一种长链烷烃降解菌及其应用的制作方法

一种长链烷烃降解菌及其应用
1.技术领域：本发明涉及的是工业废水处理技术，具体涉及的是一种长链烷烃降解菌及其应用。
2.

背景技术：
随着工业化技术的发展，含油废水、焦化废水、炼油废水、造纸废水等废水水质成分复杂，存在大量难生物降解成分，其中长链烷烃污染物可生化性差，处理较困难，生物强化技术通过投加目标污染降解菌加快这些有机污染物的降解速率。经水质分析表明，焦化废水中长链烷烃虽然含量不高，但却是水质达标的限速因素。通过色质联用技术（gas chromatography
‑
mass spectrometry，gc
‑
ms）对原水和二沉池出水进行分析，结果表明长链烷烃类化合物穿透率较高，降解率较低，虽然含量不高，但对于出水cod的贡献较大，处理较困难。
3.焦化废水成分复杂，主要含酚、氰化物、苯、氨氮、焦油和硫化物等有毒有害物质，还含少量萘、吡啶、喹啉、吲哚、蒽、咔唑以及一些以盐类形式存在的无机物，很难被生物降解。焦化废水的可生化性较差，属较难生物降解工业废水。
4.由于煤制气废水含有高浓度的酚类化合物、难降解有机物和有毒污染物，国内外煤制气废水的治理技术普遍存在出水效果不理想、系统稳定性差和处理成本高等问题。通过色质联用技术（gas chromatography
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mass spectrometry，gc
‑
ms）对原水和二沉池出水进行分析，结果表明长链烷烃类化合物穿透率较高，降解率较低，虽然含量不高，但却是水质达标的限速因素，对于出水cod的贡献较大，处理较困难。
5.

技术实现要素：
本发明的一个目的是提供一种长链烷烃降解菌，这种长链烷烃降解菌用于工业废水中难降解烃类污染物的有效去除问题；本发明的另一个目的是提供这种长链烷烃降解菌的应用。
6.本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：这种长链烷烃降解菌通过以下方法制备：（1）菌种富集：取10ml活性污泥加入装有100ml富集培养基的250ml三角瓶中，于35℃、180r/min的恒温摇床条件下培养7天，吸取5ml培养液转接至新鲜富集培养基中，于35℃、180r/min的恒温摇床条件下再培养7天，如此连续富集培养28天；（2） 长链烃降解菌的分离：取连续富集培养28天的200μl富集培养液经梯度稀释后涂布在分离培养基上，稀释浓度梯度为10
‑1，10
‑2，10
‑3.....10
‑8，10
‑9，每个浓度涂布三个培养皿平行培养，于35℃恒温箱中倒置培养，待平板长出菌落后，根据菌落的形态、大小和颜色挑取不同的单菌落；（3） 长链烷烃降解菌的纯化：取分离的单菌落，在分离培养基平板上采用划线法，于35℃恒温箱中倒置培养7d；如此反复转接三次，直至获得纯化的单菌落，得到长链烃降解菌；
提取菌株的基因组dna，利用通用引物8f和1492r对16srdna基因进行pcr扩增，测序后获得16srdna序列，经菌种鉴定，长链烃降解菌属于戈登氏菌属。
7.上述方案中活性污泥来自哈依煤气煤制气废水处理工艺二沉池。
8.上述长链烷烃降解菌用于对工业废水中难降解的烃类污染物进行生物降解。
9.上述方案中长链烷烃降解菌用于对混合长链烷烃生物降解的降解条件为： ph4.0
‑
10.0，温度25
‑
45℃，摇床转速为150
‑
210r/min。
10.上述方案中长链烷烃降解菌用于对混合长链烷烃生物降解时，在ph7.0，温度35℃，摇床转速为180r/min条件下，降解率达到78%。
11.上述方案中工业废水包括焦化废水、炼油废水、造纸废水、制药废水。
12.本发明具有以下有益效果：（1）酸性条件或碱性条件均对降解菌有一定的抵制作用，但本发明提供的长链烷烃降解菌在ph4.0
‑
10.0的范围内能够保持一定活性，说明长链烷烃降解菌能在较大的ph范围内保持降解长链烷烃的能力，具有较强的适应环境能力，在不利环境条件下，能够发挥一定的降解作用。
13.（2）本发明降解长链烷烃的能力比较强，降解率可达到78%，解决了工业废水中难降解烃类污染物的有效去除问题。
14.附图说明：图1是不同ph对本发明长链烷烃降解菌降解率的影响曲线图；图2是不同温度对本发明长链烷烃降解菌降解率的影响曲线图；图3是不同转速对本发明长链烷烃降解菌降解率的影响曲线图。
15.具体实施方式：下面对本发明做进一步的说明：这种长链烷烃降解菌通过以下方法制备：（1）菌种富集：取10ml活性污泥加入装有100ml富集培养基的250ml三角瓶中，于35℃、180r/min的恒温摇床条件下培养7天，吸取5ml培养液转接至新鲜富集培养基中，于35℃、180r/min的恒温摇床条件下再培养7天，如此连续富集培养28天；活性污泥来自哈依煤气煤制气废水处理工艺二沉池。
16.（2） 长链烃降解菌的分离：取连续富集培养28天的200μl富集培养液经梯度稀释后涂布在分离培养基上，稀释浓度梯度为10
‑1，10
‑2，10
‑3.....10
‑8，10
‑9，每个浓度涂布三个培养皿平行培养，于35℃恒温箱中倒置培养，待平板长出菌落后（一般10
‑6或10
‑7稀释浓度的平板单菌落分布较好），根据菌落的形态、大小和颜色挑取不同的单菌落。
17.（3） 长链烷烃降解菌的纯化：取分离的单菌落，在分离培养基平板上采用划线法，于35℃恒温箱中倒置培养7d；如此反复转接三次，直至获得纯化的单菌落，得到长链烃降解菌；提取菌株的基因组dna，利用通用引物8f和1492r对16srdna基因进行pcr扩增，测序后获得16srdna序列，经菌种鉴定，长链烃降解菌属于戈登氏菌属。
18.上述长链烷烃降解菌用于对工业废水中难降解的烃类污染物进行生物降解，尤其
是对混合长链烷烃生物降解。
19.长链烷烃降解菌用于对混合长链烷烃生物降解的降解条件为： ph4.0
‑
10.0，温度25
‑
45℃，摇床转速为150
‑
210r/min，优选的是：在ph7.0，温度35℃，摇床转速为180r/min条件下，降解率达到78%。
20.这种长链烷烃降解菌的形态特征：将3株长链烷烃降解菌于分离培养基上划线培养，37℃倒置培养5d后观察菌落形态及菌体特征，并对各菌种进行革兰氏染色，结果见表1。
21.表1 菌株（菌落）的形态特征
菌名菌落形态菌落颜色细菌形状革兰氏染色lys1
‑
3圆形，边缘规则，质地光滑，表面突起土黄色，不透明短杆，无鞭毛阳性lys1
‑
4圆形，边缘不规则，质地光滑，表面突起土黄色，不透明短杆，无鞭毛阳性lys2
‑
1圆形较小，边缘整齐，质地光滑土黄色，透明短杆，无鞭毛阳性
提取本发明长链烷烃降解菌菌株lys1
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3，lys1
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4，lys2
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1的基因组dna，利用通用引物8f和1492r对16srdna基因进行pcr扩增，将pcr产物送至哈尔滨博士生物公司回收并测序。测序后获得16srdna序列，在韩国菌种鉴定网站（http://eztaxon
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e.ezbiocloud.net/）中进行比对，从而判断各菌株的分类地位。根据1993年goodfellow和o’donnell提出的16srdna的序列同源性≥95%的种可归为同一属，发现3株菌均属于戈登氏菌属(gordonia sp.)，结果见表2。
22.表2 3株长链烷烃降解菌的16srdna鉴定结果环境因子对本发明长链烷烃降解菌降解特性的影响：（1）ph对长链烷烃降解菌降解特性的影响：环境中ph对微生物生长的影响很大，ph的主要效应是引起细胞膜电荷的变化(一般细菌表面带有负电荷)以及营养物质离子化程度，从而影响微生物对营养物(如氨、磷酸盐等)的可利用性
7.。在本试验中，以1000mg/l的混合长链烷烃为唯一碳源，在180rpm、35℃条件下培养12d，考察不同ph（2，4，6，7，8，10，12）对长链烷烃降解菌降解率的影响。
23.如图1所示，本发明长链烷烃降解菌在ph为7.0时达到最大的降解率。该菌在ph2.0以下和ph12.0以上均不能生长，与空白对照的降解率相当，大约为2%，说明ph过高或过低均会对菌造成伤害，导致菌体生长受到严重抑制，从而降解率降低。ph6.0
‑
8.0范围内菌株的降解率较高。菌lys1
‑
3在ph小于2或大于12时还是具有一定的降解率，说明菌lys1
‑
3对于不利的环境具有一定的忍耐性。在试验过程中还发现培养后的溶液ph明显变小(数据未显示)，可能原因是长链烷烃的微生物降解过程会产生一些长链脂肪酸
8.，降低了溶液的ph。另外，酸性条件或碱性条件均对降解菌有一定的抵制作用，但本发明长链烷烃降解菌菌株在ph4.0
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10.0的范围内能够保持一定活性，说明菌株能在较大的ph范围内保持降解长链烷烃的能力，具有较强的适应环境能力，在不利环境条件下，能够发挥一定的降解作用。
24.（2）温度对长链烷烃降解菌降解特性的影响：由于长链烷烃在常温下大多为固态，难溶于水，严重影响烃的传质效率，影响烃降解菌的降解效能。改变温度对烃的物理状态有较大影响，从而改变烃的溶解性和降解效率。在本试验中，以1000mg/l的混合长链烷烃为唯一碳源，在ph7.0、180rpm条件下培养12d，考察不同温度（15℃，25℃，35℃，45℃，55℃）对长链烷烃降解菌降解率的影响。
25.从图2可知，本发明长链烷烃降解菌在15℃和55℃时均不能生长，基本没有降解活性。分析原因可能由于过低或过高的温度抑制了降解酶的活性，导致菌体不能利用长链烷烃作为碳源生长繁殖。本发明长链烷烃降解菌在25℃
‑
45℃范围内菌具有降解活性，但在35℃时，降解率最大，说明长链烷烃降解菌降解烃最适温度为35℃，在这个温度下，长链烷烃的降解酶活性较高并且具有一定的溶解度
9.，为烃降解菌的吸附摄取降解长链烷烃提供有利条件。
26.（3）摇床转速对长链烷烃降解菌降解特性的影响：摇床的转速改变，可以改变烃降解菌与长链烷烃的接触面积及溶解氧含量，从而影响烃降解菌的降解速率。在本试验中，以1000mg/l的混合长链烷烃浓度为唯一碳源，ph7.0，35℃条件下培养12d，考察不同转速（0，90rpm，120rpm，150rpm，180rpm，210rpm）对长链烷烃降解菌降解率的影响。
27.如图3所示，转速升高对本发明长链烷烃降解菌降解率的提高均有促进作用，但随着转速的增加烃降解率的升高速率有所下降。尤其是在转速为210rpm时降解率不升反降，说明并不是转速越高越好。转速的升高可以有效提高长链烷烃的界面面积，增加长链烷烃与烃降解菌的接触面积，并能提高摇瓶内的溶解氧含量，从而达到提高降解速率的作用。但是当转速过高会对体系的传质和稳定产生影响，造成降解率的下降。
28.结论：长链烷烃降解菌的环境因子优化结果：最适ph7.0，温度35℃，摇床转速为180r/min。