一种靛苷的制备方法与流程

1.本发明涉及植物中活性物质的提取方法，具体涉及一种靛苷的制备方法。


背景技术：

2.靛苷(indoxyl
‑
β
‑
d
‑
glucoside，又称吲哚苷) 存在于菘蓝、木蓝、马蓝等叶子中，由吲哚和葡萄糖组成，是一种可溶于水的无色透明化合物，结构式如下：。
3.当菘蓝、木蓝、马蓝等植物的叶片受到破坏时，靛苷从细胞液泡中释放出来，经酶解反应水解成吲哚和葡萄糖；吲哚继而生成吲哚酚，吲哚酚在空气中发生自我氧化反应产生靛蓝，同时在碱性条件下吲哚酚会发生缩合发应形成靛蓝。因此靛苷是靛蓝生产的前体物质。此外靛苷对病毒、病原菌也有很强的抑制作用，是板蓝根等中药的重要成分。但是以目前板蓝根的萃取方法及条件，从板蓝根中提取的主要成分为靛蓝及靛玉红，靛苷并不是板蓝根相关药品的主要成分。
4.中国专利文献cn 101701028b（申请号 200910113500.5）公开了一种吲哚苷的制备方法，按下列步骤进行：a、将大青叶加8倍量的水提取3次，每次0.5小时，合并提取液，静置过夜，取上清液；b、加水稀释，用中空纤维膜在压力0.1mpa、室温进行超滤，重复3 次，合并超滤液，再用纳滤膜浓缩；c、将浓缩液用旋转蒸发器在70℃继续浓缩，加入大孔树脂中用水和乙醇进行梯度洗脱，收集乙醇洗脱液，回收乙醇浓缩至流浸膏，用50毫升蒸馏水稀释后以等量的乙醚萃取3次，分离出水层；所述的梯度洗脱为先用 水洗脱，然后再用浓度为20％的乙醇洗脱；所述的大孔树脂为ab
‑
8、x
‑
5、 dm301、dm130型的大孔树脂；d、加2倍的乙酸乙酯热回流5
‑
6小时，收集乙酸乙酯层，减压浓缩至 十分之一体积，室温下静置析晶，滤过，得到吲哚苷粗品；e、加热水溶解，趁热滤过，放冷析晶，反复5次，即可得到吲哚苷晶品，为灰白色无定型结晶粉末。


技术实现要素：

5.本发明所要解决的技术问题是提供一种提取成本低、产率高的靛苷的制备方法。
6.实现本发明目的的技术方案是一种靛苷的制备方法，包括以下步骤：
①
将含有靛苷的蓝草叶片在
‑
15℃～0℃的有机溶剂中浸泡10～30min，然后取出。
7.②
将水加热至80℃～100℃，将步骤
①
浸泡后的蓝草叶片加入热水中，在80℃～
100℃下浸取10～30min，浸取结束后固液分离去除叶片，得浸取液。
8.③
向步骤
②
得到的浸取液中投加新鲜的有机溶剂低温浸泡处理的蓝草叶片，在80℃～100℃下浸取10～30min，浸取结束后固液分离去除叶片，得靛苷浓度更高的浸取液。
9.④
重复步骤
③
的操作2～5次，得到高浓度的靛苷浸取液。
10.⑤
将步骤
④
得到的靛苷浸取液提纯得到靛苷纯品。
11.所述有机溶剂为甲醇、乙醇或丙酮。
12.所述含有靛苷的蓝草叶片为蓼蓝、菘蓝、木蓝或马蓝。
13.进一步的，步骤
②
中将水加热至90℃～100℃，步骤
②
、
③
、
④
中在90℃～100℃下浸取靛苷。
14.步骤
②
、
③
、
④
中，投加蓝草叶片时，每1l水中加入蓝草叶片10g～50g。
15.步骤
⑤
中，向步骤
④
得到的高浓度的靛苷浸取液中添加大孔树脂，然后收集吸附好的大孔树脂，分别用10%，30%，50%，75%的乙醇依次洗脱，收集洗脱液，将乙醇旋干后冷冻干燥，得到靛苷粉末。
16.本发明具有积极的效果：（1）本技术设置的提取条件，能够从含靛苷的植物中提取到以靛苷为主体的生物活性物质，本发明方法可推广至其它含靛苷的中草药中活性成分靛苷的提取，有利于提高相关中药资源的利用。
17.（2）在本发明的研发过程中，研究、发现、提出利用靛苷与葡萄糖苷酶的热稳定性的差异，先钝化酶活再将水温提前控制在80℃以上然后添加钝化处理后的蓝草叶片，成功采用水煮叶片的方式将靛苷从蓝草叶片中提取出来，在提取靛苷的同时有效抑制、破坏葡萄糖苷酶的活性，减少或避免副产物如吲哚酚的生成。
18.（3）为了避免添加叶片后水温剧烈变化导致副产物的大量生成，本发明用预冷的有机溶剂钝化酶活，在水温提前控制在80℃后少量添加蓝草叶片提取靛苷并固液分离，重复少量添加叶片提取并固液分离的步骤，最终得到含有高浓度靛苷的液体。
19.（4）本发明的制备方法步骤简单，对设备要求低，大大降低了靛苷的提取成本；最终提取得到的靛苷的产率达1.2% （g/g 叶湿重）以上。
附图说明
20.图1为实施例1制备的靛苷的hplc图谱。
21.图2为实施例2制备的靛苷的hplc图谱。
22.图3为靛苷标准品的hplc图谱。
23.图4为靛苷的标准曲线。
24.图5为乙醇钝化酶活实验。
25.图6为乙醇钝化后糖苷提取实验。
具体实施方式
26.（实施例1）本实施例的靛苷的制备方法包括以下步骤：
①
将有机溶剂冷却至
‑
15℃，将蓝草叶片浸没在有机溶剂中，浸泡30min后取出蓝
草叶片待处理。
27.所述有机溶剂是能够与水互溶的有机溶剂，例如甲醇、乙醇、丙酮等，本实施例中为乙醇。
28.②
将水加热至80℃～100℃（本实施例中将水加热至80℃），将步骤
①
浸泡后的蓝草叶片加入热水中，每1l水中加入蓝草叶片10g～50g（以新鲜蓝草叶片重量计算，本实施例中为50g）；在80℃下浸取10～30min（本实施例中浸取30min）。浸取结束后固液分离去除叶片，得浸取液。
29.所述蓝草叶片是含有靛苷的叶片，如蓼蓝、菘蓝、木蓝和马蓝等，本实施例中所述的蓝草叶片是蓼蓝。
30.③
向步骤
②
得到的浸取液中投加新鲜的有机溶剂低温浸泡处理的蓼蓝叶片，投加量同步骤
②
；在80℃下浸取10～30min（本实施例中浸取30min）。浸取结束后固液分离去除叶片，得靛苷浓度更高的浸取液。
31.④
重复步骤
③
的操作2～5次（本实施例中重复4次），得到高浓度的靛苷浸取液，待提纯处理。
32.⑤
将步骤
④
得到的靛苷浸取液，按1：10，1:5，1:3的比例添加预处理好的大孔树脂；例如对于50ml高浓度的靛苷浸取液，按1：10，1:5，1:3的比例添加预处理好的大孔树脂5、10、15g（湿重）。收集吸附好的大孔树脂，分别用10%，30%，50%，75%的乙醇依次洗脱，收集洗脱液，将乙醇旋干后冷冻干燥，得到靛苷粉末。
33.将本实施例得到的靛苷粉末进行hplc检测，hplc图谱见图1， 本实施例靛苷产率为1.28 % （g/g 叶湿重）。
34.（实施例2）本实施例的靛苷的制备方法其余与实施例1相同，不同之处在于：步骤
①
中使用的有机溶剂是甲醇，冷却至
‑
10℃，将蓝草叶片浸没在有机溶剂中，浸泡15min。
35.步骤
②
中将水加热至90℃。
36.步骤
②
中，向90℃水中投加蓝草叶片菘蓝，每1l水中加入蓝草叶片40g；蓝草叶片在90℃下浸取15min。
37.步骤
③
中，向步骤
②
得到的浸取液中投加新鲜的有机溶剂低温浸泡处理的菘蓝叶片，每1l水中加入蓝草叶片40g；在90℃下浸取15min。
38.步骤
④
中，重复步骤
③
的操作2次，得到高浓度的靛苷浸取液，待提纯处理。
39.将本实施例得到的靛苷粉末进行hplc检测，hplc图谱见图2， 本实施例靛苷产率为1.40 % （g/g 叶湿重）。
40.（试验例1、靛苷标准品的分析）hplc检测条件：c18柱，采用a相：水，b相：乙腈梯度洗脱；检测波长240 nm , 柱温30 ℃ , 进样量10ul。洗脱条件：80%a
‑
20%b 0
‑
15min 1ml/min。
41.在上述检测条件下，靛苷标准品的hplc图谱见图3，由图3可见，靛苷标准品在4.7min处有特征峰。
42.另外，靛苷标准曲线见图4，在靛苷浓度为0.02g/l至0.1g/l的范围内有非常好的
线性关系，r2=0.9984，说明在该条件下分析靛苷具有准确性。
43.（试验例2、热稳定性试验）一、蓝草叶片中的葡萄糖苷酶的热稳定性试验实验方法：取1g蓼蓝叶片，加入放有10 ml 预冷磷酸盐缓冲液(50 mm, ph 7.8)、1% (w/w)聚乙烯吡咯烷酮溶液20ml和少量石英砂的研钵中，冰浴条件下进行研磨。待研磨均匀后在8000rpm下离心10min，得到的上层酶液待测。分别在常温（23℃）、45℃、60℃、80℃条件下测定酶活标曲，同时测定上清液的酶活。
44.分析方法：向0.2 ml ph 5、0.5 m的醋酸缓冲液加入0.65 ml 水和0.05 ml待测酶液，在45 ℃下预热5 min，加入0.1 ml 10 mmol/l的pnpg
‑
glu溶液，在45 ℃下反应10 min，加入500 μl 、1 mol/l的 na2co
3 终止反应。每分钟产生1 μmol 对硝基苯酚定义为一个酶活力单位，即1 u。
45.对硝基苯酚标准曲线的制作：配制2 mm的对硝基苯酚溶液，分别取0、0.1、0.2、0.3、0.4和0.5 ml加入6个试管中，补加水至0.7 ml，加入0.2 ml ph 5、0.5 m的醋酸缓冲液，加入0.1 ml 10 mmol/l的pnpg
‑
glu溶液，最后加入500 μl 1 mol/l的 na2co3，在420 nm处测定其吸光度值。
46.酶活的定义：单位时间单位体积内产生1 μmol的对硝基苯酚所需酶量为一个酶活力。
47.n表示稀释倍数，v表示样品体积（ml），t表示反应时间（min）。
48.实验结果见下表：在室温条件下（23 ℃），葡萄糖苷酶活为650.3u；当温度上升到45℃时，酶活也随之上升到1024.5u。但是，随着温度的进一步上升，酶活呈下降趋势。在80℃时，酶活下降到76.1u。这个结果说明酶活最适温度在45℃左右，温度过高会破坏酶的活性，超过80℃基本失活。
49.二、靛苷的热稳定性试验实验方法：取靛苷标准品溶于10ml up水（超纯水）中配制成浓度为0.1g/l的靛苷溶液，取1ml待测。剩余溶液置于100℃的沸水中10min，取出后置于冰浴中迅速冷却，补足液体总体积为9ml，取1ml样品待测。
50.分析方法：c18柱，采用a相：水，b相：乙腈梯度洗脱；检测波长240 nm , 柱温30 ℃ , 进样量10ul。洗脱条件：80%a
‑
20%b 0
‑
15min 1ml/min。
51.实验结果：未水煮的靛苷溶液浓度为0.1g/l。
52.水煮10分钟后，靛苷的浓度为0.1g/l，含量没有变化，说明靛苷在100℃的条件下具有很好的稳定性。
53.（实施例5、酶活钝化实验）实验方法：取新鲜蓼蓝叶片1 g，在 100 ml、
‑
15℃、ph=2的60%乙醇溶液中浸泡30min，取出后将叶片置于研钵中的冰上，加入1 g pvp粉末，一定量ph=5的0.5 m醋酸缓冲液，在研钵中研磨至匀浆后取出，定容至20 ml；将混合液于4℃、8000 rpm条件下离心20 min，离心分离后取上清得到粗酶液。
54.取试管加入0.2 ml ph=5的0.5 m醋酸缓冲液，0.65 ml水以及0.05 ml待测酶液，在25℃下预热5 min，加入0.1 mol/l的pnpg
‑
glu溶液，在25℃下反应10 min，加入0.5 ml的1 mol/l的na2co3溶液终止反应，于420 nm处测定吸光值，计算得出β
‑
葡萄糖苷酶酶活。
55.另取新鲜叶片1g，不进行低温乙醇预冷处理，直接进行同样操作测定酶活作为对照，比较两者酶活差异。
56.分析方法：向0.2 ml ph=5的0.5 m的醋酸缓冲液加入0.65 ml 水和0.05 ml待测酶液，在45 ℃下预热5 min，加入0.1 ml 10 mmol/l的pnpg
‑
glu溶液，在45 ℃下反应10 min，加入500 μl 、1 mol/l的 na2co
3 终止反应。每分钟产生1 μmol 对硝基苯酚定义为一个酶活力单位，即1 u。
57.实验结果：如图5所示，未经处理的叶片的酶活超过了600u/g。而经过乙醇预冷处理的叶片的酶活下降至30u/g一下。说明乙醇预冷能够有效钝化酶活。
[0058] （实施例6、乙醇钝化后糖苷提取实验）实验方法：取新鲜叶片5 g*2，在100 ml、
‑
15℃、ph=2的60 %乙醇溶液中浸泡30min，将两组叶片分别加入沸水中预热5 min的100 ml水与60%乙醇溶液中，水煮10 min后冷却，测定上清糖苷、吲哚酚含量。
[0059]
另取新鲜叶5 g，加入沸水中预热5 min的100 ml水中，水煮10 min后冷却，测定上清糖苷、吲哚酚含量。
[0060]
分析方法：c18柱，采用a相：水，b相：乙腈梯度洗脱；检测波长240 nm , 柱温30 ℃ , 进样量10ul。洗脱条件：80%a
‑
20%b 0
‑
15min 1ml/min。
[0061]
实验结果：如图6所示，对照组在水煮过程就已产生了一定量的吲哚酚。这是叶片升温过程中β葡萄糖苷酶失活较慢照成的。而经过乙醇预冷处理后不论是利用水或者乙醇提取靛苷，吲哚酚的产率都非常低，从而靛苷的产率得到了很大提升，证明了酶活的钝化效果。