一种提高氨基酸产生菌生产能力的方法与流程

v.f.wendisch,microbial cell factories,2013.12.)。zhang,y.等人以谷氨酸棒杆菌atcc13032为出发菌株，从头通过理性设计将g446a点突变引入基因组的prob基因解除l-脯氨酸的反馈抑制，敲除(失活)脯氨酸脱氢酶(编码基因puta)阻断l-脯氨酸到谷氨酸的转化，替换顺头乌酸酶(编码基因acn)的启动子并将起始密码子从ttg更换为atg增加α-酮戊二酸通路流量，使用质粒形式用ptac启动子过表达probg446a构建了一株l-脯氨酸高产菌株pro-6，分批补料发酵60h产l-脯氨酸66.43g/l(zhang,y.,et al.,biotechnol biofuels,2017.10:p.169.)。jiang y.等人使用crispr介导的ssdna重组工具对谷氨酸棒杆菌atcc13032 prob的g149位点进行饱和突变，筛选得到了一系列抗l-脯氨酸反馈抑制菌株谷氨酸棒杆菌atcc13032probg149k，并证明prob g149位点突变为赖氨酸k时效果最好，96孔板发酵l-脯氨酸产量达到6.6
±
1.0g/l(jiang,y.,et al.,crispr-cpf1 assisted genome editing of corynebacterium glutamicum.nature communications,2017.8.)。
6.通过基因工程手段获得更高产量的l-脯氨酸生产菌株对于提高l-脯氨酸生产的效益具有重要意义。


技术实现要素：

7.为了构建一株产量更高的l-脯氨酸生产菌株，本发明利用基因工程技术来改造谷氨酸棒杆菌，通过增强与l-脯氨酸生产相关的基因，弱化分支代谢途径，提高辅因子nadph水平，获得一株高产l-脯氨酸的菌株zqjy-9，从而提升了l-脯氨酸的生产能力，降低生产成本，具有广阔的工业化应用前景。基于相同的原理，上述方法还可以应用于其他氨基酸产生菌，以便提高其他氨基酸的生产能力。具体而言，本发明包括如下技术方案：
8.一种提高氨基酸产生菌生产能力的方法，其包括下述步骤：使该氨基酸产生菌的染色体上编码α-酮戊二酸脱氢酶复合物的elo亚基的odha基因的调控区发生突变和/或缺失。
9.上述氨基酸选自l-谷氨酸、l-脯氨酸、l-羟脯氨酸、l-精氨酸、l-瓜氨酸、l-鸟氨酸及其它l-谷氨酸衍生物。
10.上述氨基酸产生菌选自大肠杆菌、谷氨酸棒状杆菌、嗜乙酰乙酸棒杆菌、钝齿棒杆菌、北京棒杆菌、停滞棒杆菌、产氨棒杆菌等棒杆菌，优选是谷氨酸棒状杆菌，更优选是谷氨酸棒杆菌atcc13032或其衍生菌株。
11.优选上述方法中，所述odha基因的阅读框起始密码子之前第11至第15个碱基的核糖体结合rbs区域的碱基序列aggcg被其它碱基序列取代。
12.上述的其它碱基序列选自下组：agagg、tgagg、ggagg、cgagg、gaagg。
13.在一种实施方式中，上述odha基因的调控区发生缺失是指odha基因的阅读框起始密码子之前的序列发生缺失，在3
’-
端包含起始密码子gtg的所述序列选自下组：
14.aataaaccctcaagaagcaagggagagtacctgccgtg(seq id no:1)；
15.aataaaccctcaagaagcaaggtaggagtacctgccgtg(seq id no:2)；
16.aataaaccctcaagaagcaagaggagtacctgccgtg(seq id no:3)；
17.aataaaccctcaagaagcagaggagtacctgccgtg(seq id no:4)；
18.aataaaccctcaagaagcaagagaggagtacctgccgtg(seq id no:5)；
19.aataaaccagaagcaaggaaaagaggcgagtacctgccgtg(seq id no:6)。
20.这些序列seq id nos:1-6在3
’-
端都包含有起始密码子gtg。
21.优选地，上述方法包括下述步骤：所述odha基因的阅读框起始密码子之前的序列变成seq id no:2；并且使氨基酸产生菌的染色体上发生puta基因失活(例如基因全部或部分删除、或阅读框内突变终止密码子)；gnd*(s361f)和zwf*(a243t)基因突变；gdh基因强化(例如更换启动子或增加拷贝数)；avta基因失活(例如基因全部或部分删除、或阅读框内突变终止密码子)；prob*(g149k)基因突变；prob*(g149k)基因以游离质粒pxmj19表达，并置于组成型启动子peftu后，例如以重组质粒pxmj19-peftu::probg149k表达，该重组质粒的核苷酸序列为seq id no:7。
22.在一种实施方式中，上述puta基因失活是编码区第60位精氨酸突变为终止密码子；所述gdh基因强化是将天然启动子替换为强启动子peftu；所述avta基因失活是将编码区第63位亮氨酸突变为终止密码子。
23.上述方法尤其可用于l-脯氨酸生产菌的改造和基因工程菌构建。
24.具体来说，本发明提供了一种提高l-脯氨酸产生菌生产能力的方法，包括以下步骤：
25.a.以l-脯氨酸产生菌为出发菌株，进行puta*(r60 stop codon(即编码区第60位精氨酸突变为终止密码子))、gnd*(s361f)和zwf*(a243t)基因突变，并将gdh的启动子更换为peftu以使gdh基因过表达，获得gdh基因增强菌株；
26.b.失活步骤a中所得的gdh基因增强菌株中的基因avta*(l63 stop codon(即编码区第63位亮氨酸突变为终止密码子))，获得avta基因失活菌株；
27.c.调控步骤b中所得的avta基因失活菌株中基因odha的表达，获得odha表达调控菌株；
28.d.构建包含过表达出发菌株中基因突变体prob*(g149k)的重组质粒pxmj19-peftu::probg149k，其核苷酸序列为seq id no:7；
29.e.将步骤d中所述重组质粒转化到步骤c中所得的odha表达调控菌株中，获得基因工程菌。
30.上述步骤a中的puta、gnd和zwf基因突变可以是其中一个基因突变、其中两个基因突变、或者三个基因同时突变。
31.上述步骤a的作用是增强l-脯氨酸产生菌比如谷氨酸棒杆菌的l-脯氨酸代谢途径中辅因子nadph水平，阻断l-脯氨酸的降解，增加谷氨酸合成的通量，获得基因增强菌株。
32.上述步骤b的作用是降低l-脯氨酸代谢途径中的分支途径丙氨酸的合成。
33.上述步骤c的作用是微调代谢途径中的tca循环。
34.上述步骤d的作用是将基因突变体prob*(g149k)以质粒的形式在步骤c中所述的基因弱化菌株中表达。
35.在一种实施方式中，步骤a中所述的l-脯氨酸产生菌是谷氨酸棒杆菌atcc13032或其衍生菌株。
36.例如，所述谷氨酸棒杆菌atcc13032的衍生菌株可以是文献jiang,y.,et al.,crispr-cpf1 assisted genome editing of corynebacterium glutamicum.nature communications,2017.8中报道的谷氨酸棒杆菌atcc13032probg149k。
37.当谷氨酸棒杆菌atcc13032probg149k作为出发菌株时，步骤a获得的gdh基因增强
菌株的基因型可以为atcc13032 probg149k(δputa,p
eftu
::gdh,gnds361f,zwfa243t)；
38.步骤b获得的avta基因失活菌株的基因型为atcc13032 probg149k(δputa,p
eftu
::gdh,gnds361f,zwfa243t,δavta)；
39.步骤c获得的odha表达调控菌株的基因型为atcc13032 probg149k(δputa,p
eftu
::gdh,gnds361f,zwfa243t,δavta,odha(调控区突变))；
40.步骤e获得的基因工程菌的基因型为atcc13032 probg149k(δputa,p
eftu
::gdh,gnds361f,zwfa243t,δavta,odha(调控区突变))/pxmj19-peftu::probg149k。
41.在一种实施方式中，步骤c通过将其odha基因的调控区突变和/或缺失而实现。例如，所述odha基因的调控区序列(在3
’-
端包含起始密码子gtg)可以为：
42.aataaaccctcaagaagcaaggtaggagtacctgccgtg(seq id no:2)。
43.根据本发明的第二个方面，提供了一种基因工程菌，其按照上述的方法构建。比如是基因型为atcc13032 probg149k(δputa,p
eftu
::gdh,gnds361f,zwfa243t,δavta,odha(调控区突变))/pxmj19-peftu::probg149k的谷氨酸棒杆菌，本文中称为zqjy-9，该菌株现保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no:m 2020060。
44.根据本发明的第三个方面，提供了上述基因工程菌在生产l-脯氨酸中的应用。
45.优选通过上述基因工程菌的发酵来生产l-脯氨酸。
46.当上述基因工程菌是谷氨酸棒杆菌atcc13032或其衍生菌株时，发酵培养基组成如下：(nh4)2so
4 20g/l，kh2po
4 0.5g/l，k2hpo
4 0.5g/l，mgso
4 250mg/l，feso4·
7h2o 10mg/l，mnso4·
h2o 10mg/l，znso4·
7h2o 1mg/l，cuso
4 0.2mg/l，nicl2·
6h2o 0.02mg/l，生物素0.2mg/l，40g/l葡萄糖。
47.种子液培养基组成如下：(nh4)2so
4 5g/l，尿素5g/l，3-吗啉丙磺酸(mops)21g/l，k2hpo
4 1g/l，kh2po
4 1g/l，mgso
4 250mg/l，cacl
2 10mg/l，微量元素溶液1ml/l，生物素0.2mg/l，原儿茶酸0.3mg/l，玉米浆2g/l和葡萄糖60g/l，ph 7.0，其中，微量元素溶液组成如下：feso4·
7h2o 16.4g/l，mnso4·
h2o 100mg/l，cuso
4 200mg/l，znso4·
7h2o 1g/l，nicl2·
6h2o 20mg/l，用hcl调节至ph 1.0以便溶化上述组分。
48.优选地，上述发酵还可以包含如下组成的补料培养基：葡萄糖800g/l。
49.在一种实施方式中，当上述谷氨酸棒杆菌atcc13032或其衍生菌株进行摇瓶培养时，摇瓶发酵培养基(命名为qfys)组成如下：葡萄糖
·
h2o100 g/l，玉米浆20g/l，(nh4)2so
4 30g/l，mgso4·
7h2o 0.4g/l，kh2po
4 1.2g/l，尿素2g/l，caco
3 30g/l，ph 7.2。
50.摇瓶种子液培养基为：bhisg，bhi 37g/l，d-山梨糖醇91g/l，(nh4)2so
4 10g/l，葡萄糖20g/l。
51.本发明的方法能够将l-脯氨酸生产菌的l-脯氨酸生产能力提高至少3倍。本发明的构建的工程菌cctcc no:m 2020060在发酵后，l-脯氨酸的产量高达119.90g/l，具有工业应用前景。
52.本发明构建的l-脯氨酸高产基因工程菌的拉丁学名是corynebacterium glutamicum，中文名称是谷氨酸棒杆菌，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期是2020年3月29日，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内的武汉大学保藏中心，保藏编号为cctcc no:m 2020060。
附图说明
53.图1为质粒pxmj19-peftu::probg149k的示意图。
具体实施方式
54.本文中的术语“l-脯氨酸基因工程生产菌”、“l-脯氨酸生产菌”、“基因工程菌”、“l-脯氨酸基因工程生产菌”表示相同的意义，尤其是指l-脯氨酸生产菌zqjy-9即保藏菌株cctcc no:m 2020060。
55.本发明的l-脯氨酸生产菌的出发菌株或称原始菌株、野生型(wt)菌株是谷氨酸棒杆菌atcc13032，术语“谷氨酸棒杆菌”、“谷氨酸棒杆菌atcc13032”、“atcc13032”表示相同的意义。
56.本发明中涉及的基因的名称解释如下：
57.proa：谷氨酸-5-半醛脱氢酶
58.prob：γ-谷氨酸激酶
59.proc：吡咯啉-5-羧酸还原酶
60.ocd：鸟氨酸环脱氨酶
61.puta：脯氨酸脱氢酶
62.acn：顺头乌酸酶
63.gnd：6-磷酸葡糖酸脱氢酶
64.zwf：葡萄糖-6-磷酸-脱氢酶
65.gdh：谷氨酸脱氢酶
66.avta：缬氨酸-丙酮酸氨基转移酶
67.odha：α-酮戊二酸脱氢酶
68.在本文中，为了描述简便，有时会将某种蛋白比如6-磷酸葡糖酸脱氢酶gnd与其编码基因(dna)gnd名称混用，本领域技术人员应能理解它们在不同描述场合表示不同的物质。本领域技术人员根据语境和上下文容易理解它们的含义。例如，对于gnd，用于描述6-磷酸葡糖酸脱氢酶功能或类别时，指的是蛋白质；在作为一种基因描述时，指的是编码该gnd的基因。显然，基因突变gnd*(s361f)是指编码突变体gnds361f的基因突变。
69.众所周知地，基因名称后标注星号“*”代表该基因的变体，比如：prob*(g149k)是指第149位甘氨酸(g)突变成赖氨酸(k)的γ-谷氨酸激酶的基因prob的突变体；gnd*(s361f)是指第361位丝氨酸(s)突变成苯丙氨酸(f)的6-磷酸葡糖酸脱氢酶的基因gnd的突变体；zwf*(a243t)是指第243位丙氨酸(a)突变成苏氨酸(t)的葡萄糖-6-磷酸-脱氢酶的基因zwf的突变体；puta*(r60 stop codon)指第60位精氨酸(r)突变成终止密码子失活脯氨酸脱氢酶的puta突变体；avta*(l63 stop codon)指第63位亮氨酸(l)突变成终止密码子失活脯氨酸脱氢酶的avta突变体。
70.本发明在设计基因工程菌的构建方案中，根据谷氨酸棒杆菌l-脯氨酸的代谢途径，在谷氨酸棒杆菌atcc13032probg149k上构建了一系列突变体，如：基因puta、gnd、zwf、avta的突变或失活；gdh的增强；odha的调控。其中puta的失活阻断了l-脯氨酸的降解，gnd和zwf的突变提高了辅因子nadph的水平，avta的失活降低了副产物丙氨酸的合成，gdh的增强增加了l-脯氨酸生物合成前体谷氨酸的供应，odha的调控微调了tca循环，增加l-脯氨酸
生物合成通量，在以上突变体中使用质粒形式过表达prob*(g149k)进一步增强l-脯氨酸生物合成通量从而有利于l-脯氨酸的合成，构建出了高产l-脯氨酸的工程菌株zqjy-9，保藏编号为cctcc no:m 2020060。
71.本发明中，提高l-脯氨酸产生菌生产能力的一个策略是步骤c，即，使odha基因的表达调控，是通过改变调控区序列而实现。如对rbs区域进行突变，rbs是核糖体结合位点(ribosomebinding site)的简称，是指起始密码子aug上游的一段富含嘌呤g、a的非翻译区。在rbs中有sd(shine-dalg-arno)序列，长度一般为5个核苷酸，该序列与核糖体16srrna的3’端互补配对，促使核糖体结合到mrna上，有利于翻译的起始。
72.谷氨酸棒杆菌atcc13032突变菌株的构建方法，参考jiang y.等报道的文献(jiang,y.,et al.,nature communications,2017.8)。例如，发明人从原始菌株谷氨酸棒杆菌atcc13032出发，经过多个步骤的基因改造，构建出多种基因型，不断提高l-脯氨酸的产量，最终得到具有工业应用前景的工程菌，参见表1，不同基因型菌株l-脯氨酸产量的逐步提高验证了本发明设计思路的正确。
73.表1、本发明构建的基因工程菌
[0074][0075][0076]
以下结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
[0077]
本文中涉及到多种物质的添加量、含量及浓度，其中所述的百分含量，除特别说明外，皆指质量百分含量。
[0078]
实施例
[0079]
材料和方法
[0080]
本文中的全基因合成、引物合成及测序皆由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。
[0081]
本文中的分子生物学实验包括质粒构建、酶切、感受态细胞制备、转化等主要参照《分子克隆实验指南》(第三版)，j.萨姆布鲁克，d.w.拉塞尔(美)编著，黄培堂等译，科学出版社，北京，2002)进行。比如感受态细胞转化方法及感受态制备方法均参照《分子克隆实验指南》(第三版)第1章96页进行。必要时可以通过简单试验确定具体实验条件。
[0082]
主要培养基及缓冲液：
[0083]
lb培养基：10g/l胰蛋白胨，5g/l酵母提取物，10g/l氯化钠。(固体培养基另加20g/l琼脂粉。)
[0084]
bhis培养基：37g/l bhi，91g/l山梨醇。(固体培养基另加20g/l琼脂粉。)
[0085]
bhis-suc培养基：37g/l bhi，91g/l山梨醇，200g/l蔗糖，10g/l葡萄糖。
[0086]
20
×
电转母液：80g/l甘氨酸，2％吐温80。
[0087]
以下实施例中，所述卡那霉素在培养基中的终浓度为50μg/ml，所述壮观霉素在培养基中的终浓度为100μg/ml，所述氯霉素在培养基中的终浓度为10μg/ml。
[0088]
以下实施例中使用的引物序列信息如表2所示。
[0089]
表2、引物序列
[0090]
[0091][0092]
表中，名称中的
“-
f”代表正向；
“-
r”代表反向。
[0093]
表3、基因odha表达调控所用修复模板
[0094]
[0095][0096]
注：下划线为pam序列，大写处为替换碱基。
[0097]
实施例1：构建基因puta、gnd突变和基因gdh增强的菌株zqjy-3
[0098]
1、pk18mobsacb-spec-peftu-gdh质粒的构建
[0099]
(1)用引物pk18-kan-zzz-f和pk18-ecori-r，以pk18mobsacb为模板，扩增约4.3kb的片段1，用引物pk18-crtyf-l和pk18-crtyf-r，以文献(jiang,y.,et al.,nature communications,2017.8)中报道的质粒pjys3_δcrtyf为模板，扩增约2.1kb的片段2，用引物pk18-hindiii-f和pk18-kan-qdz-r，以pk18mobsacb为模板，扩增约500bp的片段3，用引物pk18-spec-f和pk18-spec-r，从文献(jiang,y.,et al.,nature communications,2017.8)中报道的质粒pjys2_crtyf上扩增约1.2kb的壮观抗性片段4，将片段1、2、3、4进行gibson连接，转化大肠杆菌dh5α感受态细胞(上海东寰生物科技有限公司)，涂布lb-spec平板，得到质粒pk18mobsacb-spec_δcrtyf。
[0100]
(2)用引物pk18-hindiii-f/pk18-ecori-r从pk18mobsacb-spec_δcrtyf扩增骨架载体片段5，分别用引物gdh-l-f/gdh-l-r、etfu-f/etfu-r、gdh-r-f/gdh-r-r从atcc 13032基因组上扩增上下游同源臂和peftu启动子，将片段5与扩增的上下游同源臂和peftu启动子片段gibson连接，转化dh5α感受态细胞，得到质粒pk18mobsacb-spec-peftu-gdh。
[0101]
2、制备谷氨酸棒杆菌atcc13032probg149k感受态细胞
[0102]
挑取谷氨酸棒状杆菌atcc13032probg149k在bhis平板上划线，30℃恒温培养箱中过夜培养，挑取单菌落到bhis试管培养基中，在30℃，220rpm的过夜培养。接种1ml菌液到100ml的bhis液体培养基摇瓶中，恒温摇床上30℃，220rpm培养4-6h至od 600值达到1.0左右。在超净工作台上，将菌液全部转移至50ml离心管中，4℃，4500
×
g离心，弃上清，用10％甘油洗涤菌体，使菌体重悬，4℃，4500
×
g离心，重复洗涤1遍，弃上清。最后加入600μl的10％甘油，使菌体悬浮，分装到1.5ml离心管中，每90μl制备为一支感受态细胞，感受态细胞可放置在-80℃冰箱中保存。
[0103]
3、pk18mobsacb-spec-peftu-gdh电转化atcc13032probg149k感受态细胞
[0104]
取1μg以上质粒pk18mobsacb-spec-peftu-gdh到谷氨酸棒状杆菌atcc13032probg149k感受态细胞中，混匀后转移至电转杯中，在25uf、2.5kv、200ω的条件下进行电击，电击时间为5.0ms，电击后立即转入900μl 46℃预热的bhis液体培养基中，并在46℃水浴锅中水浴6min，然后置于恒温摇床中30℃，220rpm培养1h，使菌体复苏。复苏之后取50μl菌体涂布在含壮观霉素的bhis平板上，将平板倒置在30℃恒温培养箱中培养48小时。
[0105]
4、制备atcc13032probg149k(pk18mobsacb-spec-peftu-gdh)感受态细胞
[0106]
制备方法同步骤2。
[0107]
5、pkts-ptac-be3-puta-gnd-gdh质粒的构建
[0108]
(1)用引物pkts-f(hpai)和pkts-r(kpni)-1以文献(jiang,y.,et al.,nature communications,2017.8)中报道的质粒pjys1peftu为模板，扩增约5.7kb的片段6，用引物rrnb-f(swai)-1和rrnb-r以pxmj19为模板，扩增480bp的片段7，用引物ugi-f(be3)和apobec1-r(be3)-1，以pcmw-be3为模板扩增约5.2kb片段8，用引物ptac-f-1和laciq-r以pxmj19为模板扩增约1.4kb片段9，将片段6、7、8、9进行gibson连接，转化dh5α感受态细胞，得到质粒pkts-ptac-be3。
[0109]
(2)用kpni/swai酶切pkts-ptac-be3回收约12kb的骨架片段10，合成靶向基因puta、gnd、gdh的grna阵列(array)约400bp，酶切后与片段10使用t4连接酶进行连接，转化，得到质粒pkts-ptac-be3-puta-gnd-gdh。
[0110]
6、转化质粒pkts-ptac-be3-puta-gnd-gdh到atcc13032probg149k(pk18mobsacb-spec-peftu-gdh)感受态细胞并验证
[0111]
转化方法同步骤3。复苏之后取全部菌体涂布在含卡那霉素bhis-suc平板上，将平板倒置在30℃恒温培养箱中培养48小时。挑取平板上的单菌落，分别使用引物f-sputa/r-sputa、f-sgnd/r-sgnd、f-sgdh/r-sgdh进行pcr，片段大小约2kb，将pcr片段送测序，验证正确。
[0112]
7、质粒丢失
[0113]
挑取菌落pcr验证为阳性的单菌落，接种于无抗生素的bhis试管中，37℃过夜培养；次日菌液划线接种于bhis平板上，37℃过夜培养；次日挑取bhis平板上的转化子，分别点板bhis平板和含卡那霉素的bhis平板，倒置在30℃恒温培养箱中培养24小时。若能在bhis平板上生长而不能在含卡那霉素的bhis平板上生长，表明质粒丢失，得到基因型为atcc13032 probg149kδputa p
eftu
::gdh gnds361f的菌株zqjy-3。
[0114]
实施例2：构建基因zwf失活的菌株zqjy-4
[0115]
1、失活质粒pk18mobsacb-zwfa243t的构建
[0116]
使用引物pk18-f和pk18-r，以pk18mobsacb为模板，扩增约5.6kb的载体片段11，用引物zwf-al-f/zwf-al-r和引物zwf-ar-f/zwf-ar-r分别以atcc 13032基因组为模板，扩增约1kb的片段12和13，将片段11、12、13进行gibson连接，转化dh5α感受态细胞，得到质粒pk18mobsacb-zwfa243t。
[0117]
2、制备zqjy-3感受态细胞。
[0118]
制备方法同实施例1步骤2。
[0119]
3、转化质粒pk18mobsacb-zwfa243t到zqjy-3感受态细胞
[0120]
转化方法同实施例1步骤3。复苏之后取全部菌体涂布在含卡那霉素的bhis平板上，将平板倒置在30℃恒温培养箱中培养48小时。
[0121]
4、sacb蔗糖反筛
[0122]
挑取含卡那霉素的bhis平板上的转化子，接种到无抗性的bhis试管培养基中，在恒温摇床中30℃，220rpm培养24小时，使其发生双交换。将菌体稀释1000倍后涂布在含20％蔗糖的bhis-suc平板上，倒置在30℃恒温培养箱中培养48小时。挑取bhis-suc平板转化子，分别点板bhis平板和含卡那霉素的bhis平板，倒置在30℃恒温培养箱中培养24小时。使用引物f-szwf/r-szwf进行pcr测序扩增验证在bhis平板生长而在含卡那霉素的bhis平板不能生长的转化子，挑取阳性转化子到4ml的bhis试管培养基中，在恒温摇床上30℃，220rpm培养24小时，使用20％甘油保菌。得到基因型为atcc13032probg149kδputa p
eftu
::gdh gnds361f zwfa243t的zqjy-4菌株。
[0123]
实施例3：构建基因avta失活的菌株zqjy-6
[0124]
1、质粒pjys2_avta的构建
[0125]
使用引物avtaspc-f和avtaspc-r，以pjys2_crtyf为模板扩增片段后，直接转化dh5α感受态细胞，涂布含有壮观霉素的bhis固体平板，得到质粒pjys2_avta。
[0126]
2、合成修复模板avta(taa)59
[0127]
修复模板avta(taa)59序列为：
[0128]
cagagatcgctcttcgctcgggtccttaataatacaccgaggtgattggtgatcgtgag
[0129]
3、制备zqjy-4感受态细胞。
[0130]
制备方法同实施例1步骤2。
[0131]
4、转化质粒pjys2_avta和修复模板avta(taa)59到zqjy-4感受态细胞
[0132]
取1μg上述质粒pjys2_avta和1～10μg修复模板avta(taa)59，混匀后加入到谷氨酸棒状杆菌zqjy-4感受态细胞中，混匀后转移至电转杯中，转化条件同实施例1步骤3。复苏之后取全部菌体涂布在含壮观的bhis平板上，将平板倒置在30℃恒温培养箱中培养48小时。挑取平板上的单菌落使用引物f-savta/r-savta进行pcr，片段大小约2kb，将pcr片段送测序，验证正确。
[0133]
5、质粒丢失
[0134]
质粒丢失方法同实施例1步骤7，得到基因型为atcc13032 probg149kδputa p
eftu
::gdh gnds361f zwfa243tδavta的菌株zqjy-6。
[0135]
实施例4：构建基因odha表达调控的菌株zqjy-7
[0136]
1、质粒pjys2_odha的构建
[0137]
使用引物sgrna-odha-tttc-f和sgrna-odha-tttc-r，以pjys2_crtyf为模板扩增片段后，直接转化dh5α感受态细胞，涂布含有壮观霉素的bhis固体平板，得到质粒pjys2_odha。
[0138]
2、合成odha所用修复模板
[0139]
odha基因的rbs为aggcg(pfeifer-sancar,k.,et al.,bmc genomics,2013.14(1):p.888.)，我们将rbs库设计为ngg/ang，共31条引物(表3)。gtg为odha的起始密码子，以起始密码子上游第18位到第21位的gaaa为pam序列，引物中将第二个a协同突变为t(表3)。
[0140]
合成表3中的odha所用修复模板共31条引物，合成引物配制浓度为2μg/μl。
[0141]
3、制备zqjy-6感受态细胞。
[0142]
制备方法同实施例1步骤2。
[0143]
4、转化质粒pjys2_odha和修复模板到zqjy-6感受态细胞并发酵验证
[0144]
取前15条引物，每管修复引物各0.5μl混匀，与1μg以上质粒pjys2_avta加入到谷氨酸棒状杆菌zqjy-6感受态细胞中，混匀后转移至电转杯中，转化条件同实施例1步骤3。复苏之后取全部菌体涂布在含壮观的bhis平板上，将平板倒置在30℃恒温培养箱中培养48小时；第二批16条引物转化方法同前。pcr测序引物为f-sodha/r-sodha。l-脯氨酸产量提高的发酵数据以及相应odha基因的调控区序列见表4，产量最高的菌株产量为12.80
±
0.18g/l，其odha基因的rbs区域发生缺失，且其它调控区发生突变，序列为：aataaaccctcaagaagcaaggtaggagtacctgccgtg(seq id no:2)(包括3
’-
端起始密码子gtg)。
[0145]
表4、l-脯氨酸产量提高的菌株产量及相应odha基因的调控区序列
[0146][0147][0148]
5、质粒丢失
[0149]
质粒丢失方法同实施例1步骤7，将产量最高的菌株丢失质粒后得到基因型为atcc13032 probg149kδputa p
eftu
::gdh gnds361f zwfa243tδavtaodha(调控区突变)的菌株zqjy-7。
[0150]
实施例5：构建过表达基因突变体prob*(g149k)的菌株zqjy-9
[0151]
1、重组质粒pxmj19-peftu::probg149k的构建
[0152]
用hpai/ecori酶切pxmj19，得到约5.3kb大片段14；使用引物prob(peftu)-f/prob(rrnb)-r，以zqjy-1基因组为模板，扩增约1kb片段15；使用引物peftu(hpai)-f/peftu(prob)-r，以zqjy-1基因组为模板，扩增约300bp片段16，将片段14、15、16进行gibson连接，转化dh5α感受态细胞，得到质粒pxmj19-peftu::probg149k。
[0153]
2、制备zqjy-7感受态细胞。
[0154]
制备方法同实施例1步骤2。
[0155]
3、转化质粒pxmj19-peftu::probg149k到zqjy-7感受态细胞
[0156]
转化方法同实施例1步骤3。复苏之后取50μl菌体涂布在含卡那霉素的bhis平板上，将平板倒置在30℃恒温培养箱中培养48小时。挑取单克隆到4ml的bhis试管培养基中，在恒温摇床上30℃，220rpm培养24小时，使用20％甘油保菌。得到基因型为atcc13032probg149kδputa p
eftu
::gdh gnds361f zwfa243tδavtaodha(调控区突变)/pxmj19-peftu::probg149k的zqjy-9菌株，保藏编号为cctcc no:m 2020060。
[0157]
实施例6：l-脯氨酸基因工程菌zqjy-9摇瓶发酵生产l-脯氨酸
[0158]
l-脯氨酸基因工程菌摇瓶发酵生产l-脯氨酸的方法如下：
[0159]
取l-脯氨酸基因工程菌zqjy-9甘油菌，划线bhis平板，将平板倒置在30℃恒温培养箱中培养48小时。挑取1cm2的菌落接种到含有15ml摇瓶种子培养基的250ml摇瓶中，30℃，220rpm培养20h左右，将1ml摇瓶种子液转接到含有20ml摇瓶发酵培养基qfys的500ml锥形瓶中，30℃，220rpm培养，发酵过程中使用氨水调节ph。发酵结束后，利用hplc测定发酵液上清中l-脯氨酸含量。l-脯氨酸基因工程菌zqjy-9的摇瓶发酵产量为19.68
±
0.22g/l。
[0160]
hplc检测方法如下：
[0161]
检测方法：使用通过邻苯二甲醛-9-芴甲基氯甲酸酯(o-phthalaldehyde-9-fluorenylmethyl chloroformate,opa-fmoc)柱前衍生高效液相色谱法来测定发酵液中l-脯氨酸含量。
[0162]
色谱条件：agilent 1200液相色谱，eclipse plus c18柱，3.5μm，4.6
×
100mm柱子，dad g1321a检测器，检测波长uv 338nm，10nm(带宽)，参比390nm，20nm(带宽)，流速：1ml/min，柱温：40℃。
[0163]
衍生剂配制：
[0164]
硼酸缓冲液：0.4m硼酸缓冲液，准确称取6.183g硼酸，溶于超纯水中，用10m naoh溶液调至ph 10.2，定容至250ml容量瓶中；
[0165]
衍生剂1：准确称取500mg邻苯二甲醛(opa)固体，加5ml无水乙醇，加500μl巯基丙酸，用0.4m ph 10.2的硼酸缓冲液定容至50ml。此溶液最好现配现用；
[0166]
衍生剂2：fmoc/乙腈溶液：5g/l
[0167]
流动相配制：
[0168]
流动相a：10mm na2hpo4 10mm na2b4o7盐酸调ph至8.2，0.22μm滤膜过滤后备用；
[0169]
流动相b：acn:meoh:h2o＝45:45:10,定容1l备用，试剂纯度为hplc级。
[0170]
梯度洗脱程序如表5：
[0171]
表5、hplc梯度洗脱程序
[0172]
时间(min)流动相b(％)流动相a(％)流速(ml/min)02981.022981.015.557431.015.657431.023.510001.0252981.0
[0173]
实施例7：l-脯氨酸基因工程菌zqjy-9发酵罐发酵生产l-脯氨酸
[0174]
l-脯氨酸基因工程菌发酵罐发酵生产l-脯氨酸的方法如下：
[0175]
在3l的bioflo 110发酵罐上进行补料分批发酵。取l-脯氨酸基因工程菌zqjy-9甘油菌，划线bhis平板，将平板倒置在30℃恒温培养箱中培养48小时。从平板上挑取2cm2的菌落接种到含有120ml种子液培养基的2l摇瓶中，30℃，230rpm培养26h后，按照10％的接种量接种到含有1.2l发酵液的发酵罐中。发酵温度控制在32℃，浓氨水控制ph为6.9，do为30％，初始转速200rpm。通过使用800g/l葡萄糖补料培养基进行补料，使得发酵罐培养基中葡萄糖浓度控制在5
±
5g/l的范围内。发酵80h结束后，利用hplc测定发酵液上清中l-脯氨酸含量。zqjy-9的l-脯氨酸产量在80h达到119.90g/l，转化率为0.20g/g(l-脯氨酸/葡萄糖)，产率为1.581g/l/h，最终的l-丙氨酸产量仅为5.45g/l，zqjy-9在76h时达到最高l-脯氨酸产量为120.18g/l。
[0176]
上述实验可见，本发明构建的基因突变菌株zqjy-9的l-脯氨酸生产能力比菌株atcc13032 probg149k(即zqjy-1)提高了至少3倍，在发酵过程中能够实现l-脯氨酸的有效积累，发酵罐发酵后，l-脯氨酸的产量高达119.90g/l，具有工业化应用前景。