一种咪康唑手性中间体的生物合成方法与流程

一种咪康唑手性中间体的生物合成方法
(一)技术领域
1.本发明涉及的是一种咪康唑手性中间体的生物合成方法，属于生物催化技术领域。
(二)

背景技术：

2.(r)
‑2‑
氯
‑1‑
(2,4
‑
二氯苯基)乙醇(分子量：225.5，cas号：114446
‑
57
‑
0)是制备咪康唑的关键手性中间体，其结构式如下：
[0003][0004]
咪康唑是一种安全、高效、广谱抗真菌药，对致病性真菌几乎都有作用。其机理是抑制真菌细胞膜的固醇合成，影响细胞膜通透性，抑制真菌生长，导致死亡。在4μg/ml以下的浓度可抑制大部分临床分离的真菌，其中新型隐球菌，念珠菌和粗孢子菌对其均敏感，皮炎芽生菌和组织胞浆菌对该药物高度敏感，但曲霉菌较差。另外，咪康唑对金黄色葡萄球菌和链球菌以及革兰氏阳性球菌和炭疽菌等也有抗菌作用。
[0005]
目前已有报道利用包括手性恶唑波烷催化剂、手性金属催化剂和生物催化剂等不同种类催化剂，通过催化不对称加氢制备(r)
‑2‑
氯
‑1‑
(2,4
‑
二氯苯基)乙醇。手性恶唑波烷催化剂的底物谱较广，含铑、钌、铱等过渡金属的催化剂是酮底物加氢反应中最常用的催化剂。然而，过渡金属需要额外的螯合官能团提高对映体的选择性，操作难控制，此外，过渡金属的高成本也限制了其工业化应用。与化学催化剂相比，生物催化剂的优势在于其反应选择性高和环境友好。随着新型抗真菌药物市场的增加，对(r)
‑2‑
氯
‑1‑
(2,4
‑
二氯苯基)乙醇的需求量也迅速增加，因而开发优良的生物催化剂，建立生物催化制备(r)
‑2‑
氯
‑1‑
(2,4
‑
二氯苯基)乙醇新工艺具有很好的应用前景。
[0006]
唐云平等(cn 108396040a)选取candida macedoniensis aku4588来源的羰基还原酶，底物2
‑
氯
‑1‑
(2,4
‑
二氯苯基)乙酮浓度为1～5g/l，羰基还原酶加量为20～100u/l，在缓冲液体系中催化2
‑
氯
‑1‑
(2,4
‑
二氯苯基)乙酮还原合成(r)
‑2‑
氯
‑1‑
(2,4
‑
二氯苯基)乙醇，ee值>99％。mangas等(the journal of organic chemistry,2011,76(7):2115
‑
2122.)使用醇脱氢酶在非常温和的反应条件下催化合成(r)
‑2‑
氯
‑1‑
(2,4
‑
二氯苯基)乙醇，当底物浓度为23.86mmol/l时的产率和ee值都大于99％。最后又进行了化学修饰，以便全面合成所需的单一形式的r对映体药物。这种新颖的化学酶路线提供了明显的优势，而不需要使用有害或有毒的催化剂来引入手性。thiago等(org.chem.,2018,(18):2110
‑
2116.)利用脂肪酶novozym 435催化2,2',4'
‑
三氯苯乙酮生物还原为(r)
‑2‑
氯
‑1‑
(2,4
‑
二氯苯基)乙醇，收率为46.5％，ee值>99％。郁慧蕾等在专利(cn 106701698 a)中公开了利用木糖发酵酵母菌cbs6054表达的羰基还原酶sscr，以及羰基还原酶sscr的突变体催化潜手性羰基化合物不
对称还原制备(r)
‑2‑
氯
‑1‑
(2,4
‑
二氯苯基)乙醇，实现99％以上的转化率，产物光学纯度为99.9％。
[0007]
利用微生物全细胞作为催化剂，通过生物还原制备(r)
‑2‑
氯
‑1‑
(2,4
‑
二氯苯基)乙醇，微生物酶源细胞可经发酵自行制备，质量稳定，成本低廉。而且，在生物还原过程中，通过添加廉价的辅助底物可实现辅酶的原位再生。
(三)

技术实现要素：

[0008]
本发明目的是提供一种利用土星轮头酵母催化制备(r)
‑2‑
氯
‑1‑
(2,4
‑
二氯苯基)乙醇的方法，以土星轮头酵母zjph1807静息细胞为催化剂转化制备(r)
‑2‑
氯
‑1‑
(2,4
‑
二氯苯基)乙醇，不仅可消除培养基成分对生物转化过程的影响，有效控制转化液的组成，提高转化产率，而且更利于转化产物的后续分离与提取，菌种易培养，含酶源细胞的制备成本低，与传统的化学还原路线相比，该方法的立体选择性高，催化剂制备成本低，反应条件温和，且转化过程环境友好。
[0009]
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是:
[0010]
本发明提供一种咪康唑手性中间体的生物合成方法，所述的方法为：以土星轮头酵母(cyberlindnera saturnus)zjph1807经发酵培养获得的湿菌体为酶源细胞，以2
‑
氯
‑1‑
(2,4
‑
二氯苯基)乙酮为底物，于ph 6.0～8.0(优选ph 7.2)的pbs缓冲液中构成转化体系，在20～45℃(优选30℃)、200rpm条件下转化2～24h(优选5～24h，更优选为12h)，反应结束后，即得含有所述咪康唑手性中间体的转化液，所述咪康唑手性中间体即(r)
‑2‑
氯
‑1‑
(2,4
‑
二氯苯基)乙醇；所述湿菌体的用量以pbs缓冲液的体积计为50～200g/l(优选80g/l)，所述底物的用量以pbs缓冲液的体积计为5～10g/l(优选5g/l)；
[0011]
所述土星轮头酵母zjph1807保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号cctcc no：m2019215，保藏日期2019年3月29日，保藏地址：中国，武汉，武汉大学，邮编430072。
[0012]
注意：所述转化在通气和不通气条件下都可以发生，但是通气条件下产量更高。
[0013]
进一步，所述含有咪康唑手性中间体的转化液按如下方法纯化得到目标产物：将所述含有咪康唑手性中间体的转化液离心(在9000rpm下离心10min进行固液分离)，取上清液，加入nacl至饱和，用与所述含有咪康唑手性中间体的转化液等体积乙酸乙酯萃取3次，合并有机萃取相后，用无水na2so4干燥、除水，然后，将所得有机相上样于硅胶层析柱，再以石油醚：乙酸乙酯＝9:1(v/v)的洗脱剂洗脱，将带有目标产物的洗脱液进行抽滤，减压浓缩，得黄色油状液体即为(r)
‑2‑
氯
‑1‑
(2,4
‑
二氯苯基)乙醇产物。
[0014]
优选所述pbs缓冲液的浓度为0.1m。
[0015]
进一步，为促进还原过程中的辅酶再生，提高反应产率，所述转化体系中还添加有辅助底物，所述辅助底物为下列之一：葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、海藻糖、乙醇、甘油、异丙醇、1,2
‑
丙二醇(优选为葡萄糖、海藻糖或麦芽糖)；所述辅助底物的加入量以所述pbs缓冲液的体积计为50～200g/l(优选150g/l麦芽糖)。
[0016]
进一步，本发明所述酶源细胞按如下方法制备：(1)斜面培养：将土星轮头酵母(cyberlindnera saturnus)zjph1807接种至斜面培养基，30℃培养24h，获得斜面菌种；所述斜面培养基中各组分的终浓度组成为：葡萄糖15g/l，蛋白胨7.5g/l，酵母膏6g/l，(nh4)2so
4 3g/l，kh2po
4 1.5g/l，nacl 0.75g/l，mgso4·
7h2o 0.75g/l，琼脂粉15～20g/l(优选
20g/l)，溶剂为水，ph 6.5；
[0017]
(2)种子培养：将步骤(1)所述的斜面菌种挑取一环菌体接种至种子培养基中，25～30℃、150～250rpm培养10～24h(优选30℃、200rpm培养12h)，获得种子液；所述种子培养基中各组分的终浓度组成为：葡萄糖15g/l，蛋白胨20g/l，酵母膏10g/l，(nh4)2so
4 2g/l，kh2po
4 2g/l，nacl l g/l，mgso4·
7h2o 0.5g/l，溶剂为水，ph 6.5；
[0018]
(3)发酵培养：将步骤(2)所述的种子液以体积浓度8％的接种量接种至发酵培养基中，30℃、200rpm发酵培养32h，发酵结束后，将所得发酵液离心，所得沉淀用0.1m、ph7.5磷酸缓冲液洗涤，离心收集湿菌体，即为含酶源细胞；所述发酵培养基中各组分的终浓度组成为：葡萄糖34.36g/l，酵母膏14.89g/l，nh4cl 30.34g/l，kh2po
4 1.01g/l，cacl
2 0.11g/l，溶剂为水，ph 7.5。
[0019]
所述土星轮头酵母(cyberlindnera saturnus)zjph1807已在申请人先前专利申请(公开号：cn110283733 a，公开日：2019年9月27号)中公开，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号cctcc no：m2019215，保藏日期2019年3月29日，保藏地址：中国，武汉，武汉大学，邮编430072。
[0020]
与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：本发明利用土星轮头酵母zjph1807菌株静息细胞为催化剂，生物催化2
‑
氯
‑1‑
(2,4
‑
二氯苯基)乙酮不对称还原获得相应的(r)
‑2‑
氯
‑1‑
(2,4
‑
二氯苯基)乙醇。利用该菌株制备所得产物的光学纯度高，ee值>99.9％。在ph 7.2的磷酸缓冲液体系中，菌体加量为80g/l，加入5g/l(即22.37mm)的底物，转化12h，产物的产率为79.48％。
(四)附图说明
[0021]
图1为实施例2中内标物正十四烷(a)、底物2
‑
氯
‑1‑
(2,4
‑
二氯苯基)乙酮(b)、产物(s)
‑2‑
氯
‑1‑
(2,4
‑
二氯苯基)乙醇(c)和(r)
‑2‑
氯
‑1‑
(2,4
‑
二氯苯基)乙醇(d)标准品的气相色谱图。
[0022]
图2为实施例3土星轮头酵母zjph1807生物还原反应萃取液的气相色谱图；a：正十四烷；b：2
‑
氯
‑1‑
(2,4
‑
二氯苯基)乙酮；c：(r)
‑2‑
氯
‑1‑
(2,4
‑
二氯苯基)乙醇。
(五)具体实施方式
[0023]
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
[0024]
实施例1：湿菌体的获得
[0025]
斜面培养基组成：葡萄糖15g/l，蛋白胨7.5g/l，酵母膏6g/l，(nh4)2so43g/l，kh2po
4 1.5g/l，nacl 0.75g/l，mgso4·
7h2o 0.75g/l，琼脂粉20g/l，溶剂为水，ph 6.5；
[0026]
种子培养基组成：葡萄糖15g/l，蛋白胨20g/l，酵母膏10g/l，(nh4)2so42g/l，kh2po
4 2g/l，nacl l g/l，mgso4·
7h2o 0.5g/l，溶剂为水，ph 6.5；
[0027]
发酵培养基组成：葡萄糖34.36g/l，酵母膏14.89g/l，nh4cl 30.34g/l，kh2po
4 1.01g/l，cacl
2 0.11g/l，溶剂为水，ph 7.5。
[0028]
将土星轮头酵母(cyberlindnera saturnus)zjph1807接种至斜面培养基，30℃培养24h，获得斜面菌体。从培养成熟的斜面挑取一环菌体接入装有100ml种子培养基的250ml
摇瓶中，30℃，200rpm培养12h，得种子液，再以体积浓度8％的接种量将种子液转接到装有90ml发酵培养基的250ml摇瓶中，30℃，200rpm培养32h。培养结束后发酵液经离心分离，并用ph 7.0的磷酸缓冲液洗涤所得沉淀物，离心收集沉淀得到湿菌体细胞，备用。
[0029]
实施例2：产物的气相检测方法
[0030]
反应结束后，在转化液中加入等体积的乙酸乙酯进行萃取，萃取液中的产物和未反应的底物浓度采用气相色谱法分析，用内标法定量。气相色谱检测方法如下：气相色谱仪为agilent 7820a，色谱柱为varian cp
‑
chirasil
‑
dex手性毛细管气相色谱柱(25m
×
0.25mm
×
0.25μm，d
f
＝0.25)。以十四烷为内标物进行底物和产物的定量分析，载气为氮气，使用氢火焰离子化检测器(fid)。
[0031]
气相(gc)检测条件：载气流量2ml/min，进样量1μl分流比15:1，进样口温度250℃，检测器温度250℃，色谱柱温度160℃保持1min，再以2℃/min升温到180℃。各物质的保留时间分别为：十四烷2.4min，2
‑
氯
‑1‑
(2,4
‑
二氯苯基)乙酮5.3min，(s)
‑2‑
氯
‑1‑
(2,4
‑
二氯苯基)乙醇9.1min，以及(r)
‑2‑
氯
‑1‑
(2,4
‑
二氯苯基)乙醇9.7min，气相检测色谱图见图1。
[0032]
产率计算式为：
[0033]
y
(产率)
＝c
产物
/c
底物
×
100％
[0034]
式中，c
产物
为转化所得产物(r)
‑2‑
氯
‑1‑
(2,4
‑
二氯苯基)乙醇的质量浓度，c
底物
为反应初始时底物2
‑
氯
‑1‑
(2,4
‑
二氯苯基)乙酮的质量浓度。
[0035]
产物的光学纯度由对映体过量值(enantiomeric excess，ee)来表示：
[0036]
ee＝(c
r
‑
c
s
)/(c
r
c
s
)
×
100％
[0037]
式中，c
r
为(r)
‑2‑
氯
‑1‑
(2,4
‑
二氯苯基)乙醇的浓度，c
s
为(s)
‑2‑
氯
‑1‑
(2,4
‑
二氯苯基)乙醇的浓度。
[0038]
实施例3：转化反应温度对催化结果的影响
[0039]
将按照实施例1方法所得的1.0g湿菌体重悬于10ml pbs缓冲液(0.1m，ph 7.0)中，加入50mg底物2
‑
氯
‑1‑
(2,4
‑
二氯苯基)乙酮和1.0g辅助底物葡萄糖，于不同温度(20～45℃)下，200rpm转化24h，反应结束后采用实施例2方法分析检测，并计算得到产物(r)
‑2‑
氯
‑1‑
(2,4
‑
二氯苯基)乙醇的产率和ee值，结果见表1。
[0040]
表1转化反应温度对催化结果的影响
[0041][0042]
优选转化反应温度为30℃，在此条件下，产率为60.78％，ee值>99.9％。
[0043]
实施例4：通气条件对催化结果的影响
[0044]
将按照实施例1方法所得的1.0g湿菌体重悬于10ml pbs缓冲液(0.1m，ph 7.0)中，加入50～100mg底物2
‑
氯
‑1‑
(2,4
‑
二氯苯基)乙酮和1.0g辅助底物葡萄糖，分别采用通气条件和具塞瓶不通气条件下进行转化，于30℃，200rpm转化24h，反应结束后采用实施例2方法分析检测，并计算得到产物(r)
‑2‑
氯
‑1‑
(2,4
‑
二氯苯基)乙醇的产率和ee值，结果见表2。
[0045]
表2不同通气条件对催化结果的影响
[0046][0047][0048]
优选通气转化，在此条件下，产率为60.78％，ee值>99.9％。
[0049]
实施例5：细胞加量对催化结果的影响
[0050]
将按照实施例1方法所得的0.5～2.0g湿菌体重悬于10ml pbs缓冲液(0.1m，ph 7.0)中，加入50mg底物2
‑
氯
‑1‑
(2,4
‑
二氯苯基)乙酮和1.0g辅助底物葡萄糖，于30℃，200rpm转化24h，反应结束后采用实施例2方法分析检测，并计算得到产物(r)
‑2‑
氯
‑1‑
(2,4
‑
二氯苯基)乙醇的产率和ee值，结果见表3。
[0051]
表3细胞加量对催化结果的影响
[0052][0053]
优选细胞加量为0.8g，在此条件下，产率为63.54％，ee值>99.9％
[0054]
实施例6：缓冲液初始ph值对催化结果的影响
[0055]
将按照实施例1方法所得的0.8g湿菌体重悬于10ml pbs缓冲液(0.1m，ph6.0～8.0)中，加入50mg底物2
‑
氯
‑1‑
(2,4
‑
二氯苯基)乙酮和1.0g辅助底物葡萄糖，于30℃，
200rpm转化24h，反应结束后采用实施例2方法分析检测，并计算得到产物(r)
‑2‑
氯
‑1‑
(2,4
‑
二氯苯基)乙醇的产率和ee值，结果见表4。
[0056]
表4缓冲液初始ph值对催化结果的影响
[0057][0058][0059]
优选缓冲液初始ph值为7.2，在此条件下，产率为65.79％，ee值>99.9％
[0060]
实施例7：辅助底物种类对催化结果的影响
[0061]
将按照实施例1方法所得的0.8 g湿菌体重悬于10 ml pbs缓冲液(0.1m，ph 7.2)中，加入50 mg底物2
‑
氯
‑1‑
(2,4
‑
二氯苯基)乙酮和1.0 g不同的辅助底物，于30℃，200 rpm转化24 h，反应结束后采用实施例2方法分析检测，并计算得到产物(r)
‑2‑
氯
‑1‑
(2,4
‑
二氯苯基)乙醇的产率和ee值，结果见表5。
[0062]
表5辅助底物种类对催化结果的影响
[0063][0064]
优选葡萄糖、海藻糖、麦芽糖作为辅助底物，继续考察相应的加量。
[0065]
实施例8：辅助底物加量对催化结果的影响
[0066]
将按照实施例1方法所得的0.8 g湿菌体重悬于10 ml pbs缓冲液(0.1m，ph 7.2)中，加入50 mg底物2
‑
氯
‑1‑
(2,4
‑
二氯苯基)乙酮和0.5～2.0 g不同的辅助底物，于30℃，200 rpm转化24 h，反应结束后采用实施例2方法分析检测，并计算得到产物(r)
‑2‑
氯
‑1‑
(2,4
‑
二氯苯基)乙醇的产率和ee值，结果见表6。
[0067]
表6辅助底物加量对催化结果的影响
[0068][0069]
优选1.5g的麦芽糖加量，在此条件下，产率为77.17％，ee值>99.9％
[0070]
实施例9：转化时间对催化结果的影响
[0071]
将按照实施例1方法所得的0.8g湿菌体重悬于10ml pbs缓冲液(0.1m，ph 7.2)中，加入50mg底物2
‑
氯
‑1‑
(2,4
‑
二氯苯基)乙酮和1.5g辅助底物麦芽糖，于30℃，200rpm转化2～24h，反应结束后采用实施例2方法分析检测，并计算得到产物(r)
‑2‑
氯
‑1‑
(2,4
‑
二氯苯基)乙醇的产率和ee值，结果见表7。
[0072]
表7转化时间对催化结果的影响
[0073][0074]
优选转化时间12h，在此条件下，产率为79.48％，ee值>99.9％
[0075]
对比例1：近平滑假丝酵母(candida parapsilosis)zjph1305生物催化制备(r)
‑2‑
氯
‑1‑
(2,4
‑
二氯苯基)乙醇的转化能力考察
[0076]
(1)近平滑假丝酵母(candida palrapsilosis)zjph1305，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2013年11月8日，地址：中国，武汉，武汉大学，保藏编号：cctcc no：m2013559。该菌种己在先前的专利申请(公开号：cn103849574a，公开日：2014年6月11日)中公开。菌种的培养方法和酶源细胞的制备过程依据先前的专利申请(公开号：cn 103849574 a，公开日：2014年6月11日)。
[0077]
(2)生物催化制备咪康唑手性中间体
[0078]
10ml pbs缓冲液(0.1m，ph 7.0)中加入1.0g近平滑假丝酵母(candida parapsilosis)zjph1305湿菌体，加入11.3mg底物2
‑
氯
‑1‑
(2,4
‑
二氯苯基)乙酮，加入1.0g的辅助底物葡萄糖，于30℃，200rpm转化24h，反应结束后采用实施例2方法分析检测，并计算得到产物(r)
‑2‑
氯
‑1‑
(2,4
‑
二氯苯基)乙醇的产率和ee值。
[0079]
结论：近平滑假丝酵母(candida palrapsilosis)zjph1305催化得到(r)
‑2‑
氯
‑1‑
(2,4
‑
二氯苯基)乙醇的产率为15.56％，ee值为45.61％。
[0080]
对比例2：热带假丝酵母(candida tropicalis)104生物催化制备咪康唑手性中间体的转化能力考察
[0081]
(1)热带假丝酵母(candida tropicalis)104，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2013年11月8日，地址：中国，武汉，武汉大学，保藏编号:cctcc no:m 209034，保藏日期:2009年2月27日。该菌种己在先前的专利申请(公开号：cn 101519674a，公开日：2009年9月2日)中公开。菌种的培养方法和酶源细胞的制备过程依据先前的专利申请(公开号：cn 101519674a，公开日：2009年9月2日)。
[0082]
(2)生物催化制备咪康唑手性中间体
[0083]
10ml pbs缓冲液(0.1m，ph 7.0)中加入1.0g热带假丝酵母(candida tropicalis)104湿菌体，加入11.3mg底物2
‑
氯
‑1‑
(2,4
‑
二氯苯基)乙酮，加入1.0g的辅助底物葡萄糖，于30℃，200rpm转化24h，反应结束后采用实施例2方法分析检测，并计算得到产物(r)
‑2‑
氯
‑1‑
(2,4
‑
二氯苯基)乙醇的产率和ee值。
[0084]
结论：热带假丝酵母(candida tropicalis)104催化得到(r)
‑2‑
氯
‑1‑
(2,4
‑
二氯
苯基)乙醇的产率仅为9.4％，ee值为99％。
[0085]
对比例3：土星轮头酵母(cyberlindnera saturnus)zjph1807生物催化2
‑
氯
‑1‑
(3,4
‑
二氟苯基)乙酮能力考察
[0086]
(1)2
‑
氯
‑1‑
(3,4
‑
二氟苯基)乙酮的结构式为：
[0087][0088]
(2)2
‑
氯
‑1‑
(3,4
‑
二氟苯基)乙酮及其对应醇的检测方法
[0089]
气相色谱仪为agilent 7820a，色谱柱为varian cp
‑
chirasil
‑
dex手性毛细管气相色谱柱(25m
×
0.25mm
×
0.25μm，d
f
＝0.25)。以十二烷为内标物进行底物和产物的定量分析，载气为氮气，使用氢火焰离子化检测器(fid)。气相(gc)检测条件：载气流量2ml/min，进样量1μl，分流比15:1，进样口温度260℃，检测器温度280℃，色谱柱温度120～165℃；升温速度：5℃/min，165℃保持1min。各物质的保留时间分别为：底物5.1min；r
‑
构型产物8.4min；s
‑
构型产物7.9min；十二烷2.7min。
[0090]
(2)生物转化2
‑
氯
‑1‑
(3,4
‑
二氟苯基)乙酮
[0091]
10ml pbs缓冲液(0.1m，ph 7.0)中加入1.0g土星轮头酵母(cyberlindnera saturnus)zjph1807湿菌体，加入9.5mg底物2
‑
氯
‑1‑
(3,4
‑
二氟苯基)乙酮，加入1.0g的葡萄糖作为辅助底物，30℃，200rpm转化24h，反应结束后采用本实施例(2)方法分析检测产物2
‑
氯
‑1‑
(3,4
‑
二氟苯基)乙醇的产率和ee值。
[0092]
结论：土星轮头酵母(cyberlindnera saturnus)zjph1807生物催化2
‑
氯
‑1‑
(3,4
‑
二氟苯基)乙酮制备(r)
‑2‑
氯
‑1‑
(3,4
‑
二氟苯基)乙醇的产率为73.1％，ee值为56.6％。