一种环状小非编码rna的测序文库构建方法和应用
技术领域
1.本发明涉及一种环状小非编码rna的测序文库构建方法和应用，属于分子生物学技术领域。
背景技术：
2.人类基因组中,70％左右的序列能够转录为rna,但多数不能被翻译成蛋白，这些非编码rna(noncoding rna,ncrna)根据长度分为长非编码rna(>200nt,long noncoding rna,lncrna)和小非编码rna(<200nt,small non
‑
coding rna，sncrna)。
3.环状rna(ciucular rna,circrna)是一种区别于传统线性rna的rna家族新成员，其为不具有5’末端帽子和3’末端poly(a)尾巴且以共价键形成环形结构的非编码rna分子。
4.基于联合探针锚定连接测序技术(combinatorial probe
‑
anchor ligation，cpal)的高通量测序平台是一种新型的高通量测序平台，该平台测序需要的文库是一种带有接头序列的单链环状分子，通过对这种环状分子进行滚环复制，形成缠绕折叠的线性dna纳米球(dna nanoball，dnb)。控制滚环复制的时间就可以控制dnb的大小，也就是相同的复制时间获得的dnb大小是一样的，把这些相同大小的dnb通过重力作用，就可以使之均匀的平铺在芯片上，这样测序时获得的dnb的信号就是均一的，从而提高了测序的准确率。
5.目前基于cpal的高通量测序平台还没有相应的环状小非编码rna文库的构建方法，为解决这一问题，本发明开发了一种高效、稳定地构建用于环状小非编码rna高通量的测序文库的方法，并使这种文库能用cpal方法测序的技术。
技术实现要素：
6.本发明所要解决的技术问题是提供一种环状小非编码rna的测序文库构建方法和应用，能够高效、稳定地构建环状小非编码rna的测序文库，该方法rrna残留比例低，数据重复性较好，且该方法尤其适用于联合探针锚定连接测序技术。
7.本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种环状小非编码rna的测序文库构建方法，包括以下步骤：(1)细胞培养；(2)提取细胞中的总rna；(3)使用小rna提取试剂盒提取rna，去除28s和18s rrna；(4)通过rap方法进一步去除5s和5.8s rrna；(5)去除线性rna；(6)构建环状小非编码rna的测序文库。
8.本发明的有益效果是：采用本发明的方法构建的环状小非编码rna的测序文库，rrna残留少，环状rna检出效率高，测序通量高，数据重复性较好，测序结果验证成功率高。整个方法操作简便，耗财耗时少且稳定性高，可重复性和可靠性都非常好。
9.在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
10.进一步，所述步骤(1)中，细胞在37℃、5％v/v co2的细胞培养箱中培养，培养基为dmem加10％v/v胎牛血清和1％v/v双抗，当细胞生长密度达到65％
‑
85％时，收集细胞。
11.采用上述进一步方案的有益效果是先进行细胞的培养，可以扩大总rna的量，前期的细胞培养很有必要，能够保证总rna的量足够，而且提前富集rna也有利于后续各个步骤
对于不同rna的分离。
12.进一步，所述细胞为体细胞、生殖细胞、胚胎细胞、干细胞、肿瘤细胞中的一种。
13.进一步，所述细胞为hek293细胞。hek293细胞，又叫人胚胎肾细胞293，是一个衍生自人胚胎肾细胞的细胞系，具有转染效率高，易于培养等特点。
14.进一步，所述步骤(2)中，采用trizol法提取细胞中的总rna。
15.采用上述进一步方案的有益效果是trizol法在破碎和溶解细胞时能保持rna的完整性，因此有利于纯化rna及标准化rna的生产，本发明采用此方法可以快速方便的提取细胞中的总rna。
16.进一步，所述步骤(4)中，将sncrna与生物素标记的5s、5.8s dna探针混合，70℃变性5min，冰浴1
‑
2min，然后置于37℃的分子杂交炉中杂交10
‑
15min，使sncrna中的5s、5.8s rrna通过碱基配对与5s、5.8s dna探针充分结合，再加入链霉亲和素磁珠37℃继续杂交15
‑
20min，借助磁力架收集上清，再用脱氧核糖核酸酶处理，降解残余的dna探针，即得到去除5s、5.8s rrna的sncrna溶液。
17.真核生物的rrna分四类：5srrna、5.8srrna、18srrna和28srrna。哺乳动物的核糖体rna(28s,18s,5.8s,5s)在总rna中丰度较高，如果不提前富集rna,除去rrna,这将会对后续sncrna文库构建造成很大干扰。使用foregene小rna提取试剂盒提取的sncrna虽然去除了28s、18s rrna等大片段rna，得到了质量较高的sncrna,但依然存在大量5.8s和5s小分子rrna，所以需要通过rap(rna antisense purification)方法，进一步去除5s、5.8s rrna，qpcr检测结果显示，5s、5.8s rrna去除效率可以达到99％以上，效果显著，进一步富集了sncrna，提高了建库起始sncrna的质量。
18.采用上述进一步方案的有益效果是总rna中还有70％以上的rrna，这些需要去除，本发明采用两步法去除，先利用小rna提取试剂盒这种成熟的产品直接去除较大的rrna，再利用rap方法进一步去除小分子rrna，通过这两个步骤，能够基本上去除绝大多数的rrna，而留下ncrna。两个步骤互相配合，缺一不可，前后进行处理，才能保证得到的sncrna中基本上不含rrna。
19.进一步，所述步骤(5)中，采用rnase r消化法去除线性rna。
20.采用上述进一步方案的有益效果是通过前面的处理，去除了rrna，最后用rnase r消化法去除线性rna，最终即可得到sncrna。
21.进一步，所述rnase r消化法的rnase r与rna的用量比为(2
‑
4)u:1ug(即每1微克rna中加入2
‑
4个活性单位u的rnase r)，消化条件为37℃下消化30
‑
35min。
22.进一步，所述步骤(6)中，采用dutp法构建环状小非编码rna的测序文库。
23.采用上述进一步方案的有益效果是基于去线性rna后得到的环状sncrna，可以采用本领域中的各种合理方法构建测序文库，其中优选为采用dutp法构建环状小非编码rna的测序文库。
24.本发明还涉及一种所述环状小非编码rna的测序文库构建方法的应用，用于联合探针锚定连接测序技术。
25.本发明的环状小非编码rna的测序文库构建方法构建出的文库，其质量非常高，使之能用于cpal原理测序平台，所得到的数据准确度高、可信度佳，对信息分析没有影响。
具体实施方式
26.以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
27.下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
28.1.材料
29.人胚肾上皮细胞hek293购于美国atcc(american type cul
‑
ture collection),本实验保存。
30.2.主要试剂
31.细胞培养基dmem、胎牛血清(fbs)、脱氧核糖核酸酶(dnase i)购于thermo公司(上海),小rna提取试剂盒、pcr产物纯化试剂盒购于foregene公司(成都),生物素标记的5s、5.8s dna探针合成于金唯智公司(苏州),其它化学试剂均为国产分析纯。
32.3.方法
33.(1)细胞培养：细胞在37℃、5％v/v co2的细胞培养箱中培养，培养基为dmem加10％v/v胎牛血清和1％v/v双抗(青霉素和链霉素)，当细胞生长密度达到65％
‑
85％时，收集细胞。
34.(2)提取细胞中的总rna：将收集到的细胞在4℃下用pbs洗一次，然后向6孔板每个孔中加入1ml trizol，并用1ml枪头反复吹打10次。将样品收集到ep管内，加入200μl氯仿，上下颠倒混匀30s后静置3min。随后再在4℃的温度和12000rpm的转速下离心15min，溶液裂解液分三层，其中上层为溶于水相的rna。取上层溶液并向其中加入等体积的异丙醇，混匀并4℃静置10min。之后再次在4℃的温度和12000rpm的转速下离心10min并移除上清液。随后在沉淀中加入1ml 75％(v/v)乙醇并上下颠倒混匀重悬沉淀。然后还在4℃的温度和12000rpm的转速下离心10min并移除上清，保留沉淀。然后将沉淀在室温下干燥15min直至管壁无液体。随后加入25μldepc h2o溶解rna，以获得总rna溶液。
35.(3)使用小rna提取试剂盒提取rna：根据说明书进行操作，用foregene小rna提取试剂盒提取hek293的sncrna,通过紫外分光光度计测量和琼脂糖凝胶电泳检测其质量。此步骤可以去除28s和18s rrna。
36.(4)利用rap(rna antisense purification)富集sncrna：将sncrna与生物素标记的5s、5.8s dna探针混合，70℃变性5min，冰浴1
‑
2min，然后置于37℃的分子杂交炉中杂交10
‑
15min，使sncrna中的5s、5.8s rrna通过碱基配对与5s、5.8s dna探针充分结合，再加入链霉亲和素磁珠(m
‑
270)37℃继续杂交15
‑
20min，借助磁力架收集上清，再用脱氧核糖核酸酶(dnase i)处理，降解残余的dna探针，即得到去除5s、5.8s rrna的sncrna溶液。rrna的去除效率通过qpcr检测。
37.5s、5.8s dna探针的序列(5
’‑3’
)如下：5s
‑
f，gtctacggccataccaccctgaa；5s
‑
r，aagcctacagcacccggtattcc；5.8s
‑
f，tagcggtggatcactcggctc；5.8s
‑
r，cgacgctcagacaggcgtagc。
38.取样检测sncrna溶液中rrna的含量，发现其含量低于0.01％，而现有技术rrna的含量通常在0.1％
‑
0.5％，由此可见，本发明的rrna去除效果更好，能使后面构建的文库有
效测序数据量显著提高。
39.(5)去除线性rna：配制如下所示的实验体系：sncrna溶液，11μl；10xrnase r buffer，1.4μl；rnase r(3u/ul)，1μl；rnase
‑
free h2o，0.6μl。将上述体系置于37℃水浴中消化30
‑
35min，获得线性rna去除的环状sncrna。
40.(6)采用dutp法构建环状小非编码rna的测序文库：按照目前常用的dutp法执行即可，其一般包括以下步骤：
41.a)rna片段化；在90
‑
96℃，优选94℃的温度下片段化3
‑
6分钟，优选5分钟；rna片段化后的峰值位于300
‑
350bp；
42.b)第一链合成:采用逆转录酶加随机引物的方法进行；第一链合成利用放线菌素d抑制逆转录酶的依赖dna的dna聚合酶活性，以保留链的方向性信息；
43.c)第二链合成:利用rnase h消化rna/cdna杂交物中的rna链,然后通过dna聚合酶i合成第二条链；
44.d)末端修复:利用end repair mix形成平末端的dsdna并在5’端加上磷酸基团；
45.e)加a尾:利用朋klenow 3
’‑5’
exo
‑
在dsdna末端加a尾；
46.f)y型adapter连接:利用t4 dna ligase连接adapter和加了a尾的dsdna；y型adapter连接中adapter末端采用硫代磷酸酯键连接t，以防止形成adapter二聚体，进一步优选地，连接产物纯化采用1
×
beads纯化一次后，0.7
×
/0.2
×
beads进行片段大小筛选，以选择合适的大小的片段；
47.g)第二链消化和文库扩增:利用ung酶消化第二链；
48.h)质检及准备标引文库：先检测文库浓度，再采用agilent 2100检测文库质量，最后根据文库浓度，将不同的标引文库混合，准备上机测序。
49.与现有的环状小非编码rna测序文库构建方法相比，采用本发明的方法构建的环状小非编码rna的测序文库，rrna残留少，环状rna检出效率高，测序通量高，数据重复性较好，测序结果验证成功率高。整个方法操作简便，耗财耗时少且稳定性高，可重复性和可靠性都非常好。
50.4、结果
51.文库上机测序，测序使用cpal测序平台台(型号为blackbird)进行测序。
52.对测序所产生的数据，用cpal测序平台自带的程序teramap进行信息分析，主要以下步骤：
53.(1)过滤测序序列；
54.过滤不合格序列包括:序列中测序结果不确定的碱基(如cpal测序平台测序结果中的n)个数超过整条序列碱基个数的10％则认为是不合格序列；除样本接头序列外，与其它实验引入的外源序列比对,如各种接头序列。若序列中存在外源序列则认为是不合格序列。原始的序列数据经过去除不合格序列处理后得到的序列数据我们称为干净的序列片段(clean reads),作为后续分析的基础。
55.(2)干净的序列片段与参考序列比对；
56.将高通量测序技术得到的干净的序列片段分别比对到参考基因组和参考基因序列上。参考基因组序列和参考基因序列可取于公共数据库genebank和mirbase。
57.在此基础上，本发明还进行了不同来源的的hek293细胞，以及其他细胞的对比实
验，其构建出的文坤也可用于cpal原理测序平台，所得到的数据准确度高、可信度佳，对信息分析没有影响。
58.5、总结
59.通常构建这类分子量小的非编码rna文库会遇到的问题是如何提取目的rna并富集纯化，关键是去除rrna。使用foregene公司小rna提取试剂盒,有效的去除了28s、18s等大片段rrna，再使用rap技术,通过与5.8s、5s rrna特异性互补的dna探针,5s、5.8s rrna去除率可达99％以上,进一步纯化富集了sncrna，两种方式的互相结合，可以使rrna含量低于0.01％,从而得到起始质量更高的sncrna，提升文库的质量，使之能用于联合探针锚定连接测序技术(cpal)。
60.尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
技术领域
1.本发明涉及一种环状小非编码rna的测序文库构建方法和应用，属于分子生物学技术领域。
背景技术：
2.人类基因组中,70％左右的序列能够转录为rna,但多数不能被翻译成蛋白，这些非编码rna(noncoding rna,ncrna)根据长度分为长非编码rna(>200nt,long noncoding rna,lncrna)和小非编码rna(<200nt,small non
‑
coding rna，sncrna)。
3.环状rna(ciucular rna,circrna)是一种区别于传统线性rna的rna家族新成员，其为不具有5’末端帽子和3’末端poly(a)尾巴且以共价键形成环形结构的非编码rna分子。
4.基于联合探针锚定连接测序技术(combinatorial probe
‑
anchor ligation，cpal)的高通量测序平台是一种新型的高通量测序平台，该平台测序需要的文库是一种带有接头序列的单链环状分子，通过对这种环状分子进行滚环复制，形成缠绕折叠的线性dna纳米球(dna nanoball，dnb)。控制滚环复制的时间就可以控制dnb的大小，也就是相同的复制时间获得的dnb大小是一样的，把这些相同大小的dnb通过重力作用，就可以使之均匀的平铺在芯片上，这样测序时获得的dnb的信号就是均一的，从而提高了测序的准确率。
5.目前基于cpal的高通量测序平台还没有相应的环状小非编码rna文库的构建方法，为解决这一问题，本发明开发了一种高效、稳定地构建用于环状小非编码rna高通量的测序文库的方法，并使这种文库能用cpal方法测序的技术。
技术实现要素：
6.本发明所要解决的技术问题是提供一种环状小非编码rna的测序文库构建方法和应用，能够高效、稳定地构建环状小非编码rna的测序文库，该方法rrna残留比例低，数据重复性较好，且该方法尤其适用于联合探针锚定连接测序技术。
7.本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种环状小非编码rna的测序文库构建方法，包括以下步骤：(1)细胞培养；(2)提取细胞中的总rna；(3)使用小rna提取试剂盒提取rna，去除28s和18s rrna；(4)通过rap方法进一步去除5s和5.8s rrna；(5)去除线性rna；(6)构建环状小非编码rna的测序文库。
8.本发明的有益效果是：采用本发明的方法构建的环状小非编码rna的测序文库，rrna残留少，环状rna检出效率高，测序通量高，数据重复性较好，测序结果验证成功率高。整个方法操作简便，耗财耗时少且稳定性高，可重复性和可靠性都非常好。
9.在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
10.进一步，所述步骤(1)中，细胞在37℃、5％v/v co2的细胞培养箱中培养，培养基为dmem加10％v/v胎牛血清和1％v/v双抗，当细胞生长密度达到65％
‑
85％时，收集细胞。
11.采用上述进一步方案的有益效果是先进行细胞的培养，可以扩大总rna的量，前期的细胞培养很有必要，能够保证总rna的量足够，而且提前富集rna也有利于后续各个步骤
对于不同rna的分离。
12.进一步，所述细胞为体细胞、生殖细胞、胚胎细胞、干细胞、肿瘤细胞中的一种。
13.进一步，所述细胞为hek293细胞。hek293细胞，又叫人胚胎肾细胞293，是一个衍生自人胚胎肾细胞的细胞系，具有转染效率高，易于培养等特点。
14.进一步，所述步骤(2)中，采用trizol法提取细胞中的总rna。
15.采用上述进一步方案的有益效果是trizol法在破碎和溶解细胞时能保持rna的完整性，因此有利于纯化rna及标准化rna的生产，本发明采用此方法可以快速方便的提取细胞中的总rna。
16.进一步，所述步骤(4)中，将sncrna与生物素标记的5s、5.8s dna探针混合，70℃变性5min，冰浴1
‑
2min，然后置于37℃的分子杂交炉中杂交10
‑
15min，使sncrna中的5s、5.8s rrna通过碱基配对与5s、5.8s dna探针充分结合，再加入链霉亲和素磁珠37℃继续杂交15
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20min，借助磁力架收集上清，再用脱氧核糖核酸酶处理，降解残余的dna探针，即得到去除5s、5.8s rrna的sncrna溶液。
17.真核生物的rrna分四类：5srrna、5.8srrna、18srrna和28srrna。哺乳动物的核糖体rna(28s,18s,5.8s,5s)在总rna中丰度较高，如果不提前富集rna,除去rrna,这将会对后续sncrna文库构建造成很大干扰。使用foregene小rna提取试剂盒提取的sncrna虽然去除了28s、18s rrna等大片段rna，得到了质量较高的sncrna,但依然存在大量5.8s和5s小分子rrna，所以需要通过rap(rna antisense purification)方法，进一步去除5s、5.8s rrna，qpcr检测结果显示，5s、5.8s rrna去除效率可以达到99％以上，效果显著，进一步富集了sncrna，提高了建库起始sncrna的质量。
18.采用上述进一步方案的有益效果是总rna中还有70％以上的rrna，这些需要去除，本发明采用两步法去除，先利用小rna提取试剂盒这种成熟的产品直接去除较大的rrna，再利用rap方法进一步去除小分子rrna，通过这两个步骤，能够基本上去除绝大多数的rrna，而留下ncrna。两个步骤互相配合，缺一不可，前后进行处理，才能保证得到的sncrna中基本上不含rrna。
19.进一步，所述步骤(5)中，采用rnase r消化法去除线性rna。
20.采用上述进一步方案的有益效果是通过前面的处理，去除了rrna，最后用rnase r消化法去除线性rna，最终即可得到sncrna。
21.进一步，所述rnase r消化法的rnase r与rna的用量比为(2
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4)u:1ug(即每1微克rna中加入2
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4个活性单位u的rnase r)，消化条件为37℃下消化30
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35min。
22.进一步，所述步骤(6)中，采用dutp法构建环状小非编码rna的测序文库。
23.采用上述进一步方案的有益效果是基于去线性rna后得到的环状sncrna，可以采用本领域中的各种合理方法构建测序文库，其中优选为采用dutp法构建环状小非编码rna的测序文库。
24.本发明还涉及一种所述环状小非编码rna的测序文库构建方法的应用，用于联合探针锚定连接测序技术。
25.本发明的环状小非编码rna的测序文库构建方法构建出的文库，其质量非常高，使之能用于cpal原理测序平台，所得到的数据准确度高、可信度佳，对信息分析没有影响。
具体实施方式
26.以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
27.下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
28.1.材料
29.人胚肾上皮细胞hek293购于美国atcc(american type cul
‑
ture collection),本实验保存。
30.2.主要试剂
31.细胞培养基dmem、胎牛血清(fbs)、脱氧核糖核酸酶(dnase i)购于thermo公司(上海),小rna提取试剂盒、pcr产物纯化试剂盒购于foregene公司(成都),生物素标记的5s、5.8s dna探针合成于金唯智公司(苏州),其它化学试剂均为国产分析纯。
32.3.方法
33.(1)细胞培养：细胞在37℃、5％v/v co2的细胞培养箱中培养，培养基为dmem加10％v/v胎牛血清和1％v/v双抗(青霉素和链霉素)，当细胞生长密度达到65％
‑
85％时，收集细胞。
34.(2)提取细胞中的总rna：将收集到的细胞在4℃下用pbs洗一次，然后向6孔板每个孔中加入1ml trizol，并用1ml枪头反复吹打10次。将样品收集到ep管内，加入200μl氯仿，上下颠倒混匀30s后静置3min。随后再在4℃的温度和12000rpm的转速下离心15min，溶液裂解液分三层，其中上层为溶于水相的rna。取上层溶液并向其中加入等体积的异丙醇，混匀并4℃静置10min。之后再次在4℃的温度和12000rpm的转速下离心10min并移除上清液。随后在沉淀中加入1ml 75％(v/v)乙醇并上下颠倒混匀重悬沉淀。然后还在4℃的温度和12000rpm的转速下离心10min并移除上清，保留沉淀。然后将沉淀在室温下干燥15min直至管壁无液体。随后加入25μldepc h2o溶解rna，以获得总rna溶液。
35.(3)使用小rna提取试剂盒提取rna：根据说明书进行操作，用foregene小rna提取试剂盒提取hek293的sncrna,通过紫外分光光度计测量和琼脂糖凝胶电泳检测其质量。此步骤可以去除28s和18s rrna。
36.(4)利用rap(rna antisense purification)富集sncrna：将sncrna与生物素标记的5s、5.8s dna探针混合，70℃变性5min，冰浴1
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2min，然后置于37℃的分子杂交炉中杂交10
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15min，使sncrna中的5s、5.8s rrna通过碱基配对与5s、5.8s dna探针充分结合，再加入链霉亲和素磁珠(m
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270)37℃继续杂交15
‑
20min，借助磁力架收集上清，再用脱氧核糖核酸酶(dnase i)处理，降解残余的dna探针，即得到去除5s、5.8s rrna的sncrna溶液。rrna的去除效率通过qpcr检测。
37.5s、5.8s dna探针的序列(5
’‑3’
)如下：5s
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f，gtctacggccataccaccctgaa；5s
‑
r，aagcctacagcacccggtattcc；5.8s
‑
f，tagcggtggatcactcggctc；5.8s
‑
r，cgacgctcagacaggcgtagc。
38.取样检测sncrna溶液中rrna的含量，发现其含量低于0.01％，而现有技术rrna的含量通常在0.1％
‑
0.5％，由此可见，本发明的rrna去除效果更好，能使后面构建的文库有
效测序数据量显著提高。
39.(5)去除线性rna：配制如下所示的实验体系：sncrna溶液，11μl；10xrnase r buffer，1.4μl；rnase r(3u/ul)，1μl；rnase
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free h2o，0.6μl。将上述体系置于37℃水浴中消化30
‑
35min，获得线性rna去除的环状sncrna。
40.(6)采用dutp法构建环状小非编码rna的测序文库：按照目前常用的dutp法执行即可，其一般包括以下步骤：
41.a)rna片段化；在90
‑
96℃，优选94℃的温度下片段化3
‑
6分钟，优选5分钟；rna片段化后的峰值位于300
‑
350bp；
42.b)第一链合成:采用逆转录酶加随机引物的方法进行；第一链合成利用放线菌素d抑制逆转录酶的依赖dna的dna聚合酶活性，以保留链的方向性信息；
43.c)第二链合成:利用rnase h消化rna/cdna杂交物中的rna链,然后通过dna聚合酶i合成第二条链；
44.d)末端修复:利用end repair mix形成平末端的dsdna并在5’端加上磷酸基团；
45.e)加a尾:利用朋klenow 3
’‑5’
exo
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在dsdna末端加a尾；
46.f)y型adapter连接:利用t4 dna ligase连接adapter和加了a尾的dsdna；y型adapter连接中adapter末端采用硫代磷酸酯键连接t，以防止形成adapter二聚体，进一步优选地，连接产物纯化采用1
×
beads纯化一次后，0.7
×
/0.2
×
beads进行片段大小筛选，以选择合适的大小的片段；
47.g)第二链消化和文库扩增:利用ung酶消化第二链；
48.h)质检及准备标引文库：先检测文库浓度，再采用agilent 2100检测文库质量，最后根据文库浓度，将不同的标引文库混合，准备上机测序。
49.与现有的环状小非编码rna测序文库构建方法相比，采用本发明的方法构建的环状小非编码rna的测序文库，rrna残留少，环状rna检出效率高，测序通量高，数据重复性较好，测序结果验证成功率高。整个方法操作简便，耗财耗时少且稳定性高，可重复性和可靠性都非常好。
50.4、结果
51.文库上机测序，测序使用cpal测序平台台(型号为blackbird)进行测序。
52.对测序所产生的数据，用cpal测序平台自带的程序teramap进行信息分析，主要以下步骤：
53.(1)过滤测序序列；
54.过滤不合格序列包括:序列中测序结果不确定的碱基(如cpal测序平台测序结果中的n)个数超过整条序列碱基个数的10％则认为是不合格序列；除样本接头序列外，与其它实验引入的外源序列比对,如各种接头序列。若序列中存在外源序列则认为是不合格序列。原始的序列数据经过去除不合格序列处理后得到的序列数据我们称为干净的序列片段(clean reads),作为后续分析的基础。
55.(2)干净的序列片段与参考序列比对；
56.将高通量测序技术得到的干净的序列片段分别比对到参考基因组和参考基因序列上。参考基因组序列和参考基因序列可取于公共数据库genebank和mirbase。
57.在此基础上，本发明还进行了不同来源的的hek293细胞，以及其他细胞的对比实
验，其构建出的文坤也可用于cpal原理测序平台，所得到的数据准确度高、可信度佳，对信息分析没有影响。
58.5、总结
59.通常构建这类分子量小的非编码rna文库会遇到的问题是如何提取目的rna并富集纯化，关键是去除rrna。使用foregene公司小rna提取试剂盒,有效的去除了28s、18s等大片段rrna，再使用rap技术,通过与5.8s、5s rrna特异性互补的dna探针,5s、5.8s rrna去除率可达99％以上,进一步纯化富集了sncrna，两种方式的互相结合，可以使rrna含量低于0.01％,从而得到起始质量更高的sncrna，提升文库的质量，使之能用于联合探针锚定连接测序技术(cpal)。
60.尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
再多了解一些
本文用于企业家、创业者技术爱好者查询，结果仅供参考。
