一种精神分裂症发育异常的皮层类器官模型的构建方法与流程

1.本发明涉及模型构建领域，具体涉及一种精神分裂症发育异常的皮层类器官模型的构建方法。


背景技术：

2.精神分裂症(schizophrenia,scz)是一类以思维、情感、意志行为等多方面损害为特征的慢性致残性脑病，其终生患病率约为1％，可严重影响患者的生活、工作、学习及社会功能。然而对精神分裂症的治疗主要针对症状进行控制和缓解，缺乏生物学基础。精神疾病的病理生理学基础不明是影响精神疾病临床客观诊断和精准治疗的根本原因，而理想研究模型的缺乏是精神疾病发病机制研究进展的主要瓶颈。
3.诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells，ipscs)是由体细胞诱导分化而成的“多能细胞”。ipscs在形态、基因表达、表观遗传修饰以及细胞自我更新等方面和胚胎干细胞(embryonic stem cells,escs)类似，具有分化为三种胚层的能力。ipscs可定向诱导分化，构建多种实验模型，用于疾病研究以及药物筛选等。例如，多种神经系统疾病患者来源的ipscs(包括老年性痴呆病、帕金森氏病、亨廷顿病、唐氏综合症等)相继被建立，并定向分化为特定的神经元/组织，在神经系统疾病生物学机制以及特异性新药的研究方面提供了帮助。
4.因此，ipscs方法提供了一条定向诱导获得特定组织、器官的研究途径，也为定向诱导获得特定类型神经元和特定区域特定发育阶段的皮层类器官模型，揭示神经疾病、脑部疾病可能的发病机制以及开发潜在的治疗措施提供了很好的研究途径。
5.但是，由于神经和脑部的复杂性，制备特定类型神经元和特定区域特定发育阶段的皮层类器官模型是困难的。如何制备一种精神分裂症发育异常的皮层类器官模型需要进一步研究。


技术实现要素：

6.为了解决上述问题，本发明提供了一种精神分裂症发育异常的皮层类器官模型的构建方法。
7.本发明提供了一种构建精神分裂症发育异常的皮层类器官模型的诱导性多能干细胞，所述诱导性多能干细胞是由中国典型培养物保藏中心(cctcc)保藏的保藏编号为cctcc no：c2021146的细胞株wd
‑
fes1(保藏地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期为2021年6月11日)。
8.本发明还提供了一种构建健康皮层类器官模型的诱导性多能干细胞，所述诱导性多能干细胞是由中国典型培养物保藏中心(cctcc)保藏的保藏编号为cctcc no：c2021145的细胞株xyy
‑
hc1(保藏地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期为2021年6月11日)。
9.本发明还提供了前述的诱导性多能干细胞wd
‑
fes1在构建精神分裂症发育异常的皮层类器官模型中的用途。
10.本发明还提供了前述的诱导性多能干细胞xyy
‑
hc1在构建健康皮层类器官模型中的用途。
11.本发明还提供了一种皮层类器官模型的构建方法，它包括如下步骤：
12.通过3d悬浮培养方法，诱导前述的诱导性多能干细胞分化，即得；
13.前述的诱导性多能干细胞wd
‑
fes1分化构建得到精神分裂症发育异常的皮层类器官模型；
14.前述的诱导性多能干细胞xyy
‑
hc1分化构建得到健康皮层类器官模型。
15.进一步地，前述的构建方法包括如下步骤：
16.(1)将前述的诱导性多能干细胞诱导成拟胚体；
17.(2)将拟胚体培养形成ronas；
18.(3)将ronas培养形成皮层类器官前体；
19.(4)皮层类器官前体成熟为皮层类器官。
20.进一步地，
21.步骤(1)中，所述将前述的诱导性多能干细胞诱导成拟胚体的具体方法为：将前述的诱导性多能干细胞消化后转移到低贴壁的培养板中，培养7天形成拟胚体；
22.和/或，步骤(2)中，所述将拟胚体培养形成ronas的具体方法为：将拟胚体转移到matrigel包被的培养板中，使用含n2培养基培养，得到具有典型神经元特征的集落ronas；
23.和/或，步骤(3)中，所述将ronas培养形成皮层类器官前体的具体方法为：将ronas消化为单细胞，使用人皮层类器官基础培养液在低吸附培养板中培养，获得皮层类器官前体；
24.和/或，步骤(4)中，所述皮层类器官前体成熟为皮层类器官的具体方法为：使用人皮层类器官基础培养液培养皮层类器官前体，每3
‑
7天进行半量换液，直至分化成熟；
25.优选地，
26.步骤(1)中，所述消化使用含1mg/ml胶原酶的dmem/f12培养基；
27.和/或，步骤(1)中，所述培养的培养基为essential 8tm人ipsc培养基；
28.和/或，步骤(2)中，所述培养基为含n2的dmem/f12培养基；
29.和/或，步骤(3)中，所述消化为1ml/cm
2 accutase在37℃消化5
‑
10min。
30.进一步地，步骤(4)中，所述分化成熟为分化90天。
31.本发明还提供了一种皮层类器官模型，它是由前述的诱导性多能干细胞wd
‑
fes1按照前述的构建方法构建而成的精神分裂症发育异常的皮层类器官模型；
32.和/或，它是由前述的诱导性多能干细胞xyy
‑
hc1按照前述的构建方法构建而成的健康皮层类器官模型。
33.本发明还提供了前述的皮层类器官模型在筛选治疗精神分裂症的药物中的用途。
34.本发明还提供了一种筛选治疗精神分裂症的药物的方法，它包括如下步骤：
35.(1)将前述的诱导性多能干细胞wd
‑
fes1按照前述的构建方法，构建精神分裂症发育异常的皮层类器官模型；将前述的诱导性多能干细胞xyy
‑
hc1按照前述的构建方法，构建健康皮层类器官模型；
36.(2)将候选药物分别施用于上述模型；
37.(3)用上述模型评价潜在的治疗精神分裂症的药物。
38.本技术通过非整合(无痕)重编程的episomal质粒电转方法(无外源质粒序列残留，相对安全，致瘤性小)，制备了1例首发(首次患病未用药，可以排除药物对基因组表观遗传等影响)精神分裂症患者和1例正常对照青少年儿童(精神分裂症多起病于青少年阶段，此阶段也是神经发育的重要阶段)的特定ipscs样本(正常对照的ipscs样本为xyy
‑
hc1，由中国典型培养物保藏中心(cctcc)保藏，保藏编号为cctcc no：c2021145；精神分裂症患者的ipscs样本为wd
‑
fes1，由中国典型培养物保藏中心(cctcc)保藏，保藏编号为cctcc no：c2021146)。
39.本技术利用前述特定的ipscs细胞株，通过3d悬浮培养方法，将ipscs定向诱导成了能够模拟大脑发育时间进程和空间结构的皮层类器官的模型。这种模型包含兴奋性神经元、抑制性神经元和多种神经支持细胞，并且在不同发育时期展示出一定的空间结构，克服了传统定向分化方法所得神经元类型单一且无任何空间结构的缺陷，能够反映不同神经细胞之间的相互作用和影响。
40.即本发明采用特定人诱导多能干细胞wd
‑
fes1和xyy
‑
hc1，分别构建了模拟大脑发育时间进程和空间结构的皮层类器官模型，克服了定向分化为神经元方法所得神经元类型单一/有限的缺陷，可以反映多种神经细胞(除神经元以外还有星型胶质细胞等多种支持细胞)的功能。与以正常对照来源的人诱导性多能干细胞xyy
‑
hc1制备的皮层类器官模型相比，精神分裂症患者来源的wd
‑
fes1制备的精神分裂症皮层类器官在发育早期存在显著的腔室结构缺陷，随着发育进程的推荐这些缺陷持续存在，且在神经细胞类型比例等方面存在发育异常。该模型可以作为精神分裂症神经发育异常研究的重要模型，对于精神分裂症神经发育异常生物学机制研究，尤其是精神分裂症新型治疗药物开发提供了理想的研究模型。
41.显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
42.以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
43.图1为皮层类器官的制备方法。
44.图2为精神分裂症患者来源ipscs分化得到结构缺陷和兴奋性神经元/抑制性神经元比例失衡的皮层类器官：a为d30(表第30天)，b为d60(表第60天)，c为d90(表第90天)；标尺＝500μm。
具体实施方式
45.本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。
46.本技术通过非整合(无痕)重编程的episomal质粒电转方法(无外源质粒序列残留，相对安全，致瘤性小)，制备了1例首发(首次患病未用药，可以排除药物对基因组表观遗传等影响)精神分裂症患者和1例正常对照青少年儿童(精神分裂症多起病于青少年阶段，
此阶段也是神经发育的重要阶段)的特定ipscs样本。将这两个ipscs样本进行了保藏。
47.正常对照的ipscs样本为人诱导性多能干细胞xyy
‑
hc1，由中国典型培养物保藏中心(cctcc)保藏，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期为2021年6月11日，保藏编号为cctcc no：c2021145。
48.精神分裂症患者的ipscs样本为人诱导性多能干细胞wd
‑
fes1，由中国典型培养物保藏中心(cctcc)保藏，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期为2021年6月11日，保藏编号为cctcc no：c2021146。
49.实施例1、精神分裂症患者来源ipscs分化得到结构缺陷和兴奋/抑制失衡的皮层类器官模型
50.如图1所示，皮层类器官模型的构建过程参考xu等人的制备方法(xu et al.,cultured networks of excitatory projection neurons and inhibitory interneurons for studying human cortical neurotoxicity,2016,science translational medicine,8(333):333ra48)。
51.(1)将人诱导性多能干细胞wd
‑
fes1诱导成拟胚体：使用含1mg/ml胶原酶的dmem/f12培养基，将ipsc(wd
‑
fes1)消化5
‑
10分钟，将分离的ipsc克隆转移到低贴壁的培养板中，使用人ipsc的培养基(不含fgf2，定义为kosr培养基)培养两天，然后在培养基中加入50ng/ml noggin和10mm sb431542，到第七天形成拟胚体。
52.(2)将拟胚体转移到matrigel包被的培养板中形成ronas：将拟胚体转移到matrigel包被的培养板中，使用dmem/f12培养基(含1％n2，100mm非必需氨基酸mem，1mm glutamax和2mg/ml肝素)培养。第7
‑
12天每隔一天更换培养基，12天后每天更换培养基。n2补充剂使悬浮的拟胚体在培养板中形成附着的拟胚体，在第8
‑
9天时，附着的拟胚体分解形成具有典型神经元特征的集落，即ronas。
53.(3)形成皮层类器官前体：手动分离ronas，使用neurobasal培养基(含有2％无vita的b27和1mm glutamax)培养1天，ronas分解为单细胞并贴壁于层粘连蛋白/聚
‑
d
‑
赖氨酸包被的培养板上，在neurobasal/b27神经分化培养基(含有20ng/ml bdnf，20ng/ml gdnf和0.5mm camp)中培养十天后进行消化。消化时先用pbs洗一遍，0.1ml/cm
2 accutase在37℃消化5
‑
10min；加入消化液3倍体积的人神经前体细胞培养液终止消化，轻轻吹打细胞，使其脱离细胞底板呈单细胞悬液状态，转移至离心管中，300g离心3min；弃上清，用适量人3d大脑皮层类器官培养液(人皮层类器官基础培养液)重悬细胞，进行活细胞计数。根据需要的类器官大小，在超低附96孔细胞培养板中每孔接种0.1
‑
2.0
×
104个细胞，培养获得皮层类器官前体(时间记为d0，第0天)。
54.(4)皮层类器官分化：皮层类器官前体使用人皮层类器官基础培养液(neurobasal培养基中含1％n2和2％b27，添加20ng/ml bdnf和20ng/ml gdnf)进行后续培养，每3
‑
7天进行半量换液，根据培养液颜色变化或实验需求调整换液频率或培养板规格，直至分化成熟至d90(第90天)。即得精神分裂症结构缺陷和兴奋性神经元/抑制性神经元比例失衡的皮层类器官模型。
55.按照实施例1所述方法，将人诱导性多能干细胞wd
‑
fes1替换为人诱导性多能干细胞xyy
‑
hc1，制备得到正常人皮层类器官模型，作为对照模型。
56.两种干细胞分化成人皮层类器官模型的结果如图2所示。在3d分化早期d30阶段(如图2a)，正常对照来源的ipscs(xyy
‑
hc1)制备的皮层类器官表现出典型的以神经前体细胞sox2

为核心的室下svz区结构；而精神分裂症患者来源的ipscs(wd
‑
fes1)制备的皮层类器官无室下svz区结构。随着皮层类器官逐渐发育成熟至d60和d90(如图2b
‑
c)，正常对照组典型的室下svz区结构逐渐减少，而该结构在精神分裂症患者组始终没有出现。
57.可见，本发明精神分裂症患者来源的ipscs制备的皮层类器官存在持续的结构缺陷。
58.同时，与正常对照来源的ipscs制备的皮层类器官相比，在3d分化早期的d30阶段(如图2a)，精神分裂症患者来源的ipscs制备的皮层类器官兴奋性神经元比例存在明显降低，如深层皮层的tbr1

/ctip2

/satb2

兴奋性神经元和表层皮层的兴奋性神经元reelin

/cux1

/brn2

，以及呈现点状分布的vglut1

、synapsin

和psd95

；与此同时，抑制性中间神经元比例显著升高，如sst

/gaba

和vgat

/map2

。随着皮层类器官逐渐发育成熟至d60和d90(如图2b
‑
c)，兴奋性神经元比例降低及抑制性神经元比例升高的失衡现象仍然存在。这些均说明精神分裂症患者来源的ipscs制备的皮层类器官存在持续的兴奋性神经元/抑制性神经元失衡。
59.可见，本发明采用神分裂症患者来源的ipscs(wd
‑
fes1)制备的皮层类器官可作为精神分裂症神经发育异常研究的模型。
60.综上，本发明采用特定人诱导多能干细胞wd
‑
fes1和xyy
‑
hc1，分别构建了模拟大脑发育时间进程和空间结构的皮层类器官模型，克服了定向分化为神经元方法所得神经元类型单一/有限的缺陷，可以反映多种神经细胞(除神经元以外还有星型胶质细胞等多种支持细胞)的功能。与以正常对照来源的人诱导性多能干细胞xyy
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hc1制备的皮层类器官模型相比，精神分裂症患者来源的wd
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fes1制备的精神分裂症皮层类器官在发育早期存在显著的腔室结构缺陷，随着发育进程的推荐这些缺陷持续存在，且在神经细胞类型比例等方面存在发育异常。该模型可以作为精神分裂症神经发育异常研究的重要模型，对于精神分裂症神经发育异常生物学机制研究，尤其是精神分裂症新型治疗药物开发提供了理想的研究模型。