小麦白粉病抗性基因pmCH7015的KASP标记开发及其应用的制作方法

小麦白粉病抗性基因pmch7015的kasp标记开发及其应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及小麦白粉病抗性基因pmch7015的kasp标记开发及其应用。


背景技术：

2.小麦(triticum aestivum)是我国最重要的粮食作物之一，在我国已有上万年的栽培历史(蒋赟，王秀东.我国小麦产业发展现状问题及对策浅析[j].南方农业，2020，v.14；no.329(31)：35
‑
38.)。作为全世界最大的小麦生产国和消费国，截至2019年底，我国小麦产量达13359万吨，种植面积达2373万公顷(国家统计局关于2019年粮食产量数据的公告，http://www.stats.gov.cn/tjsj/zxfb/201912/t20191206_1715827.html)。因此，稳定和提高粮食产量是保证我国国民基本生活的首要任务。
[0003]
白粉病是小麦生产的主要病害之一，严重发病地区可使小麦产量降低20％，严重威胁我国小麦的产量和品质。选育小麦抗白粉病品种是解决这一问题的高效、绿色、可持续途径。通过分子标记辅助选择技术(marker
‑
assisted selection，mas)进行品种选育也已逐渐成为主流，其弥补了传统育种中的诸多弊端，成为高效选育抗性品种的有效方法(tanksley等，rflp mapping in plant breeding：new tools for an old science.1989，biotechnology，7：257
‑
263)。
[0004]
迄今为止，研究发现的小麦白粉病抗性基因有100多个，其中60多个已被命名(pm1
‑
pm62)。其中，pm6、pm4a和pm16等基因都开发了相应的ssr或indel分子标记，用于分子标记辅助选择育种(周军，徐如宏，谢鑫，等.小麦抗白粉病及分子标记研究进展[j].湖北农业科学，2020，v.59；no.651(06)：12
‑
17.)。利用高通量分子检测平台进行分子标记辅助选择则是增加产量育种准确度与提高育种效率的有效手段。单核苷酸多态性(single
‑
nucleotide polymorphism，snp)是指基因组核苷酸序列中由单个核苷酸水平上的变异而引起的基因组水平上的dna序列多态性(唐立群等，snp分子标记的研究及其应用进展.2012，中国农学通报，28(12)：154
‑
158.)。基于snp位点设计的标记即为在此基础上发展起来的第三代分子标记，该标记类型具有突变频率低，遗传稳定性高；位点丰富，分布广泛；检测快速，筛选规模化等特点。与第一代和第二代分子标记相比，基于snp位点设计的kasp标记不需要根据dna片段大小进行分型，能够摆脱传统凝胶电泳这种步骤相对繁琐，低通量，价格又较贵的检测方法。因此，更加适用于现阶段飞速发展的高通量分子检测平台。
[0005]
上述很多小麦抗白粉病相关基因的连锁标记虽然可以用于分子标记辅助选择，但多为ssr标记、indel标记或酶切标记，检测效率低，同时还可能会产生气溶胶污染环境，并不适用于高通量的分子检测平台。因此，开发适合于高通量分子检测平台的小麦抗白粉病kasp分子标记对于推广普及分子标记技术的应用、提高我国小麦抗白粉病育种效率和育种水平具有重要意义。


技术实现要素：

[0006]
本发明提供了鉴定或辅助鉴定小麦白粉病抗性的方法，包括检测待测小麦的基因型，根据待测小麦的基因型鉴定或辅助鉴定小麦白粉病抗性；所述基因型为cc基因型、aa基因型或ca基因型；所述cc基因型表示小麦基因组中kasp_7015位点的核苷酸种类为c的纯合型；所述aa基因型表示小麦基因组中所述kasp_7015位点的核苷酸种类为a的纯合型；所述ca基因型表示小麦基因组中所述kasp_7015位点的核苷酸种类为c和a的杂合型；所述kasp_7015位点是小麦基因组中的一个snp位点，位于小麦第5a号染色体上seq id no.4的第101位核苷酸，其核苷酸种类为a或c。所述kasp_7015位点的基因型为aa基因型的待测小麦的白粉病抗性低于或候选低于所述kasp_7015位点的基因型为ca基因型或cc基因型的待测小麦。
[0007]
上述方法在小麦育种中的应用也属于本发明的保护范围之内。
[0008]
本发明还提供了检测kasp_7015位点的多态性或基因型的物质的应用。所述应用为在鉴定或辅助鉴定小麦白粉病抗性中的应用、在制备鉴定或辅助鉴定小麦白粉病抗性产品中的应用或在小麦辅助育种或制备小麦辅助育种产品中的应用。
[0009]
本发明又提供了小麦育种的方法，包括选择所述kasp_7015位点的基因型为aa或ca的小麦作为亲本进行育种，所述aa基因型表示小麦基因组中所述kasp_7015位点的核苷酸种类为a的纯合型；所述ca基因型表示小麦基因组中所述kasp_7015位点的核苷酸种类为a和c的杂合型。
[0010]
上文中，所述小麦育种可为培育抗白粉病的小麦品种。所述抗白粉病的小麦品种中的抗白粉病是相对于杂交亲本小麦而言。如果两个杂交亲本小麦对白粉病的抗性相同，所述抗白粉病小麦品种的白粉病抗性可等于或高于杂交亲本小麦的白粉病抗性；如果两个杂交亲本小麦对白粉病的抗性不相同，所述抗白粉病小麦品种的白粉病抗性可等于或高于两个杂交亲本小麦中白粉病抗性较低的杂交亲本小麦。
[0011]
含有所述检测kasp_7015位点的多态性或基因型的物质的产品也在本发明的保护范围之内。
[0012]
所述产品为c1)
‑
c3)中任一种产品：
[0013]
c1)检测与小麦白粉病抗性相关的单核苷酸多态性或基因型的产品；
[0014]
c2)鉴定或辅助鉴定小麦白粉病抗性的产品；
[0015]
c3)用于小麦辅助育种的产品。
[0016]
上文中，所述检测kasp 7015位点的多态性或基因型的物质可为如下d1)、d2)或d3)：
[0017]
d1)所述检测kasp_7015位点的多态性或基因型的物质含有扩增包括所述kasp_7015位点在内的小麦基因组dna片段的pcr引物；
[0018]
d2)所述检测kasp_7015位点的多态性或基因型的物质为含有所述pcr引物的pcr试剂；
[0019]
d3)含有d1)所述pcr引物或d2)所述pcr试剂的试剂盒。
[0020]
上文中，所述pcr引物可为由核苷酸序列是序列表中seq id no.1的第22
‑
44位的单链dna、核苷酸序列是序列表中seq id no.2的第22
‑
44位的单链dna和核苷酸序列是序列表中seq id no.3的单链dna组成的引物组。
[0021]
可选地，所述pcr引物为由序列表中seq id no.1所示的单链dna、序列表中seq id no.2所示的单链dna和序列表中seq id no.3所示的单链dna组成的引物组。
[0022]
上述应用、方法和产品中，所述pcr引物可被标记物标记也可不被标记物标记。所述标记物指可用于提供可检测的效果且可以连接至核酸的任何原子或分子。标记物包括但不限于染料；放射性标记，诸如
32
p；结合部分，诸如生物素(biotin)；半抗原，诸如地高辛(dig)；发光、发磷光或发荧光部分；和单独的荧光染料或与可以通过荧光共振能量转移(fret)抑制或移动发射光谱的部分组合的荧光染料。标记可以提供可通过荧光、放射性、比色、重量测定、x射线衍射或吸收、磁性、酶活性等检测的信号。标记可以是带电荷的部分(正电荷或负电荷)或可选地，可以是电荷中性的。标记可以包括核酸或蛋白序列或由其组合，只要包含标记的序列是可检测的。在一些实施方案中，核酸在没有标记的情况下直接检测(例如，直接读取序列)。
[0023]
本发明提供了一种小麦白粉病抗性相关基因pmch7015紧密连锁的snp分子标记开发与应用，所述分子标记是与小麦白粉病抗性相关基因pmch7015紧密连锁的snp分子标记kasp_7015。该分子标记可高通量检测小麦基因组第5a号染色体的第527492344位碱基。本发明提供的方法对小麦白粉病抗性相关基因pmch7015紧密连锁的snp分子标记进行基因型鉴定，例如，应用kasp技术，该方法具有操作简便、成本低廉、检测周期短、标记稳定、绿色环保等优点，可精准检测小麦白粉病抗性相关基因pmch7015，对促进小麦产量育种具有重要意义。
[0024]
在本发明的一个实施例中，使用kasp技术对8份小麦品种的kasp_7015位点的基因型进行鉴定。实验证明，kasp_7015位点为c的纯合型小麦品种的表型为白粉病抗病，kasp_7015位点为a的纯合型小麦品种的表型为白粉病感病，说明kasp_7015位点是与小麦白粉病抗性相关的snp分子标记，可用于鉴定或辅助鉴定小麦白粉病抗性，可用于小麦抗白粉病品种的筛选，可用于小麦分子标记辅助育种。kasp_7015位点的多态性直接以dna的形式表现，在小麦的各个组织及各个发育阶段均可检测到，有利于方便快捷地预测小麦白粉病抗性。在实际应用中，为了提高准确率，可将检测kasp_7015位点多态性和基因型的物质与其他物质(如检测其他与小麦白粉病抗性相关的单核苷酸多态性或基因型的物质)联合在一起制备鉴定小麦白粉病抗性的产品。
附图说明
[0025]
图1为实施例1利用分子标记kasp_7015检测8份小麦品种材料的分型图，其中，cc
‑
fam表示基因型为cc，aa
‑
vic表示基因型为aa。
[0026]
图2为实施例2利用分子标记kasp_7015检测f2分离群体的分型图，其中，cc
‑
fam表示基因型为cc，aa
‑
vic表示基因型为aa，a/c表示基因型为ac。
具体实施方式
[0027]
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
[0028]
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所
描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0029]
下述实施例中所使用的小麦品种均可从商业途径得到。
[0030]
本发明的发明人筛选出一个和小麦白粉病抗性相关的snp位点，该位点与pmch7015基因紧密连锁，锚定在小麦第5a号染色体的第527492344位(http:∥plants.ensembl.org/index.html，基因组版本triticum aestivum iwgsc(genomic sequence))，将该snp位点命名为kasp_7015，其侧翼序列如seq id no.4所示，seq id no.4中，m为a或c。kasp_7015位于seq id no.4的第101位，该处的核苷酸种类为a或c。
[0031]
下述cc基因型表示kasp_7015的核苷酸种类为c的纯合型；aa基因型表示kasp_7015的核苷酸种类为a的纯合型；ca基因型表示kasp_7015的核苷酸种类为a和c的杂合型。
[0032]
实施例1与小麦白粉病抗性相关基因pmch7015紧密连锁kasp标记开发
[0033]
1.引物的设计：利用primer5.0软件设计pmch7015基因的紧密连锁分子标记xgpw4079(记载于郭慧娟，贾举庆，李欣，等.小麦种质ch7015中抗白粉病基因的ssr定位[j].华北农学报，2019，34(6)：203
‑
208.)的3组kasp引物。利用douglas scientific公司arraytape平台检测后，挑选出1套多态性良好的kasp引物用于后续验证。
[0034]
用于检测kasp_7015的kasp引物具体如下：
[0035]
primer x：5
’‑
gaaggtcggagtcaacggattgggctctctagttcgtctgtcaa
‑3’
(seq id no.1，小写字母部分为特异荧光标签序列vic)；
[0036]
primer y：5
’‑
gaaggtgaccaagttcatgctgggctctctagttcgtctgtcac
‑3’
(seq id no.2，小写字母部分为特异荧光标签序列fam)；
[0037]
primer r：5
’‑
agttcggactacgagcattagagat
‑3’
(seq id no.3)。
[0038]
2.dna提取：采用常规ctab法从小麦叶片中提取基因组dna。
[0039]
3.kasp反应测试
[0040]
snp标记扩增及反应体系：
[0041]
(1)荧光定量pcr仪ab
‑
q6 flex检测：
[0042]
5μl pcr荧光定量仪检测反应体系包括：基因组dna 50ng，引物混液0.07μl(优选引物混液配比：正向引物primer x、primery 100pmol
·
l
‑1各12μl，反向引物primer r 100pmol
·
l
‑130μl，ddh2o 46μl，使用其他合理的引物混液配比也可以达到相同的检测目的)，lgc公司2
×
kasp mix(low rox)2.5μl。按照荧光定量pcr仪ab
‑
q6仪器操作手册，编辑样品表，执行运行程序，保存数据。
[0043]
以上反应体系为ab
‑
q6 flex的优选反应体系，其他合理的反应体系也可以达到相同的检测目的。
[0044]
(2)选择douglas scientific公司arraytape平台检测
[0045]
1.6μl pcr arraytape平台检测反应体系包括：含基因组dna 50ng/μl0.8μl，引物混液0.03μl(优选引物混液配比：正向引物primer x、primer y100pmol
·
l
‑1各12μl，反向引物primer r 100pmol
·
l
‑130μl，ddh2o46μl，使用其他合理的引物混液配比也可以达到相同的检测目的)，lgc公司2
×
kasp mix(std rox)0.8μl。根据arraytape平台仪器操作手册，编写样品表，运行程序，读取数据。
[0046]
以上反应体系为douglas scientific公司arraytape平台的优选反应体系，其他
合理的反应体系也可以达到相同的检测目的。
[0047]
注：以上为推荐检测方法，其他能够达到相同检测目的的检测方法也可以应用到上述标记的分子标记辅助育种过程中。
[0048]
其中，2
×
kasp mix由荧光探针a、荧光探针b、淬灭探针a和淬灭探针b，以及高保真taq酶，dntp，mg
2
等组成。荧光探针a的核苷酸序列为：5
’‑
gaaggtcggagtcaacggatt
‑3’
，5’末端连接一个vic荧光基团；荧光探针b的核苷酸序列为：5
’‑
gaaggtgaccaagttcatgct
‑3’
，其5’端连接一个fam荧光基团；淬灭探针a的核苷酸序列为：5
’‑
aatccgttgactccgaccttc
‑3’
，其3’端连接一个淬灭基团bhq；淬灭探针b的核苷酸序列为：5
’‑
agcatgaacttggtcaccttc
‑3’
，其3’端连接一个淬灭基团bhq。
[0049]
扩增程序：95℃预变性10min，1个循环；95℃变性20s，55
‑
62℃(优选55℃)退火60s，设置40个循环。
[0050]
实验同时设置反应体系中不添加模板dna的空白对照(ntc)，每个板设置1个或多个空白对照。
[0051]
对扫描数据进行分析，然后按照如下确定待测小麦基因组中kasp_7015位点的基因型(即检测小麦基因组第5a号染色体的第527492344位碱基是a还是c)，若所述待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经douglas基因分型软件分析靠近x轴(vic信号)，则待测小麦基因组中kasp_7015位点的基因型为aa纯合型(即小麦基因组第5a号染色体的第527492344位碱基为aa纯合型)；若待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经douglas基因分型软件分析靠近y轴(fam信号)，则待测小麦基因组中kasp_7015位点的基因型为cc纯合型(即小麦基因组第5a号染色体的第527492344位碱基为cc纯合型)；若待测小麦的扩增产物的荧光信号数据经douglas基因分型软件分析位于x轴和y轴中间(vic和fam信号)，则待测小麦基因组中kasp_7015位点的基因型为ca杂合型(即小麦基因组第5a号染色体的第527492344位碱基为ca杂合型)。左下角显示为黑色的样本为空白对照。
[0052]
5.标记分型数据分析
[0053]
为了验证kasp_7015标记的可靠性，首先，利用kasp_7015对表1的8份小麦品种材料进行分子标记检测(图1)；然后，对8份小麦品种材料进行白粉病接种鉴定，获得材料的对白粉病的抗性数据，白粉病接种鉴定方法及评价标准见文献(郭慧娟，贾举庆，李欣，等.小麦种质ch7015中抗白粉病基因的ssr定位[j].华北农学报，2019，34(6)：203
‑
208.)。材料基因型采用douglas scientific公司arraytape平台进行检测，为了保证准确性，实验设计2次重复。扩增结果如表1所示，该结果表明，kasp_7015标记在8份材料中能够获得稳定的pcr产物，并且能够检测到a
‑
vic和c
‑
fam两个等位位点(图1)。通过kasp标记与白粉病抗性表型鉴定结果一致性分析，8份材料中仅出现一份材料抗性结果有差异。
[0054]
因此，本发明所述的kasp_7015标记可用于小麦白粉病抗性基因pmch7015的分子标记辅助育种。
[0055]
表1. 8份测试小麦品种的表型与基因型信息
[0056][0057]
注：表中“r”表示材料的表型为抗病；“s”表示材料的表型为感病；“cc”表示cc纯合型；“aa”表示aa纯合型；“ca”表示ca杂合型；“*”表示无检测信号。
[0058]
实施例2与小麦白粉病抗性相关基因pmch7015紧密连锁的kasp标记在分子标记辅助选择小麦高白粉病抗性植株中的应用
[0059]
为检测本发明kasp_7015标记的实用性，购买小麦品种材料扬麦12号(江苏省大华种业集团有限公司)和ch7015(记载于郭慧娟，贾举庆，李欣，等.小麦种质ch7015中抗白粉病基因的ssr定位[j].华北农学报，2019，34(6)：203
‑
208.)，通过杂交产生f1群体，再自交产生f2分离群体90株，对分离群体进行kasp标记检测和抗病表型验证(表2)，标记检测和抗病表型验证实施方法参考实施例1(图2)。其中，90株小麦白粉病接种鉴定方法及评价标准见文献(郭慧娟，贾举庆，李欣，等.小麦种质ch7015中抗白粉病基因的ssr定位[j].华北农学报，2019，34(6)：203
‑
208.)。
[0060]
通过对分离群体进行表型与基因型检测和分析，在90份分离群体单株中，仅6株基因型与表型结果不一致，标记kasp_7015与田间抗性的一致性结果为p＝93.33％。90株f2代植株中，有20株的kasp_7015位点的基因型是cc，其白粉病抗性均为r；有47株的kasp_7015位点的基因型是ca，其中44株的白粉病抗性为r，3株的白粉病抗性为s；有23株的kasp_7015位点的基因型是aa，20株的白粉病抗性均为s，3株的白粉病抗性为r。表明标记kasp_7015在小麦抗根结线虫病植株筛选中具有较高的实用性。
[0061]
表2.小麦分离群体的表型与kasp_7015位点的基因型信息
[0062]
[0063]
[0064][0065]
注：表中“r”表示材料的表型为抗病；“s”表示材料的表型为感病；“cc”表示cc纯合型；“aa”表示aa纯合型；“ca”表示ca杂合型；“*”表示无检测信号。
[0066]
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例做出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
[0067]
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
[0068]
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。