一种des-pGlubrazzein三位点突变体结构基因和生产甜蛋白的方法与流程

一种des
‑
pglu brazzein三位点突变体结构基因和生产甜蛋白的方法
技术领域
1.本发明涉及生物工程技术领域，具体而言，涉及一种des
‑
pglu brazzein三位点突变体结构基因、表达载体、生产甜蛋白的方法及应用。


背景技术：

2.长期大量摄入糖类会导致代谢紊乱，引起肥胖、糖尿病、高血压和心脏病等等，在很多国家已经成为一大社会问题，严重威胁着人类生命健康。因此，目前在全球范围内，对具有良好口味特性的、天然的、无热量的甜味剂的需求一直在增加。而甜蛋白质的大规模生产并应用是有效的解决方案之一，因为摄入这些本质是蛋白质的甜味剂不会对身体健康产生不利的影响。brazzein是目前已发现的八种植物源甜味蛋白质之一，是蔗糖和人造甜味剂等最有前途的替代品之一，也是目前学术研究和食品工业中较为合适的模型蛋白质。
3.天然brazzein是从西非植物pentadiplandra brazzeana baillon的成熟果实中分离出来的，是目前发现的最小的甜味蛋白质。天然brazzein有两种形态：主形态pglu brazzein由54个氨基酸的单链(6.5kda)和n端的焦谷氨酸(pglu)组成，按摩尔计算比蔗糖甜约9,500倍；次要形态des
‑
pglu brazzein的n端没有pglu，比含pglu的主形态甜约两倍。brazzein的味道纯甜，没有酸、咸或苦味，其水溶性至少为50mg/ml，即>7.7mm。并且在ph 2.5
‑
8范围内于98℃下孵育2小时或在80℃下孵育4.5小时后，其甜味仍然存在，具有出色的热稳定性和酸碱耐受性。
4.由于brazzein出色的热稳定性和酸碱耐受性，研究者们对其突变体的研究主要集中在如何提高其甜度上。目前已有多个位点突变的报道，这些突变确定了brazzein中的许多残基在与甜味受体的相互作用的过程中很重要。刘波等人报道了在大肠杆菌中表达的des
‑
pglu brazzein的甜度阈值约为1.5μg/ml。joo
‑
won lee等人报道了大肠杆菌中pglu brazzein的三位点突变体(h31r/e36d/e41a)的表达，其甜度阈值约为0.889μg/ml。
5.brazzein很难从其天然来源中大量地获得，因此大规模的brazzein生产需要通过基因工程在生物反应器中表达。目前已有各种重组表达系统表达brazzein的报道，包括细菌、酵母、转基因植物和转基因小鼠。相对于其他生物反应器，转基因动物乳腺生物反应器具有巨大的潜力，并且已经成功用于表达植物来源的蛋白质，如奇异果甜蛋白、野生型brazzein和d12脂肪酸去饱和酶，这表明植物蛋白可以在哺乳动物细胞中表达。
6.目前尚未有用转基因动物乳腺生物反应器表达brazzein相关突变体的报道。因此，如果能将brazzein相关突变体用转基因动物乳腺生物反应器表达，将为推进植物源甜味蛋白质的工业化生产提供极大的帮助。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于提供一种des
‑
pglu brazzein三位点突变体结构基因、表达载体、生产甜蛋白的方法及应用，所构建的des
‑
pglu brazzein三位点突变体结构基因可以在
泌乳期的转基因小鼠乳腺细胞中稳定表达并分泌至乳汁中，此方法的构建过程快速简单，诱导条件容易控制，并且甜度远远高于前期研究中获得的野生型des
‑
pglu brazzein转基因小鼠的乳汁，后续无需进行重组蛋白分离纯化，生产成本低，能够大量生产。
8.本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。
9.第一方面，本技术实施例提供一种des
‑
pglu brazzein三位点突变体结构基因，所述des
‑
pglu brazzein三位点突变体的cdna序列如seq id no.1所示。
10.第二方面，本技术实施例提供一种表达载体，所述表达载体为将前述des
‑
pglu brazzein三位点突变体克隆至乳腺特异性表达载体pbc1，得到表达载体pbc1
‑
des
‑
pglu
‑
brazzein。
11.第三方面，本技术实施例提供一种前述的des
‑
pglu brazzein三位点突变体结构基因生产甜蛋白的方法，包括以下步骤，
12.(1)合成des
‑
pglu brazzein三位点突变体结构基因；
13.(2)将步骤(1)得到的des
‑
pglu brazzein三位点突变体结构基因克隆乳腺特异性表达载体pbc1，得到表达载体pbc1
‑
des
‑
pglu
‑
brazzein；
14.(3)将步骤(2)合成的pbc1
‑
des
‑
pglu brazzein酶切，得到载体真核部分；
15.(4)将步骤(3)得到的载体真核部分注射入受精卵，再将受精卵转入受体动物，分娩后得到模型动物；
16.(5)收集模型动物的乳汁，得到brazzein甜蛋白。
17.第四方面，本技术实施例提供一种检测前述表达载体的引物，包括pb
‑
s和pb
‑
a，所述pb
‑
s的序列如seq id no.4所示，所述pb
‑
a的序列如seq id no.5所示。
18.第五方面，本技术实施例提供一种前述的des
‑
pglu brazzein三位点突变体结构基因在生产brazzein甜蛋白中的应用。
19.第六方面，本技术实施例提供一种前述的表达载体在生产brazzein甜蛋白中的应用。
20.相对于现有技术，本发明的实施例至少具有如下优点或有益效果：
21.本发明提供的des
‑
pglu brazzein三位点突变体结构基因，通过将山羊β
‑
乳球蛋白的信号肽编码序列与des
‑
pglu brazzein三位点突变体(h31r/e36d/e41a)成熟肽编码序列拼接，再进行密码子优化，使其适合在小鼠细胞内稳定表达。本发明提供包含des
‑
pglu brazzein三位点突变体结构基因的表达载体，该表达载体pbc1
‑
des
‑
pglu
‑
brazzein为乳腺特异性表达载体，可在泌乳期的乳腺细胞中特异性地表达brazzein并分泌至乳汁中。本发明提供的利用des
‑
pglu brazzein三位点突变体结构基因生产甜蛋白的方法，此方法的构建过程快速简单，诱导条件容易控制，其产物的活性和甜味高度类似于天然产物，并且甜度远远高于前期研究中获得的野生型des
‑
pglu brazzein转基因小鼠的乳汁，其热稳定性无明显变化，后续无需进行重组蛋白分离纯化，可简单处理后直接使用，生产成本低，能够大量生产。
附图说明
22.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对
范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
23.图1为本发明实施例pbc1
‑
des
‑
pglu brazzein构建图；
24.图2为本发明实施例转基因小鼠中des
‑
pglu brazzein三位点突变体基因的鉴定；
25.图3为本发明实施例western blot检测转基因小鼠乳汁中brazzein的表达；
26.图4为本发明实施例重组brazzein的甜度测试。
具体实施方式
27.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
28.需要说明的是，在不冲突的情况下，本技术中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考具体实施例来详细说明本发明。
29.第一方面，本技术实施例提供一种des
‑
pglu brazzein三位点突变体结构基因，所述des
‑
pglu brazzein三位点突变体的cdna序列如seq id no.1所示。
30.在本发明的一些实施例中，上述des
‑
pglu brazzein三位点突变体结构基因，所述des
‑
pglu brazzein三位点突变体的cdna序列的5’端依次拼接有xho i酶切位点和kozak序列，所述所述des
‑
pglu brazzein三位点突变体的cdna序列的3’端拼接有xho i酶切位点，如seq id no.2所示。
31.第二方面，本技术实施例提供一种表达载体，所述表达载体为将前述des
‑
pglu brazzein三位点突变体克隆至乳腺特异性表达载体pbc1，得到表达载体pbc1
‑
des
‑
pglu
‑
brazzein。
32.第三方面，本技术实施例提供一种前述的des
‑
pglu brazzein三位点突变体结构基因生产甜蛋白的方法，包括以下步骤，
33.(1)合成des
‑
pglu brazzein三位点突变体结构基因；
34.(2)将步骤(1)得到的des
‑
pglu brazzein三位点突变体结构基因克隆乳腺特异性表达载体pbc1，得到表达载体pbc1
‑
des
‑
pglu
‑
brazzein；
35.(3)将步骤(2)合成的pbc1
‑
des
‑
pglu brazzein酶切，得到载体真核部分；
36.(4)将步骤(3)得到的载体真核部分注射入受精卵，再将受精卵转入受体动物，分娩后得到模型动物；
37.(5)收集模型动物的乳汁，得到brazzein甜蛋白。
38.在本发明的一些实施例中，上述方法中所述受体动物为小鼠。
39.第四方面，本技术实施例提供一种检测前述表达载体的引物，包括pb
‑
s和pb
‑
a，所述pb
‑
s的序列如seq id no.4所示，所述pb
‑
a的序列如seq id no.5所示。
40.第五方面，本技术实施例提供一种前述的des
‑
pglu brazzein三位点突变体结构基因在生产brazzein甜蛋白中的应用。
41.第六方面，本技术实施例提供一种前述的表达载体在生产brazzein甜蛋白中的应用。
42.以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
43.试验例1
44.本试验例的目的在于合成重组des
‑
pglu brazzein三位点突变体(h31r/e36d/e41a)结构基因。
45.本试验例的重组des
‑
pglu brazzein三位点突变体(h31r/e36d/e41a)结构基因(见seq id no.1)，由山羊β
‑
乳球蛋白的信号肽编码序列与des
‑
pglu brazzein三位点突变体(h31r/e36d/e41a)成熟肽编码序列拼接而成，拼接后的序列作了适合在小鼠细胞中表达的密码子优化，以适合在哺乳动物细胞中表达。密码子优化后的序列经经处理成适宜构建载体的序列(如seq id no.2所示)，人工合成并克隆至puc57载体。des
‑
pglu brazzein三位点突变体(h31r/e36d/e41a)成熟肽氨基酸序列(已除去信号肽序列)见seq id no.3。
46.表1
[0047][0048][0049]
试验例2
[0050]
本试验例的目的在于合成制备乳腺特异性表达载体pbc1
‑
des
‑
pglu
‑
brazzein。
[0051]
将试验例1中得到的包含重组des
‑
pglu brazzein三位点突变体(h31r/e36d/e41a)结构基因的puc57载体用限制性内切酶xho i酶切，用胶回收dna纯化试剂盒(omega公
司)回收228bp目的片段备用；将乳腺特异性表达载体pbc1用限制性内切酶xho i酶切，用胶回收dna纯化试剂盒(omega公司)回收21.6kb的线性化片段备用，即酶切后的pbc1空载，具体操作参照胶回收试剂盒说明书。
[0052]
将回收的目的片段(228bp)和酶切后的pbc1空载(21.6kb)用t4 dna连接酶连接，连接产物转化入dh5α感受态细胞，挑取细菌克隆提质粒，挑取细菌克隆并小提质粒，经酶切和测序验证(测序引物序列如seq id no.6)，获得pbc1
‑
des
‑
pglu
‑
brazzein载体，载体用not i和sal i双酶切可获得其真核部分(结构见图1)，即包含insulator鸡β
‑
珠蛋白绝缘子(2x)、β
‑
casein promoter山羊β
‑
酪蛋白启动子、brazzein优化的des
‑
pglu brazzein三位点突变体(h31r/e36d/e41a)编码序列、β
‑
casein 3
′
genomic山羊β
‑
酪蛋白3
′
基因组序列。
[0053]
试验例3
[0054]
本试验例的目的在于培育转基因小鼠。
[0055]
将试验例2中获得的含有pbc1
‑
des
‑
pglu
‑
brazzein载体的菌液扩大培养后提取pbc1
‑
des
‑
pglu
‑
brazzein质粒，经限制性内切酶not i和限制性内切酶sal i双酶切得到可在泌乳期的乳腺细胞内特异性表达的pbc1
‑
des
‑
pglu
‑
brazzein载体(结构如图1所示)，用0.8％琼脂糖凝胶电泳，并用胶回收dna纯化试剂盒(qiagen公司)回收前述可在真核细胞内特异性表达的pbc1
‑
des
‑
pglu
‑
brazzein载体，即长度为16.0kb的表达载体，将其溶于te缓冲液(0.05m tris，0.25m edta)并稀释至5ng/μl，用于后续小鼠受精卵显微注射。
[0056]
选取7
‑
8周龄雌性小鼠，阴道口封闭，作为供体，下午3:00，每只小鼠腹腔注射pmsg(10iu)。47～48小时后，每只小鼠腹腔注射hcg(0.8iu)，并与正常公鼠合笼；另取数只适龄母鼠作为受体，阴道口潮红，与结扎公鼠合笼。次天上午9:00前观察供体、受体，有精栓者拿出备用。上午10:30，断颈处死供体，手术取出整个输卵管，用m2冲洗出受精卵。放在m16液中后置于5％co2，37℃培养箱培养。将前述可在真核细胞内特异性表达的pbc1
‑
des
‑
pglu
‑
brazzein载体利用显微镜注射至受精卵原核中。注射后的受精卵于5％co2，37℃培养箱中培养1h，手术移植入同期发情的受体母鼠输卵管中。手术后19～20天仔鼠分娩，待仔鼠3周后，剪耳、编号，提取基因组dna，进行pcr及southern blot检测，pcr检测引物为pb
‑
s(seq id no.3)和pb
‑
a(seq id no.4)。pcr产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，可见大小592bp的条带。检测阳性的pcr产物送生物公司测序，测序结果用dnastar分子生物学分析软件进行序列比较。
[0057]
southern blot检测试剂盒购自武汉博士德，探针为地高辛标记的表达载体pcr扩增产物(引物为pb
‑
s和pb
‑
a)。
[0058]
试验一共注射了80枚受精卵，将其中生长状态良好的68枚移入了7只代孕雌性小鼠的输卵管中，共获得了52只原代小鼠。试验获得5只转基因小鼠(2公3母，雄性小鼠为#1、#4，雌性小鼠为#2、#3、#5)，转基因成功率为10.8％。收集这5只转基因小鼠进行试验，pcr(图2中a图)及southern blot(图2中b图)的检测结果如图2所示，图2的a图中nc为正常小鼠基因组dna，lanes 1
‑
5为5只原代转基因小鼠基因组dna，w为双蒸水，m为dl2000 dnamarker，pc为pbc1
‑
des
‑
pglu
‑
brazzein质粒与正常小鼠基因组dna混合作为阳性对照。b图中的pc为pbc1
‑
des
‑
pglu
‑
brazzein质粒用hind iii酶切作阳性对照，lanes 1
‑
5为5只原代转基因小鼠基因组dna用hind iii酶切，nc为正常小鼠基因组dna用hind iii酶切作阴性对照。
[0059]
由图2可知，小鼠中转入的pbc1
‑
des
‑
pglu
‑
brazzein可正常表达，即转基因小鼠培
育成功。
[0060]
试验例4
[0061]
本试验例的目的在于检测试验例3中转基因小鼠乳汁中brazzein的表达。
[0062]
收集泌乳期转基因小鼠，包括f0代：#2、#3、#5，f1代：1
‑
f1a(#1雄性小鼠的子代)、4
‑
f1a(#1雄性小鼠的子代)的乳汁，用elisa和western blot检测brazzein。
[0063]
商品brazzein(csb
‑
yp347673pfg，cusabio，中国)用作阳性对照。将样品(乳清，乳汁高速离心即得到乳清)与sds
‑
page上样缓冲液混合后100℃煮10分钟，用12％sds
‑
page分离。再将膜上的蛋白质电转移到pvdf膜上(0.45μm，pall，美国)。转移后的膜用5％fbs/tbst于4℃封闭过夜，然后于室温下在兔抗brazzein多克隆抗体(于5％fbs/tbst中按1：2000稀释，自制)中孵育1.5h，然后tbst洗涤3次。再将膜用hrp标记的山羊抗兔igg(于5％fbs/tbst中按1：3000稀释，biosharp life science，中国)在室温下孵育1h，tbst洗涤3次。最后用ecl发光液(millipore corporation，美国)进行免疫检测。结果如图3所示，各转基因小鼠的乳清western blot检测结果中特异性条带深浅不一，其中以3号的浓度最高，1
‑
f1a次之，#2和#5相对偏少。
[0064]
通过酶联免疫吸附测定(elisa)检测brazzein的表达水平。用pbs将乳清样品稀释至1:100进行elisa。使用针对brazzein的兔多克隆抗体(在5％fbs/tbst中以1：2000稀释)作为一抗。在tmb底物试剂盒测定中(sangon，biotech，中国)，使用hrp偶联的山羊抗兔igg(于5％fbs/pbs中以1：3000稀释；biosharp life science，中国)作为二抗。使用酶标仪(rayto，中国)在450nm处测量吸光度。使用brazzein(csb
‑
yp347673pfg，cusabio，中国)制作基于od值的标准曲线，根据标准曲线回归方程计算乳汁样品中的brazzein浓度。
[0065]
各原代转基因小鼠乳汁中brazzein表达水平如下表2所示。
[0066]
表2
[0067]
编号性别代数乳汁中brazzein含量#2雌性026.18mg/l#3雌性0332.59mg/l#5雌性029.47mg/l1
‑
f1a雌性1151.85mg/l4
‑
f1a雌性10.63mg/l
[0068]
由表2和图3可知，western blot检测结果和elisa检测结果吻合，wb条带深浅与elisa检测浓度高低对应。
[0069]
试验例5
[0070]
本试验例的目的在于检测试验例3中转基因小鼠乳汁中brazzein的甜度。
[0071]
收集泌乳期转基因小鼠，包括f0代：#2、#3、#5，f1代：1
‑
f1a(#1雄性小鼠的子代)、4
‑
f1a(#1雄性小鼠的子代)的乳汁。
[0072]
使用煮沸的小鼠乳汁进行双盲实验。参与者包括18名志愿者，其中包括9名女性和9名男性(年龄在18至50岁之间)，志愿者的味觉均没有任何异常。制备0％，0.6％，2％，4％，6％和10％(w/v)的蔗糖溶液作为阳性对照，而野生型(wt)小鼠的乳汁作为阴性对照，并且增加一个前期的其他研究中获得的野生型des
‑
pglu brazzein转基因小鼠(编号1
‑
des
‑
pglu)的乳汁(表达水平约为146.58mg/l)。将50μl用pbs稀释的小鼠乳汁滴到舌头的前部。
每次测试后，受试者用饮用水漱口3次。样品的呈递顺序随机，每个样品的测试重复三遍。得分基于以下类别的反馈：“不甜”(0)，“不确定是否尝过甜”(0.5)，“微甜”(1.0)，“甜”(2.0)，“非常甜”(3.0)和“非常甜”(4.0)，分别对应0％，0.6％，2％，4％，6％和10％(w/v)的蔗糖溶液。测试结果用单因素方差分析进行评估，p<0.05为差异显著。
[0073]
结果如图4所示，16倍稀释的1
‑
f1a和32倍稀释的#3转基因小鼠的乳汁甜度略低于10％蔗糖溶液；16倍稀释的#2和#5转基因小鼠乳汁甜度较低，有少数志愿者甚至表示没有甜味；16倍稀释的#4转基因小鼠乳汁甜度最低，大多数志愿者表示无甜味。甜度检测的结果与浓度检测结果呈正相关。而前期的其他研究中获得的野生型des
‑
pglu brazzein转基因小鼠的乳汁，经2倍稀释后甜度介于6％与10％的蔗糖溶液之间，其甜度大约与经16倍稀释的1
‑
f1a或32倍稀释的#3乳汁相当。
[0074]
综上所述，本发明实提供的小鼠乳腺生物反应器生产甜蛋白brazzein的方法至少具有如下优点或有益效果：
[0075]
本发明提供的des
‑
pglu brazzein三位点突变体结构基因，通过将山羊β
‑
乳球蛋白的信号肽编码序列与des
‑
pglu brazzein三位点突变体(h31r/e36d/e41a)成熟肽编码序列拼接，再进行密码子优化，使其适合在哺乳动物内稳定表达。本发明提供包含des
‑
pglu brazzein三位点突变体结构基因的表达载体，该表达载体pbc1
‑
des
‑
pglu brazzein为乳腺特异性表达载体，可在乳腺细胞中特异性地表达brazzein并分泌至乳汁中。本发明提供的利用des
‑
pglu brazzein三位点突变体结构基因生产甜蛋白的方法，此方法的构建过程快速简单，诱导条件容易控制，其产物的活性和甜度高度类似于天然产物，并且甜度远远高于野生型其他研究中获得的野生型des
‑
pglu brazzein转基因小鼠的乳汁，后续无需进行重组蛋白分离纯化，生产成本低，能够大量生产。为使用转基因大型动物(如奶牛、奶山羊)大规模生产植物源甜蛋白提供了理论和方法支持。
[0076]
以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。