人源化抗HAdV-B7单克隆中和抗体、制备方法及其应用与流程

人源化抗hadv
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b7单克隆中和抗体、制备方法及其应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种人源化抗hadv
‑
b7单克隆中和抗体、制备方法及其应用。


背景技术：

2.hadv是常见的呼吸道病毒，其感染所致的重症肺炎是儿童致死、致残的重要原因之一。据文献报道，重症肺炎患儿中高达13.3%为hadv感染所致。b种hadv是hadv重症肺炎患儿感染的最主要型别，其中，b种hadv 7型（hadv
‑
b7）感染更容易引起儿重症肺炎并伴随较高的病死率。目前尚无有效的方法用于预防和治疗hadv肺炎。广谱抗病毒药物西多福韦对早期hadv感染有一定的疗效，但对hadv肺炎疗效并不明显。国外学者尝试寻找新的抗hadv化学药物，但尚未取得重大突破。
3.抗病毒单克隆中和抗体凭借特异性高和抗病毒效果显著的特点，在病毒的预防和治疗方面发挥着重要的作用，同时，给hadv感染的防治带来了希望。目前，已有报道的抗hadv
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b7单克隆中和抗体均为鼠源抗体。实践证明，鼠源抗体进入人体后，引起机体免疫系统对该异种蛋白的免疫排斥反应，产生人抗鼠抗体（human anti
‑
mouse antibody，hama）反应，可使鼠源抗体加速被清除，甚至引起过敏性休克，因而被淘汰。


技术实现要素：

4.基于此，有必要提供一种能够解决鼠源抗hadv
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b7单克隆中和抗体引起人体免疫排斥反应的问题的人源化抗hadv
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b7单克隆中和抗体、制备方法及其应用。
5.一种人源化抗hadv
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b7单克隆中和抗体，编码抗体的基因序列包括重链可变区的序列以及轻链可变区的序列，重链可变区的基因序列如seq id no:1所示，轻链可变区的基因序列如seq id no:2所示。
6.在其中一些实施例中，所述重链可变区包括重链互补决定区以及重链骨架区；其中，所述重链互补决定区包括：seq id no.3所示的重链cdr1、seq id no.4所示的重链cdr2和seq id no.5所示的重链cdr3；所述重链骨架区包括seq id no.6所示的重链fr1、seq id no.7所示的重链fr2、seq id no.8所示的重链fr3和seq id no.9所示的重链fr4。
7.在其中一些实施例中，所述轻链可变区包括轻链互补决定区以及轻链骨架区；其中，所述轻链互补决定区包括：seq id no.10所示的轻链cdr1、seq id no.11所示的轻链cdr2和seq id no.12所示的轻链cdr3；所述轻链骨架区包括seq id no.13所示的轻链fr1、seq id no.14所示的轻链fr2、seq id no.15所示的轻链fr3和seq id no.16所示的轻链fr4。
8.在其中一些实施例中，所述重链可变区的氨基酸序列如seq id no.17所示。
9.在其中一些实施例中，所述轻链可变区的氨基酸序列如seq id no.18所示。
10.本发明的目的之一还在于提供了一种核酸分子。
11.一种核酸分子，所述核酸分子编码所述的人源化抗hadv
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b7单克隆中和抗体的重链可变区和/或轻链可变区。
12.本发明的目的之一还在于提供了一种重组载体。
13.一种重组载体，所述重组载体含有所述的核酸分子。
14.本发明的目的之一还在于提供了一种重组载体的制备方法。
15.一种所述的重组载体的制备方法，包括如下步骤：（1）杂交瘤细胞的复苏与培养应用杂交瘤技术制备分泌鼠源抗hadv
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b7单克隆中和抗体的杂交瘤细胞对其进行扩大培养；（2）重链可变区基因和轻链可变区基因的扩增（2.1）rna提取：提取杂交瘤细胞的总rna；（2.2）反转录：对提取的总rna进行反转录，合成cdna；（2.3）pcr扩增：以合成的cdna为模板，分别 pcr扩增鼠源抗体重链可变区基因片段和鼠源抗体轻链可变区基因片段，分别回收鼠源抗体重链可变区基因片段和鼠源抗体轻链可变区基因片段；（3）鼠源抗体重链可变区基因片段和鼠源抗体轻链可变区基因片段表达载体的构建回收的鼠源抗体重链可变区基因片段连接到表达载体上，转化鉴定；回收的鼠源抗体轻链可变区基因片段连接到表达载体上，转化鉴定；（4）嵌合抗体的表达与其中和活性的检测分别提取鼠源抗体重链可变区基因片段表达质粒和鼠源抗体轻链可变区基因片段表达质粒后，将鼠源抗体重链可变区基因片段表达质粒和鼠源抗体轻链可变区基因片段表达质粒共转染，然后检测嵌合抗体抗hadv
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b7的中和活性；（5）嵌合抗体的表达与纯化分别提取鼠源抗体重链可变区基因片段表达质粒和鼠源抗体轻链可变区基因片段表达质粒，将鼠源抗体重链可变区基因片段表达质粒和鼠源抗体轻链可变区基因片段表达质粒共悬浮转染细胞，收集细胞培养上清，分离纯化嵌合抗体，浓缩嵌合抗体，测定嵌合抗体的浓度；（6）检测嵌合抗体的中和活性（7）人源化改造确定鼠源抗体重链可变区的重链cdr1、重链cdr2、重链cdr3、重链fr1、重链fr2、重链fr3和重链fr4，确定鼠源抗体轻链可变区的轻链cdr1、轻链cdr2、轻链cdr3、轻链fr1、轻链fr2、轻链fr3和轻链fr4，以人源抗体重链可变区的重链fr1、重链fr2、重链fr3和重链fr4分别替换鼠源抗体重链可变区的重链fr1、重链fr2、重链fr3和重链fr4，构建人源化抗体重链可变区；以人源抗体轻链可变区的轻链fr1、轻链fr2、轻链fr3和轻链fr4分别替换鼠源抗体轻链可变区的轻链fr1、轻链fr2、轻链fr3和轻链fr4，构建人源化抗体轻链可变区；按照cho细胞密码子合成人源化抗体重链可变区和人源化抗体轻链可变区基因；将人源化抗体重链可变区基因连接到表达载体上，构建人源化抗体重链可变区基因表达载体，将人源化抗体轻链可变区基因连接到表达载体上，构建人源化抗体轻链可变区基因表达载体；
（8）人源化抗体的表达与其中和活性的检测分别提取人源化抗体重链可变区基因表达载体和人源化抗体轻链可变区基因表达载体，将人源化抗体重链可变区基因表达载体和人源化抗体轻链可变区基因表达载体共转染，鉴定。
16.本发明的目的之一还在于提供了一种重组细胞。
17.一种重组细胞，所述重组细胞表达所述的人源化抗hadv
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b7单克隆中和抗体，本发明的目的之一还在于提供了一种重组细胞。
18.一种重组细胞，所述重组细胞的基因组中整合有所述的核酸分子。
19.本发明的目的之一还在于提供了一种重组细胞。
20.一种重组细胞，所述重组细胞包括所述的重组载体。
21.本发明的目的之一还在于提供了一种重组细胞的制备方法。
22.一种所述的重组细胞的制备方法，包括如下步骤：（1）杂交瘤细胞的复苏与培养应用杂交瘤技术制备分泌鼠源抗hadv
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b7单克隆中和抗体的杂交瘤细胞对其进行扩大培养；（2）重链可变区基因和轻链可变区基因的扩增（2.1）rna提取：提取杂交瘤细胞的总rna；（2.2）反转录：对提取的总rna进行反转录，合成cdna；（2.3）pcr扩增：以合成的cdna为模板，分别 pcr扩增鼠源抗体重链可变区基因片段和鼠源抗体轻链可变区基因片段，分别回收鼠源抗体重链可变区基因片段和鼠源抗体轻链可变区基因片段；（3）鼠源抗体重链可变区基因片段和鼠源抗体轻链可变区基因片段表达载体的构建回收的鼠源抗体重链可变区基因片段连接到表达载体上，转化鉴定；回收的鼠源抗体轻链可变区基因片段连接到表达载体上，转化鉴定；（4）嵌合抗体的表达与其中和活性的检测分别提取鼠源抗体重链可变区基因片段表达质粒和鼠源抗体轻链可变区基因片段表达质粒后，将鼠源抗体重链可变区基因片段表达质粒和鼠源抗体轻链可变区基因片段表达质粒共转，然后检测嵌合抗体抗hadv
‑
b7的中和活性；（5）嵌合抗体的表达与纯化分别提取鼠源抗体重链可变区基因片段表达质粒和鼠源抗体轻链可变区基因片段表达质粒，将鼠源抗体重链可变区基因片段表达质粒和鼠源抗体轻链可变区基因片段表达质粒共悬浮转染细胞，收集细胞培养上清，分离纯化嵌合抗体，浓缩嵌合抗体，测定嵌合抗体的浓度；（6）检测嵌合抗体的中和活性（7）人源化改造确定鼠源抗体重链可变区的重链cdr1、重链cdr2、重链cdr3、重链fr1、重链fr2、重链fr3和重链fr4，确定鼠源抗体轻链可变区的轻链cdr1、轻链cdr2、轻链cdr3、轻链fr1、轻链fr2、轻链fr3和轻链fr4，以人源抗体重链可变区的重链fr1、重链fr2、重链fr3和重链fr4
分别替换鼠源抗体重链可变区的重链fr1、重链fr2、重链fr3和重链fr4，构建人源化抗体重链可变区；以人源抗体轻链可变区的轻链fr1、轻链fr2、轻链fr3和轻链fr4分别替换鼠源抗体轻链可变区的轻链fr1、轻链fr2、轻链fr3和轻链fr4，构建人源化抗体轻链可变区；按照cho细胞密码子合成人源化抗体重链可变区和人源化抗体轻链可变区基因；将人源化抗体重链可变区基因连接到表达载体上，构建人源化抗体重链可变区基因表达载体，将人源化抗体轻链可变区基因连接到表达载体上，构建人源化抗体轻链可变区基因表达载体；（8）人源化抗体的表达与其中和活性的检测分别提取人源化抗体重链可变区基因表达载体和人源化抗体轻链可变区基因表达载体，将人源化抗体重链可变区基因表达载体和人源化抗体轻链可变区基因表达载体共转染细胞，获得重组细胞，收集重组细胞培养上清，分离纯化嵌合抗体，检测嵌合抗体抗hadv
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b7的中和活性；（9）人源化抗体的表达与纯化分别提取人源化抗体重链可变区基因表达载体和人源化抗体轻链可变区基因表达载体，将分别提取人源化抗体重链可变区基因表达载体和人源化抗体轻链可变区基因表达载体共悬浮转染细胞，获得重组细胞，收集重组细胞培养上清，分离纯化人源化抗体，浓缩后测定浓度；（10）检测人源化抗体抗hadv
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b7的中和活性。
23.本发明的目的之一还在于提供了一种药物组合物。
24.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括所述的人源化抗hadv
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b7单克隆中和抗体。
25.在一些实施例中，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂中的至少一种。
26.本发明的目的之一还在于提供了所述的人源化抗hadv
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b7单克隆中和抗体在制备检测hadv
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b7的诊断试剂盒中的应用。
27.本发明的目的之一还在于提供了一种重症肺炎病毒诊断试剂盒。
28.一种重症肺炎病毒诊断试剂盒，所述重症肺炎病毒诊断试剂盒包括所述的人源化抗hadv
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b7单克隆中和抗体，所述重症肺炎病毒为hadv
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b7。
29.在一些实施例中，所述重症肺炎病毒诊断试剂盒采用酶联免疫检测法、化学发光免疫测定法或者免疫层析法。
30.本发明的目的之一还在于提供了一种人源化抗hadv
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b7单克隆中和抗体的制备方法。
31.一种所述的人源化抗hadv
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b7单克隆中和抗体的制备方法，包括如下步骤：培养重组细胞，从培养产物中分离纯化得到所述人源化抗hadv
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b7单克隆中和抗体，其中，所述重组细胞含有重组载体，所述重组载体含有编码所述的人源化抗hadv
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b7单克隆中和抗体的核酸序列。
32.本发明的成功表达和纯化了人源化抗hadv
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b7单克隆中和抗体。人源化抗hadv
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b7单克隆中和抗体单位浓度的中和比值高于嵌合抗体，单位浓度的中和比值越高，活性越强，鼠源抗体的人源化改造提高了抗体的中和活性。人源化抗hadv
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b7单克隆中和抗体稀释4608倍后，浓度为0.03μg/ml，可抑制80%的细胞产生致细胞病变效应（cytopathic effect，
cpe）。鼠源抗体的人源化改造，使原本的鼠源成分绝大部分被替换成人源成分，从而避免hama反应的发生，因此，本发明的人源化抗hadv
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b7单克隆中和抗体在使用上更加安全。
附图说明
33.图1为本发明实施例1所述的人源化抗hadv
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b7单克隆中和抗体的电泳示意图；图2为本发明实施例1所述的人源化抗hadv
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b7单克隆中和抗体对hadv
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b7作用示意图。
具体实施方式
34.为了便于理解本发明，下面将参照实施例对本发明进行更全面的描述，以下给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。应理解，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用试剂，均为市售产品。
35.除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
36.本技术实施例提供一种人源化抗hadv
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b7单克隆中和抗体，编码抗体的基因序列包括重链可变区的序列以及轻链可变区的序列，重链可变区的基因序列如seq id no:1所示，轻链可变区的基因序列如seq id no:2所示。
37.在其中一些实施例中，所述重链可变区包括重链互补决定区以及重链骨架区；其中，所述重链互补决定区包括：seq id no.3所示的重链cdr1、seq id no.4所示的重链cdr2和seq id no.5所示的重链cdr3；所述重链骨架区包括seq id no.6所示的重链fr1、seq id no.7所示的重链fr2、seq id no.8所示的重链fr3和seq id no.9所示的重链fr4。
38.在其中一些实施例中，所述轻链可变区包括轻链互补决定区以及轻链骨架区；其中，所述轻链互补决定区包括：seq id no.10所示的轻链cdr1、seq id no.11所示的轻链cdr2和seq id no.12所示的轻链cdr3；所述轻链骨架区包括seq id no.13所示的轻链fr1、seq id no.14所示的轻链fr2、seq id no.15所示的轻链fr3和seq id no.16所示的轻链fr4。
39.在其中一些实施例中，所述重链可变区的氨基酸序列如seq id no.17所示。
40.在其中一些实施例中，所述轻链可变区的氨基酸序列如seq id no.18所示。
41.本发明另一实施例还提供了一种核酸分子。
42.一种核酸分子，所述核酸分子编码所述的人源化抗hadv
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b7单克隆中和抗体的重链可变区和/或轻链可变区。
43.本发明另一实施例还提供了一种重组载体。
44.一种重组载体，所述重组载体含有所述的核酸分子。
45.本发明另一实施例还提供了一种重组载体的制备方法。
46.一种所述的重组载体的制备方法，包括如下步骤：（1）杂交瘤细胞的复苏与培养应用杂交瘤技术制备分泌鼠源抗hadv
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b7单克隆中和抗体的杂交瘤细胞对其进行扩大培养；（2）重链可变区基因和轻链可变区基因的扩增（2.1）rna提取：提取杂交瘤细胞的总rna；（2.2）反转录：对提取的总rna进行反转录，合成cdna；（2.3）pcr扩增：以合成的cdna为模板，分别 pcr扩增鼠源抗体重链可变区基因片段和鼠源抗体轻链可变区基因片段，分别回收鼠源抗体重链可变区基因片段和鼠源抗体轻链可变区基因片段；（3）鼠源抗体重链可变区基因片段和鼠源抗体轻链可变区基因片段表达载体的构建回收的鼠源抗体重链可变区基因片段连接到表达载体上，转化鉴定；回收的鼠源抗体轻链可变区基因片段连接到表达载体上，转化鉴定；（4）嵌合抗体的表达与其中和活性的检测分别提取鼠源抗体重链可变区基因片段表达质粒和鼠源抗体轻链可变区基因片段表达质粒后，将鼠源抗体重链可变区基因片段表达质粒和鼠源抗体轻链可变区基因片段表达质粒共转染，然后检测嵌合抗体抗hadv
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b7的中和活性；（5）嵌合抗体的表达与纯化分别提取鼠源抗体重链可变区基因片段表达质粒和鼠源抗体轻链可变区基因片段表达质粒，将鼠源抗体重链可变区基因片段表达质粒和鼠源抗体轻链可变区基因片段表达质粒共悬浮转染细胞，收集细胞培养上清，分离纯化嵌合抗体，浓缩嵌合抗体，测定嵌合抗体的浓度；（6）检测嵌合抗体的中和活性（7）人源化改造确定鼠源抗体重链可变区的重链cdr1、重链cdr2、重链cdr3、重链fr1、重链fr2、重链fr3和重链fr4，确定鼠源抗体轻链可变区的轻链cdr1、轻链cdr2、轻链cdr3、轻链fr1、轻链fr2、轻链fr3和轻链fr4，以人源抗体重链可变区的重链fr1、重链fr2、重链fr3和重链fr4分别替换鼠源抗体重链可变区的重链fr1、重链fr2、重链fr3和重链fr4，构建人源化抗体重链可变区；以人源抗体轻链可变区的轻链fr1、轻链fr2、轻链fr3和轻链fr4分别替换鼠源抗体轻链可变区的轻链fr1、轻链fr2、轻链fr3和轻链fr4，构建人源化抗体轻链可变区；按照cho细胞密码子合成人源化抗体重链可变区和人源化抗体轻链可变区基因；将人源化抗体重链可变区基因连接到表达载体上，构建人源化抗体重链可变区基因表达载体，将人源化抗体轻链可变区基因连接到表达载体上，构建人源化抗体轻链可变区基因表达载体；（8）人源化抗体的表达与其中和活性的检测分别提取人源化抗体重链可变区基因表达载体和人源化抗体轻链可变区基因表达载体，将人源化抗体重链可变区基因表达载体和人源化抗体轻链可变区基因表达载体共转染，鉴定。
47.本发明另一实施例还提供了一种重组细胞。
48.一种重组细胞，所述重组细胞表达所述的人源化抗hadv
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b7单克隆中和抗体，本发明另一实施例还提供了一种重组细胞。
49.一种重组细胞，所述重组细胞的基因组中整合有所述的核酸分子。
50.本发明另一实施例还提供了一种重组细胞。
51.一种重组细胞，所述重组细胞包括所述的重组载体。
52.本发明另一实施例还提供了一种重组细胞的制备方法。
53.一种所述的重组细胞的制备方法，包括如下步骤：（1）杂交瘤细胞的复苏与培养应用杂交瘤技术制备分泌鼠源抗hadv
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b7单克隆中和抗体的杂交瘤细胞对其进行扩大培养；（2）重链可变区基因和轻链可变区基因的扩增（2.1）rna提取：提取杂交瘤细胞的总rna；（2.2）反转录：对提取的总rna进行反转录，合成cdna；（2.3）pcr扩增：以合成的cdna为模板，分别 pcr扩增鼠源抗体重链可变区基因片段和鼠源抗体轻链可变区基因片段，分别回收鼠源抗体重链可变区基因片段和鼠源抗体轻链可变区基因片段；（3）鼠源抗体重链可变区基因片段和鼠源抗体轻链可变区基因片段表达载体的构建回收的鼠源抗体重链可变区基因片段连接到表达载体上，转化鉴定；回收的鼠源抗体轻链可变区基因片段连接到表达载体上，转化鉴定；（4）嵌合抗体的表达与其中和活性的检测分别提取鼠源抗体重链可变区基因片段表达质粒和鼠源抗体轻链可变区基因片段表达质粒后，将鼠源抗体重链可变区基因片段表达质粒和鼠源抗体轻链可变区基因片段表达质粒共转，然后检测嵌合抗体抗hadv
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b7的中和活性；（5）嵌合抗体的表达与纯化分别提取鼠源抗体重链可变区基因片段表达质粒和鼠源抗体轻链可变区基因片段表达质粒，，将鼠源抗体重链可变区基因片段表达质粒和鼠源抗体轻链可变区基因片段表达质粒共悬浮转染细胞，收集细胞培养上清，分离纯化嵌合抗体，浓缩嵌合抗体，测定嵌合抗体的浓度；（6）检测嵌合抗体的中和活性（7）人源化改造确定鼠源抗体重链可变区的重链cdr1、重链cdr2、重链cdr3、重链fr1、重链fr2、重链fr3和重链fr4，确定鼠源抗体轻链可变区的轻链cdr1、轻链cdr2、轻链cdr3、轻链fr1、轻链fr2、轻链fr3和轻链fr4，以人源抗体重链可变区的重链fr1、重链fr2、重链fr3和重链fr4分别替换鼠源抗体重链可变区的重链fr1、重链fr2、重链fr3和重链fr4，构建人源化抗体重链可变区；以人源抗体轻链可变区的轻链fr1、轻链fr2、轻链fr3和轻链fr4分别替换鼠源抗体轻链可变区的轻链fr1、轻链fr2、轻链fr3和轻链fr4，构建人源化抗体轻链可变区；按照cho细胞密码子合成人源化抗体重链可变区和人源化抗体轻链可变区基因；将人源化抗体重链可变区基因连接到表达载体上，构建人源化抗体重链可变区基因表达载体，将人源化
synthesis supermix for pcr（北京全式金生物技术有限公司）对提取的总rna进行反转录，合成cdna。
66.（2.3）pcr扩增：以合成的cdna为模板，使用primestar
®ꢀ
hs dna polymerase with gc buffer（takara）分别 pcr扩增鼠源抗体重链可变区基因片段和鼠源抗体轻链可变区基因片段，50μl反应体系：1μl cdna，primestar hs dna polymerase，2
×
primestar gc buffer，dntp mixture，10μm各亚型鼠源抗体重链可变区和鼠源抗体轻链可变区混合引物；反应体系：98℃10sec，60℃5sec，72℃1min，30个循环。反应液经1%琼脂糖凝胶电泳后，使用qiaquick
®ꢀ
gel extrection kit（qiagen）分别回收鼠源抗体重链可变区基因片段和鼠源抗体轻链可变区基因片段。
67.（3）鼠源抗体重链可变区基因片段和鼠源抗体轻链可变区基因片段表达载体的构建回收的鼠源抗体重链可变区基因片段连接到pfusess
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chig
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hg1表达载体上，转化鉴定，连接产物转化dh5α感受态细菌，在含有zeocin的llb平板上过夜培养。挑取单个菌落，接种于含有zeocin的llb培养基中，37℃过夜培养。使用plasmid mini kit（omega）提取质粒后，进行基因测序，从而确定鼠源抗体重链可变区基因表达载体。
68.回收的鼠源抗体轻链可变区基因片段连接到pfuse2ss
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clig
‑
hk表达载体上，转化鉴定，连接产物转化dh5α感受态细菌，在含有blasticidin的llb平板上过夜培养。挑取单个菌落，接种于含有blasticidin的llb培养基中，37℃过夜培养。使用plasmid mini kit（omega）提取质粒后，进行基因测序，从而确定鼠源抗体轻链可变区基因表达载体。
69.（4）嵌合抗体的表达与其中和活性的检测使用endo
‑
free plasmid mini kit（omega）分别提取鼠源抗体重链可变区基因片段表达质粒和鼠源抗体轻链可变区基因片段表达质粒后，使用transintrotm el transfection reagent（北京全式金生物技术有限公司），将鼠源抗体重链可变区基因片段表达质粒和鼠源抗体轻链可变区基因片段表达质粒共转染expicho细胞，7天后收集细胞培养上清，然后检测嵌合抗体抗hadv
‑
b7的中和活性。
70.（5）嵌合抗体的表达与纯化使用endo
‑
free plasmid maxi kit（omega）分别提取鼠源抗体重链可变区基因片段表达质粒和鼠源抗体轻链可变区基因片段表达质粒，使用transintrotm el transfection reagent（北京全式金生物技术有限公司），将鼠源抗体重链可变区基因片段表达质粒和鼠源抗体轻链可变区基因片段表达质粒共悬浮转染expicho细胞，隔天添加补料，7天后收集细胞培养上清，然后使用protein g纯化介质分离纯化嵌合抗体，并使用50kda超滤管浓缩嵌合抗体，测定嵌合抗体的浓度。
71.（6）检测嵌合抗体的中和活性应用基于流式细胞术的中和试验检测嵌合抗体对hadv
‑
b7的中和作用。
72.（7）人源化改造使用moe软件分析嵌合抗体重链可变区和嵌合抗体轻链可变区，确定鼠源抗体重链可变区的重链cdr1、重链cdr2、重链cdr3、重链fr1、重链fr2、重链fr3和重链fr4，确定鼠源抗体轻链可变区的轻链cdr1、轻链cdr2、轻链cdr3、轻链fr1、轻链fr2、轻链fr3和轻链fr4，以人源抗体重链可变区的重链fr1、重链fr2、重链fr3和重链fr4分别替换鼠源抗体重
链可变区的重链fr1、重链fr2、重链fr3和重链fr4，构建人源化抗体重链可变区；以人源抗体轻链可变区的轻链fr1、轻链fr2、轻链fr3和轻链fr4分别替换鼠源抗体轻链可变区的轻链fr1、轻链fr2、轻链fr3和轻链fr4，构建人源化抗体轻链可变区；按照cho细胞密码子合成人源化抗体重链可变区和人源化抗体轻链可变区基因；将人源化抗体重链可变区基因连接到pfusess
‑
chig
‑
hg1表达载体上，构建人源化抗体重链可变区基因表达载体，将人源化抗体κ轻链可变区基因连接到pfuse2ss
‑
clig
‑
hk表达载体上，构建人源化抗体轻链可变区基因表达载体。
73.（8）人源化抗体的表达与其中和活性的检测使用endo
‑
free plasmid mini kit（omega）分别提取人源化抗体重链可变区基因表达载体和人源化抗体轻链可变区基因表达载体，使用transintrotm el transfection reagent（北京全式金生物技术有限公司），将人源化抗体重链可变区基因表达载体和人源化抗体轻链可变区基因表达载体共转染expicho细胞，获得重组细胞，7天后收集重组细胞培养上清，分离纯化嵌合抗体，检测嵌合抗体抗hadv
‑
b7的中和活性。
74.（9）人源化抗体的表达与纯化使用endo
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free plasmid maxi kit（omega）分别提取人源化抗体重链可变区基因表达载体和人源化抗体轻链可变区基因表达载体，使用transintrotm el transfection reagent（北京全式金生物技术有限公司），将分别提取人源化抗体重链可变区基因表达载体和人源化抗体轻链可变区基因表达载体共悬浮转染expicho细胞，获得重组细胞。培养重组细胞，隔天添加补料，7天后收集重组细胞培养上清，然后使用protein g纯化介质分离纯化人源化抗体，并使用50kda超滤管浓缩人源化抗体，测定浓度，得到人源化抗hadv
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b7单克隆中和抗体。
75.（10）检测人源化抗hadv
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b7单克隆中和抗体的中和活性应用微量中和试验检测人源化抗hadv
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b7单克隆中和抗体的中和作用，步骤如下：在96孔板上稀释待测人源化抗hadv
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b7单克隆中和抗体，以1:9作为起始浓度，4倍稀释人源化抗hadv
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b7单克隆中和抗体至1:2304，共设5个稀释度，每个稀释度含165μl稀释的人源化抗hadv
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b7单克隆中和抗体；每个稀释度分别加入165μl稀释的hadv
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b7（200tcid50/0.1ml，genbank：gq478341.1），混匀，在37℃含5% co2培养箱内孵育1h；将在96孔板中单层贴壁生长，细胞密度为80%的细胞的生长液弃去，每孔加入人源化抗hadv
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b7单克隆中和抗体和hadv
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b7混合液100μl，每个稀释度设3个复孔，同时设立病毒对照和空白对照，在37℃含5% co2的培养箱内吸附2h；弃去人源化抗hadv
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b7单克隆中和抗体和hadv
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b7混合物，每孔补加100μl dmem/f
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12，在37℃含5% co2培养箱内培养3天；观察cpe。
76.应用基于流式细胞术的中和试验检测人源化抗hadv
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b7单克隆中和抗体对hadv
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b7的中和作用。步骤如下：人源化抗hadv
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b7单克隆中和抗体稀释步骤与微量中和试相同；每个稀释度分别加入165μl稀释的表达增强绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein，egfp）的hadv
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b7（使18%
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20%的细胞表达egfp/0.1ml），混匀，在37℃含5% co2培养箱内孵育1h；将在96孔板中单层贴壁生长，细胞密度为90%的细胞的生长液弃去，每孔加入人源化抗hadv
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b7单克隆中和抗体和表达egfp的hadv
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b7混合液100μl，每个稀释度设3个复孔，同时设立病毒对照和空白对照，在37℃含5% co2的培养箱内吸附2h；弃去人源化抗hadv
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b7单克隆中和抗体和表达egfp的hadv
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b7混合物，每孔补加100μl dmem/f
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12，在37℃
含5% co2培养箱内培养3天；通过计算单位浓度的中和比值，比较人源化抗hadv
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b7单克隆中和抗体与嵌合抗体的中和活性的强弱，计算公式如下：单位浓度中的中和比值=（病毒对荧光细胞比值
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样品荧光细胞比值）/样品浓度。
77.参见图1所示，本实施例成功表达和纯化人源化抗hadv
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b7单克隆中和抗体。
78.由表1结果显示：人源化抗hadv
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b7单克隆中和抗体单位浓度的中和比值高于嵌合抗体，单位浓度的中和比值越高，活性越强，鼠源抗体的人源化改造提高了抗体的中和活性。
79.表1为人源化抗hadv
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b7单克隆中和抗体与嵌合抗体的中和活性比较结果*为3个复孔的均值参见图2所述，人源化抗hadv
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b7单克隆中和抗体稀释4608倍后，浓度为0.03μg/ml，可抑制80%的细胞产生cpe。
80.综上所述，本发明的成功表达和纯化了人源化抗hadv
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b7单克隆中和抗体。人源化抗hadv
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b7单克隆中和抗体单位浓度的中和比值高于嵌合抗体，单位浓度的中和比值越高，活性越强，鼠源抗体的人源化改造提高了抗体的中和活性。人源化抗hadv
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b7单克隆中和抗体稀释4608倍后，浓度为0.03μg/ml，可抑制80%的细胞产生cpe。鼠源抗体的人源化改造，使原本的鼠源成分绝大部分被替换成人源成分，从而避免hama反应的发生，因此，本发明的人源化抗hadv
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b7单克隆中和抗体在使用上更加安全。
81.在上述实施例中，对各个实施例的描述都各有侧重，某个实施例中没有详述的部分，可以参见其他实施例的相关描述。
82.以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
83.以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。