用于全血中稀有细胞高效分离、捕获和回收的方法与流程

1.本发明涉及细胞分离技术领域，特别是涉及一种用于全血中稀有细胞高效分离、捕获和回收的方法。


背景技术：

2.血液中特定的稀有细胞分离富集具有十分重要的医用价值，如干细胞在治疗不同类型疾病、医美等领域应用巨大潜力；循环肿瘤细胞(ctcs)的计数和特性分析可作为乳腺癌转移检测、复发监测、疗效及个性化治疗预后判断的重要依据等。但是血液中干细胞和循环肿瘤细胞(ctcs)含量极少，ctcs含量为血细胞的1/100万，干细胞含量仅占血细胞的0.01％。为了实现干细胞和ctcs等稀有细胞的大规模应用，需从全血中快速高效地分离稀有细胞。
3.目前多采用微流控技术实现血液中稀有细胞的分离，主要分成主动分离和被动分离。相较于利用额外动力场(电场、磁场、声波和光)来实现细胞分离的主动分离方式，依靠设计结构和流体动力学实现分离的被动分离方式，具有不需要额外力场和附加控制系统、易于制造和组装、系统简单易操作等优点而被广泛应用。其中，基于目标细胞大小分离的过滤式微流控芯片设计最为简单且使用相对灵活，是目前常用的分离方式。
4.目前基于过滤的微流控芯片中主要有堰、柱、交叉流和膜四种方式，但是其均易出现堵塞且堵塞后会影响后续的分离效率，较难捕获稀有细胞对其分析，同时较难实现芯片内过滤目标细胞的高效回收。


技术实现要素：

5.本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种用于全血中稀有细胞高效分离、捕获和回收的方法,能够对全血中的目标细胞进行高效的分离、捕获和回收。
6.根据本发明的第一方面实施例的一种用于全血中稀有细胞高效分离、捕获和回收的方法，包括：
7.通道管，所述通道管设有第一管口和第二管口；
8.第一入口，与所述第一管口连通；
9.第二入口，与所述第一管口连通；
10.第三入口，与所述第二管口连通；
11.出口，与所述第二管口连通；
12.目标液通道，所述目标液通道设置在所述通道管内，所述目标液通道与所述第一管口连通，所述目标液通道的通道管壁与所述通道管的内壁之间围成侧液通道,所述侧液通道与所述第二管口连通，所述目标液通道的通道壁上设有若干连通所述侧液通道的微孔，所述微孔的孔径小于目标细胞的体积；
13.以及以下步骤：
14.步骤s1:目标细胞分离富集,所述第二入口、所述第三入口关闭，所述第一入口、所述出口打开，从所述第一入口注入样品液，滤液从所述出口排出，目标细胞被俘获于所述目标液通道中，获初级目标细胞；
15.步骤s2:目标细胞冲洗，所述第一入口、所述第三入口关闭，所述第二入口、所述出口打开，从所述第二入口注入冲洗液，冲洗液从所述出口排出，完成对目标细胞的冲洗；
16.步骤s3:目标细胞的回收，所述第二入口、所述出口关闭，所述第一入口、所述第三入口打开，从所述第三入口注入反向冲洗液，反向冲洗液混合所述目标液通道的目标细胞从所述第一入口流出，从而获得目标细胞。
17.根据本发明实施例的全血中稀有细胞分离、捕获和回收的芯片，至少具有如下有益效果：
18.在目标细胞分离富集时，第二入口和第三入口关闭，样本液经第一入口、第一管口流入目标液通道，样本液中废液(液体及尺寸较小背景细胞等)经微孔流入侧液通道，随后经第二管口、出口流出，完成对样本中的背景细胞进行高效去除，使得目标细胞被俘获于目标液通道中，获初级目标细胞。
19.随后第一入口关闭，第二入口打开，正向冲洗液经第一入口、第一管口流入目标液通道，对目标液通道中初级目标细胞进行冲洗，冲洗废液经微孔流入侧液通道，随后经第二管口、出口流出，得到目标细胞。
20.在目标细胞回收时，第二入口和出口关闭，反向冲洗液经第三入口、第二管口后流入侧液通道和目标液通道，反向冲洗液经微孔进入目标液通道，目标细胞经第一管口、第一入口流出，从而获得目标细胞。
21.根据本发明的一些实施例，所述目标液通道包括多层通道壁，所述通道壁之间设有次级目标液通道，每层所述通道壁上均设有所述微孔，所述次级目标液通道上的微孔尺寸等于或小于上一级所述次级目标液通道的微孔尺寸，或者小于或等于上一级的目标液通道上的微孔尺寸。
22.根据本发明的一些实施例，所述通道壁由第一微柱阵列围成，所述第一微柱阵列由若干微柱间隔排列组成，间隔设置的所述微柱之间形成所述微孔。
23.根据本发明的一些实施例，所述微柱为圆角方形微柱，所述圆角方形微柱的轴线与所述第一管口和所述第二管口连线垂直设置，所述圆角方形微柱的底边与所述第一管口和所述第二管口连线的夹角为45度。
24.根据本发明的一些实施例，所述目标液通道内设有第二微柱阵列，所述第二微柱阵列由若干微柱间隔排列组成。
25.根据本发明的一些实施例，所述目标液通道所述次级目标液通道的管径由所述第一管口到所述第二管口方向逐渐减小。
26.根据本发明的一些实施例，所述侧液通道的管径由所述第一管口到所述第二管口方向逐渐减小。
27.根据本发明的一些实施例，所述第一管口与所述目标液通道的进口以及所述侧液通道的前端为相切曲线连接；
28.所述第二管口与所述目标液通道的尾端以及所述侧液通道的出口为相切曲线连接。
29.根据本发明的一些实施例，所述通道管的数量为多个，所述通道管并排设置，每个所述通道管内均设有所述目标液通道和所述侧液通道。
30.根据本发明的一些实施例，所述通道管由聚二甲基硅氧烷或有机玻璃制成。
31.本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
32.本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
33.图1为本发明实施例用于全血中稀有细胞高效分离、捕获和回收芯片结构示意图；
34.图2为本发明一实施例通道管和目标液通道及侧液通道的连接结构示意图；
35.图3为本发明一实施例通道管和多级目标液通道和侧液通道的连接结构示意图；
36.图4为图2中a部分的放大结构示意图；
37.图5为图2中b部分的放大结构示意图。
38.附图标记：
39.100、通道管；110、第一管口；120、第二管口；200、第一入口；300、第二入口；400、第三入口；500、出口；600、目标液通道；610、侧液通道；620、微孔；630、微柱；640、次级目标液通道；700、第二微柱阵列。
具体实施方式
40.下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
41.在本发明的描述中，需要理解的是，涉及到方位描述，例如上、下、前、后、左、右等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
42.在本发明的描述中，若干的含义是一个或者多个，多个的含义是两个以上，大于、小于、超过等理解为不包括本数，以上、以下、以内等理解为包括本数。如果有描述到第一、第二只是用于区分技术特征为目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量或者隐含指明所指示的技术特征的先后关系。
43.本发明的描述中，除非另有明确的限定，设置、安装、连接等词语应做广义理解，所属技术领域技术人员可以结合技术方案的具体内容合理确定上述词语在本发明中的具体含义。
44.另外，本发明各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。
45.如图1和图2所示，根据本发明实施例的用于全血中稀有细胞高效分离、捕获和回收的方法，包括：
46.通道管100，通道管100设有第一管口110和第二管口120；
47.第一入口200，与第一管口110连通；
48.第二入口300，与第一管口110连通；
49.第三入口400，与第二管口120连通；
50.出口500，与第二管口120连通；
51.目标液通道600，目标液通道600设置在通道管100内，目标液通道600与第一管口110连通，目标液通道600的通道管壁与通道管100的内壁之间围成侧液通道610,侧液通道610与第二管口120连通，目标液通道600的通道壁上设有若干连通侧液通道610的微孔620，微孔620的孔径小于目标细胞的体积；
52.以及以下步骤：
53.步骤s1:目标细胞分离富集,第二入口300、第三入口400关闭，第一入口200、出口500打开，从第一入口200注入样品液，滤液从出口500排出，目标细胞被俘获于目标液通道600中，获初级目标细胞；
54.步骤s2:目标细胞冲洗，第一入口200、第三入口400关闭，第二入口300、出口500打开，从第二入口300注入冲洗液，冲洗液从出口500排出，完成对目标细胞的冲洗；
55.步骤s3:目标细胞的回收，第二入口300、出口500关闭，第一入口200、第三入口400打开，从第三入口400注入反向冲洗液，反向冲洗液混合目标液通道600的目标细胞从第一入口200流出，从而获得目标细胞。
56.具体的，在目标细胞分离富集时，第二入口300和第三入口400关闭，样本液经第一入口200、第一管口110流入目标液通道600，样本液中废液液体及尺寸较小背景细胞等经微孔620流入侧液通道610，随后经第二管口120、出口500流出，完成对样本中的背景细胞进行高效去除，使得目标细胞被俘获于目标液通道600中，获初级目标细胞。
57.随后第一入口200关闭，第二入口300打开，正向冲洗液经第二入口300、第一管口110流入目标液通道600，对目标液通道600中初级目标细胞进行冲洗，冲洗废液经微孔620流入侧液通道610，随后经第二管口120、出口500流出，完成对目标细胞的冲洗。
58.在目标细胞回收时，第二入口300和出口500关闭，反向冲洗液经第三入口400、第二管口120后流入侧液通道610，反向冲洗液经微孔620进入目标液通道600，使得目标液通道600中的目标细胞经经第一管口110、第一入口200流出，从而获得目标细胞。
59.具体的，本实施例的芯片包括第一芯片板和第二芯片板，其中第一芯片板的表面与通道管100和目标液通道600图形一致的凹槽，第二芯片板的一面为光滑的面，将第二芯片板盖在第一芯片板的凹槽上，共同围合成封闭的通道管100和目标液通道600。
60.在具体实施例中，将一定浓度的小鼠胚胎成纤维细胞系3t3以0.2ml/hr的速度从第一入口200通入，第二入口300关闭，样本液先充满目标液通道600，随后液体经微孔620渗出。此过程中，微孔620处逐渐捕获单个3t3细胞。随后，当所有微孔620均捕获有单细胞时，3t3细胞逐渐在微孔620处堆积，逐渐捕获目标细胞，捕获效果大于80％。
61.当为两级目标液通道时，分离效果大于90％。随后，将反向冲洗液以0.2ml/hr的速度从第三入口通入，可以快速回收3t3细胞，回收了可高达90％。
62.将小鼠全血以0.2ml/hr的速度从第一入口200通入，第二入口300关闭，样本液先充满目标液通道600，随后液体经微孔620渗出。且此过程中，99％以上血细胞从微柱阵列渗
出，仅极个别较大细胞捕获至微孔620。
63.与现有的微流控血液中稀有细胞分离过滤平台相比，本发明的分离、捕获率高达90％，回收率90％。可捕获单细胞以用于后续单细胞分析，相对于现有微流控过滤平台分离效率为72％，且无法实现单细胞的捕获及后端目标细胞在线处理分析。回收效率有了显著的提高，且能捕获单细胞进行后续的在线分析。
64.如图3所示，在本发明的一些实施例中，目标液通道600包括多层通道壁，通道壁之间设有次级目标液通道640，每层通道壁上均设有微孔620，次级目标液通道640上的微孔尺寸等于或小于上一级次级目标液通道640的微孔尺寸，或者小于或等于上一级的目标液通道600上的微孔尺寸。
65.具体的，当芯片只有一个次级目标液通道640通道的时候，次一级的次级目标液通道640小于或等于上一级的目标液通道600上的微孔尺寸。当包括多个次级目标液通道640，和目标液通道600靠近的第一个次级目标液通道640小于或等于目标液通道600上的微孔尺寸。而后续的次级目标液通道640的微孔尺寸则小于或等于前一级的次级目标液通道640。
66.目标液通道的通道壁可替换为2层或更多层，通道壁围成目标液通道，第二通道壁和第一通道壁围成次级目标液通道640，第n通道壁和第n
‑
1通道壁围成第n
‑
1个通道壁。
67.在目标细胞分离富集时，第二入口300和第三入口400关闭，样本液经第一入口200、第一管口110流入目标液通道600，样本液中废液液体及尺寸较小背景细胞等经微孔620流入侧液通道610，随后经第二管口120、出口500流出，完成对样本中的背景细胞进行高效去除，使得目标细胞被俘获于目标液通道600中，获初级目标细胞。
68.经通道壁上的微孔620流入下一个次级目标液通道640中，进一步捕获溢出目标细胞，直至废液经最后一层通道壁流入侧液通道610中，获得初级目标细胞。然后重复上述的冲洗和反冲洗，最终得到目标细胞。
69.这种采用多级通道过滤的方式，对含少数渗出目标细胞的废液进行进一步捕获。滤除废液，捕获上级目标液通道因压力过大渗出的目标细胞，提高捕获效率，进一步的，相邻的通道壁之间，下一层通道壁的微孔620孔径比上一层的微孔620孔径小，可以进一步提高捕获效率。
70.如图3结合图4、图5所示，在本发明的一些实施例中，通道壁由第一微柱阵列围成，第一微柱阵列由若干微柱630间隔排列组成，间隔设置的微柱630之间形成微孔620。
71.进一步的，微柱630为圆角方形微柱，圆角方形微柱的轴线与第一管口110和第二管口120连线垂直设置，圆角方形微柱的底边与第一管口110和第二管口120连线的夹角为45度。
72.两微柱630及间隙间宽长比较小，而低宽长比液体越容易经目标液通道进入侧液通道(依据流体在粗糙固体表面的浸润及滞后现象)，故该设计可避免较大宽长比(相对流体方向)造成液体难以渗出的问。圆角正方间距可根据目标细胞大小调整，正方形和圆角大小可根据加工精度调整。
73.在本发明的一些实施例中，目标液通道600内设有第二微柱阵列700，第二微柱阵列700由若干微柱630间隔排列组成。
74.目标液通道600中间位置设置间距相同、尺寸相同的第二微柱阵列700，用于防止目标液通道600的支撑作用。以及改变目标液通道600中流体方向，有助于废液从微柱630间
隙渗出。
75.在本发明的一些实施例中，目标液通道600及次级目标液通道640的管径由第一管口110到第二管口120方向逐渐减小。
76.目标液通道600的管径不断变小、管压不断增大，有助于增大微孔620渗出速度和反向冲洗液经间隙进入目标液通道600。具体的，目标液通道600由微柱阵列围成管径变小的管道。
77.在本发明的一些实施例中，侧液通道610的管径由第一管口110到第二管口120方向逐渐减小。同样的，侧液通道610的管径不断变小，有助于增大微孔620渗出速度和反向冲洗液经间隙进入目标液通道600。
78.在本发明的一些实施例中，第一管口110与目标液通道600的进口以及侧液通道610的前端为相切曲线连接；
79.第二管口120与目标液通道600的尾端以及侧液通道610的出口500为相切曲线连接。可减小液体流入的阻力，有助于废液渗出微柱间隙和反向冲洗液经间隙进入目标液通道600。
80.如图1所示，通道管100的数量为多个，通道管100并排设置，每个通道管100内均设有目标液通道600和侧液通道610。
81.在本实施例中，设置多个通道管100，通道管100之间并排设置，每个通道管100内均设有目标液通道600和侧液通道610，第一入口200、第二入口300、第三入口400、出口500和每个通道管100都连通，从而几何倍的提高分离效率。
82.在本发明的一些实施例中，通道管100由聚二甲基硅氧烷或有机玻璃制成。聚二甲基硅氧烷(pdms)是一种高分子有机硅化合物，通常被称为有机硅。具有光学透明，具有惰性，无毒，不易燃的特点。有机玻璃具有较好的透明性、化学稳定性，力学性能和耐候性，易染色，易加工，外观优美等优点。
83.采用上述的用于全血中稀有细胞分离、捕获和回收的装置能够高效快速的完成目标细胞的分离、捕获和回收，回收率高。
84.在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示意性实施例”、“示例”、“具体示例”或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
85.尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。