一种NK细胞体外增殖的方法及培养基与流程

一种nk细胞体外增殖的方法及培养基
技术领域
1.本发明涉及细胞免疫治疗领域，特别涉及一种nk细胞体外增殖的方法以及适用于该方法的培养基，尤其涉及将去铁胺作为有效成分的细胞培养基。


背景技术：

2.nk细胞(natural killer cell)属于非特异性免疫细胞，是机体重要的免疫细胞，它们无需抗原预先致敏，就可以直接杀伤某些肿瘤和病毒感染的靶细胞，因此称为自然杀伤活性细胞，其还可以分泌多种细胞因子和趋化因子参与免疫调节。因此在机体抗肿瘤和早期抗病毒或胞内寄生菌感染的免疫过程中起重要作用。nk免疫细胞治疗在抗病毒，抗肿瘤的治疗中有着广泛的应用前景。
3.nk免疫细胞治疗是一种输入nk免疫细胞的肿瘤免疫疗法，细胞免疫治疗对nk等免疫细胞的输入量具有较高要求，因此，需要在输入前在体外获得足够数量的nk细胞。所以，如何在体外促进nk细胞增殖并提高其对肿瘤细胞的杀伤力成为了细胞免疫治疗领域的重要研究方向。
4.小分子药物去铁胺(dfo)，过去半个世纪以来一直被用作铁螯合剂，六齿样结构对铁具有高亲和力，用于结合体内过多的铁，但dfo在高浓度时具有药物毒性。目前还没有报道过dfo对nk细胞增殖和杀伤活性的影响。


技术实现要素：

5.本发明提出一种nk细胞体外增殖的方法以及适用于该方法的培养基，尤其涉及以去铁胺作为有效成分的细胞培养基。
6.本发明发现，去铁胺可以显著提升nk细胞体外增殖，还可以提升nk细胞的杀伤力，基于此，本发明提出一种使用添加了去铁胺的细胞培养基的nk细胞体外增殖的方法，以及一种添加了去铁胺的细胞培养基。
7.本发明的一种nk细胞体外增殖的方法的技术方案为：
8.一种nk细胞体外增殖的方法，其特征在于，使用添加了去铁胺的细胞培养基；
9.优选的，所述去铁胺的含量为小于40μm。
10.更优选的，所述去铁胺的含量为10μm
‑
40μm。
11.另一方面，本发明提供一种nk细胞体外增殖培养基，其特征在于，所述培养基含有去铁胺。
附图说明
12.图1：不同dfo浓度下，nk细胞增殖率图；
13.图2：不同dfo浓度下，nk细胞杀伤率图；
具体实施方式
14.下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
15.实施例1
16.外周血nk细胞体外培养
17.抽取健康人外周血80ml，用100ml pbs缓冲液稀释，用淋巴细胞分离液，4℃离心15min，收集得到pbmc细胞，生理盐水洗涤，使用完全培养基(1640培养基 10％fbs)调整pbmc细胞起始密度为2
×
106/ml，il
‑
2的终浓度为300u/ml，37℃、5％co2条件下培养。
18.密切注意细胞密度和生长状态，及时隔天补液或换液，使il
‑
2的浓度维持在300u/ml，细胞密度维持在2
×
106/ml，培养10天。
19.实施例2
20.nk细胞培养
21.在96孔板中培养细胞，取实施例1的培养10天的nk细胞，设置空白组(nk细胞培养基)、对照组(细胞 nk细胞培养基)和dfo实验组(细胞 含dfo的细胞培养基)，空白组1个复孔、对照组8个复孔，dfo实验组32个复孔。每孔100μl，37℃、5％co2条件下培养24小时。24小时后，空白组和对照组更换为新鲜的nk细胞培养基继续培养，dfo组更换为含10μm、40μm、80μm、120μm dfo的培养基继续培养48小时。
22.对照组和实验组的8个复孔中，5个用于增殖活力实验，3个用于后续的杀伤性实验。
23.实施例3
24.nk细胞增殖活性测定
25.向实施例4中用于增殖活力实验的5个复孔中，每孔加入50μlmtt,继续作用4小时。小心吸去孔内培养液，每孔加入150μl的dmso。然后震荡10分钟，使孔底的紫色结晶充分溶解。在酶联免疫机器上测定吸光度，波长为490nm。
26.细胞增殖率＝(实验组od值
‑
对照组od值
‑
空白组od值)/(对照组od值
‑
空白组od值)
×
100％。
27.实施例4
28.肿瘤细胞杀伤率检测
29.杀伤实验方法
30.1)靶细胞的标记
31.使用k562细胞作为靶细胞，调整细胞浓度为1
×
106/ml，并悬浮于完全培养基中备用。
32.2)细胞杀伤试验
33.收集实施例4细胞，pbs洗涤三次，备用；
34.取生长旺盛的k562细胞，用含10％胎牛血清的rpmi 1640培养液调整细胞密度4
×
105/ml，接种于96孔板中，每孔加100μl；取实施例4培养的nk细胞，用含10％胎牛血清的rpmi 1640培养液调整细胞密度至4
×
106/ml，接种于96孔板中，使效靶比为10:1，每孔加100μl，同时设单独效应细胞孔、单独靶细胞孔，上述各组均设3个复孔，另设仪器调零孔
1640培养液孔1个，置于37℃、5％co2、饱和湿度的培养箱中培养24h，加入mmt试剂10μl，孵育4h后，3000rpm/10min离心，弃去上清液，每孔加dmso150μl，充分混匀，10分钟内酶标仪于570nm处测定a值。
35.杀伤活性(％)＝[1
‑
(实验孔a值－单独效应细胞孔a值)/单独靶细胞a值]
×
100％。
[0036]
实验结果
[0037]
1)细胞增殖实验结果如下表及图1所示：
[0038]
浓度增殖率(100％)0μm99.0510μm141.2340μm189.9580μm195.85120μm181.03
[0039]
其中0μm表示对照组数据。
[0040]
2)细胞杀伤实验结果如下表及图2所示：
[0041]
浓度k562细胞杀伤率(100％)0μm35.0110μm38.1840μm40.1380μm32.51120μm30.23
[0042]
其中0μm表示对照组数据。
[0043]
上述结果表明，培养基中去铁胺dfo的加入可以明显提升nk细胞体外培养的增殖率，在低浓度区间呈现浓度依赖性的特征，但是随着浓度的增高，增殖率的提高不再明显，80μm
‑
120μm区间甚至出现了增殖率下降的趋势，我们猜测可能是去铁胺浓度增大后，对于nk细胞的毒性变大，一定程度上抑制甚至降低了其促进nk细胞增殖的作用。
[0044]
杀伤力方面，对于10：1效靶比条件下，在低浓度区间10μm
‑
40μm的情况下，增殖之后的nk细胞的杀伤性并没有下降，甚至还略有提高，但是但是随着浓度的增大，dfo细胞毒性随之增加，增殖后的nk细胞活性及杀伤力开始降低。
[0045]
本技术证实了，在培养基中添加dfo能够有效的促进nk细胞的增殖，并在40μm添加量以下，能够保持或者增进nk细胞的杀伤活性。
[0046]
以上对本发明做了详尽的描述，但本发明不限于上述的实施例。凡根据本发明的精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。