始聚合，故应立即快速混匀)。
[0104]
4.1.5快速在已聚合的分离胶上直接灌注浓缩胶，立即在浓缩胶溶液中插入干净的梳子(小心避免混入气泡)。
[0105]
4.1.6浓缩胶聚合完全后(25℃约30min)，小心移出梳子，向电泳槽内加入蛋白质电泳缓冲液。
[0106]
4.2样品的制备
[0107]
乌鳢取自山东省淡水渔业研究院养殖基地，取脾和前肾各50g，15ul抽提好的样本裂解液 1
‑
6ul 6x loading buffer混匀后，沸水浴5
‑
10min，2500rpm离心2min，将管壁溶液离心下来。
[0108]
4.3电泳
[0109]
4.3.1用移液枪慢慢将样品混合物加至样品槽中，预染marker一般加10μl。
[0110]
4.3.2打开电源，采用80v电泳30min，换电压至120v电泳直至溴酚蓝上样缓冲液在凝胶中迁移至凝胶底部。
[0111]
4.4湿转转膜
[0112]
4.4.1取胶并浸入转膜buffer中。
[0113]
4.4.2将pvdf膜(6％
‑
12％的胶膜是0.45um，15％的胶是0.2um)浸泡于甲醇1min后用滤纸吸干后再转入转膜buffer中，将滤纸也浸入转膜buffer中(pvdf膜和滤纸均剪成与胶相同大小，5.5cm*8.5cm)。
[0114]
4.4.3制作转膜三明治：(负极黑面)转印滤纸3张 凝胶 pvdf膜 转印滤纸3张(正极白面)，每铺一层都要赶尽气泡。
[0115]
4.4.5将转膜三明治放入转膜槽中，黑面对黑面，白面对红面，恒流200ma 60min(12％的胶是200ma 60min，15％的胶是100ma 45min,6％的胶是360ma 120min)。
[0116]
4.5封闭
[0117]
4.5.1将膜取出，tbs洗1次，每次5min(水平摇床上震荡)。
[0118]
4.5.2将膜取出，浸没于封闭液中25℃，1h或4℃过夜(封闭液为500ml的1*tbs 5g酪蛋白配制)。
[0119]
4.6结合抗体
[0120]
4.6.1将膜取出，tbst洗1次，每次5min(水平摇床上震荡)。
[0121]
4.6.2将膜取出，浸泡于用稀释液稀释的一抗稀释液中，25℃，2h或4℃过夜。(一般抗血清稀释1：2000抗体稀释至1
‑
10ug/ml)。(稀释液为500ml的1*tbs 2.5g的酪蛋白 250ul吐温)。
[0122]
4.6.3将膜取出，tbst洗5次，每次5min(水平摇床上震荡)。
[0123]
4.6.4将膜取出，浸泡于用稀释液稀释的二抗中，25℃，1h。羊抗兔
‑
hrp 1:5000)。
[0124]
4.7ecl曝光
[0125]
4.7.1将a、b发光液等比例稀释混合(各500ul/膜)，将膜至于保鲜膜上，ab混合液均匀滴至膜上，盖上保鲜膜，避光反应1min；
[0126]
4.7.2将膜放在滤纸上吸干液体(无液体流出即可，膜不可干透)，转移至洁净保鲜膜中包好(保持正面平整)，固定于暗盒中；
[0127]
4.7.3将暗盒至于暗室中，取出胶片迅速至于暗盒内膜上，关闭暗盒，根据所见荧
光强度曝光(一般曝光时间为1min，若条带较弱可选择压片过夜)；
[0128]
4.7.4打开暗盒，取出胶片立即完全侵入显影液中1min；
[0129]
4.7.5取出胶片，去离子水漂洗后侵入至定影液中1min；
[0130]
4.7.6取出胶片，去离子水漂洗后晾干，标定marker，分析实验结果。
[0131]
4.8western blot结果
[0132]
制备的兔抗体与脾有较弱疑似信号，前肾阳性反应较强，与预期信号62kda相符。
[0133]
最后应该说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。上述虽然对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。